Artigo de método

Ensaio cinético de molécula única de alta produtividade paralela para decote de DNA específico do local

DOI:

10.3791/61236

⸱

6 de maio de 2020

 ,  , 
1Department of Biology, Emmanuel College, 2Department of Chemistry and Physics, Emmanuel College

Neste artigo

Resumo

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Um método altamente paralelo para medir o decote específico do DNA no nível da molécula única é descrito. Este protocolo demonstra a técnica utilizando a restrição endonuclease NdeI. O método pode ser facilmente modificado para estudar qualquer processo que resulte em decote de DNA específico do local.

Resumo

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O decote de DNA específico do local (SSDC) é um passo fundamental em muitos processos celulares, e é crucial para a edição de genes. Este trabalho descreve um ensaio cinético capaz de medir SSDC em muitas moléculas de DNA únicas simultaneamente. DNAs substratos amarrados por contas, cada um contendo uma única cópia da sequência de destino, são preparados em um canal de fluxo microfluido. Um ímã externo aplica uma força fraca às contas paramagnéticas. A integridade de até 1.000 DNAs individuais pode ser monitorada visualizando as microesferas sob imagens de campo escuro usando um objetivo de ampliação de campo largo e baixa. A injeção de uma restrição endonuclease, NdeI, inicia a reação do decote. A microscopia de vídeo é usada para registrar o momento exato de cada decote de DNA observando o quadro em que a conta associada se move para cima e para fora do plano focal do objetivo. A contagem de contas quadro a quadro quantifica a reação, e um ajuste exponencial determina a taxa de reação. Este método permite a coleta de dados quantitativos e estatisticamente significativos sobre reações SSDC de molécula única em um único experimento.

Introdução

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O decote de DNA específico do local (SSDC) é um passo fundamental em muitas transações genômicas. Por exemplo, os sistemas de modificação de restrição bacteriana (RM)1 e CRISPR2 protegem as células contra ataques por phages e plasmídeos, reconhecendo e cortando DNA estranho em sequências específicas. No tipo II RM, as endonucleases de restrição (REs) reconhecem sequências curtas de 4 a 8 pares de bases (bp) através de interações proteicas-nucleicas3. Endonucleases associados ao CRISPR, como o Cas9, ligam-se a locais via hibridização do local alvo com crRNAs vinculados aos endonucleases4. A criação de quebras duplas encalhadas específicas do local (DSBs) também são o primeiro passo em muitos eventos de recombinação de DNA5. Por exemplo, a diversidade de regiões de ligação de antígenos criadas pela recombinação V(D)J requer o reconhecimento e o decote de locais de destino específicos6. Alguns transposons são conhecidos por atingir sequências específicas de DNA, bem como7. Não surpreende que muitos núcleos específicos do site envolvidos nesses processos, como o Cas9, sejam um componente-chave das tecnologias de edição de genes8. Além disso, novos endonucleases específicos do local (ou seja, núcleos de dedo de zinco9 e TALENS10) também foram projetados para editar genomas.

Muitos métodos têm sido empregados para medir a cinética do decote específico do local dos ácidos nucleicos. Estes incluem análise de gel, fluorescência11,,12e métodos baseados em sequenciamento13. Um grande avanço foi alcançado com o amarramento de microesferas, que permite que DSBs em moléculas únicas de DNA sejam detectados pelo movimento de uma conta após a separação da vertente. Nestes métodos, diferentes tipos de forças são empregadas para garantir a separação da vertente e o movimento do pós-decote da conta. Em um caso, armadilhas ópticas têm sido usadas para medir o decote do DNA pelo EcoRV14. Nesses experimentos, a busca de alvos é o objetivo da investigação, com condições otimizadas para que a vinculação específica do local seja a etapa limitante da taxa. Uma desvantagem das armadilhas ópticas é que apenas um único DNA pode ser observado de cada vez. Além disso, uma força de puxar grande periódica deve ser aplicada para testar a separação da vertente.

Outra técnica usa uma combinação de fluxo e forças magnéticas fracas para puxar a conta de forma contínua15. Desta forma, a difusão limitada do decote por NdeI é medida. O método utilizado permite a medição simultânea de várias centenas de DNAs ao mesmo tempo, permitindo que a significância estatística seja alcançada em um único experimento. Experimentos baseados em pinças magnéticas também foram usados. Em um desses estudos, foi estudada uma integração retroviral por meio da inclusão de um DSB na inserção oligonucleotídeo16. A integração bem sucedida resultou na incorporação do DSB no DNA amarrado e na perda da conta anexada. Em estudo semelhante da restrição do tipo III dependente do ATP EcoPI, dezenas de DNAs foram observados em um único experimento17. Pinças magnéticas têm a vantagem de que a tensão, bem como o looping de DNA, podem ser controlados e monitorados durante a reação.

Apresentado aqui é um método de molécula única altamente paralelo para medir cinética SSDC, que se aproveita de melhorias recentes no tethering em larga escala de DNAs. Este método é uma melhoria e extensão dos métodos anteriores usados para medir a replicação de DNA18, comprimento do contorno do DNA19e decote por REs15. Nesta técnica, DNAs lineares contendo uma única cópia da sequência de reconhecimento são preparados com biotina em uma extremidade e digoxigenina na outra. A biotina liga streptavidin, que é covalentemente ligado a uma microesfera paramagnética. Os complexos de contas de DNA são injetados em um canal microfluido que foi funcionalizado com fragmentos da FAB anti-digoxigenina. O DNA então se liga aos pontos de fixação da superfície através da ligação da digoxigenina aos fragmentos da FAB adsorvidas. Forças magnéticas fracas aplicadas com um ímã permanente impedem que a conta grude não especificamente na superfície. As amostras podem ser injetadas rapidamente (<30 s) no canal de fluxo para ativar a reação do decote. O fluxo é desligado durante a coleta de dados. À medida que cada DNA é cortado, o tempo exato do decote pode ser determinado registrando o quadro em que a conta se move para cima e para fora do plano focal do objetivo, desaparecendo assim do registro de vídeo. Uma contagem quadro a quadro de contas remanescentes pode ser usada para quantificar o progresso da reação.

Apresentado abaixo está o protocolo completo, bem como exemplos de dados coletados usando o NdeI. Como exemplo de como a técnica pode ser aplicada, as taxas de decote para uma série de concentrações proteicas são medidas em duas concentrações diferentes de magnésio, um coator metálico essencial. Embora esta aplicação do protocolo use NdeI, o método pode ser adaptado para uso com qualquer nuclease específica do local, variando o design do substrato de DNA.

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Protocolo

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1. Fazer a célula de fluxo

  1. Lavando as tampas
    1. Coloque manchas em frascos de coloração e sonicate com etanol (EtOH), depois com 1 M KOH (por 30 min cada). Para evitar a precipitação KOH em EtOH, enxágue bem com ddH2O entre as lavagens.
    2. Repita tanto o EtOH quanto as etapas de lavagem KOH 1x para um número total de quatro lavagens (duas EtOH e duas KOH). Armazene tampas limpas em ddH2O em frascos de coloração.
  2. Corte os tubos de carga e saída (8 cm de comprimento) usando uma navalha limpa e insira em orifícios em uma lâmina de vidro limpa. Use PE-20 para entrada e PE-60 para tomada. Epóxi por 5 minutos para fixar tubos e cortar qualquer excesso de tubulação.
    NOTA: Slides de vidro medem 2'' x 3'' x 1 mm. Os furos são perfurados em pares com 15 mm de distância. Cada par forma cada extremidade de um único canal. O tubo com o ID menor é usado para a entrada, pois isso reduz o volume morto a montante e, portanto, o tempo de mistura necessário(Figura 1).
  3. Alinque-se e aplique fita dupla face pré-cortada com padrão de canal cortado sobre orifícios na lâmina de vidro. Suavize com fórceps plásticos para obter um bom selo.
    NOTA: A fita de dupla face usada neste experimento tem 120 μm de espessura, e os canais têm 2 mm de largura e 15 mm de comprimento. Os canais são cortados usando uma impressora de facas(Tabela de Materiais). É possível encaixar até quatro canais em um único coverlip. Consulte a Figura 1 para obter uma imagem da célula de fluxo.
  4. Depois de descascar o apoio, aplique uma mancha de cobertura limpa (seca com ar comprimido) sobre a fita e alise novamente com fórceps plásticos para uma boa vedação.
  5. Epóxi a borda fora da tampa para selar a célula de fluxo e deixá-la curar.

2. Preparação de DNA rotulado para amarração

  1. Em um tubo PCR, prepare 50 μL de mix de reação PCR contendo 0,02 U/μL de polimerase de DNA de alta fidelidade, 200 dNTPs μM, 0,5 μM primer para frente, 0,5 μM primer reverso e 250 ng de DNA vetorial M13mp18.
    NOTA: Aqui, a cartilha dianteira (biotin-CCAACTTAATCGCCTTGC) e o primer reverso (digoxigenina-TGACCATTAGATACATTTCGC) foram escolhidos para amplificar uma região de aproximadamente 1.000 bp de comprimento, abrangendo das posições 6338 a 107 no genoma circular do DNA M13mp18. Há um único local ndei no meio da região amplificada. A cartilha dianteira é 50 rotulada com digoxigenina, que liga a anti-digoxigenina na tampa. O primer reverso é 50 rotulado com biotina, que liga as contas revestidas de streptavidin.
  2. Insira o tubo PCR no termociclador e siga o ciclo conforme mostrado na Tabela 1.
  3. Purifique o produto PCR com um kit de limpeza PCR seguindo o protocolo do fabricante.
    NOTA: Utilizando o kit especificado na Tabela de Materiais,o rendimento típico do DNA é de ~2 μg.

3. Amarração de DNA e contas

  1. Prepare 10 mL de tampão A (1 M Tris-HCl [pH = 7,5], 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mg/mL β-Casein, 1 mg/mL Pluronic F-127). Degas em um desiccator de vácuo por pelo menos 1 h.
  2. Para funcionalizar a célula de fluxo, injete 25 μL de fragmentos FAB anti-digoxigenina (20 μg/mL) em PBS no canal de fluxo. Use pontas de carregamento de gel para caber na tubulação PE-60. Incubar em temperatura ambiente (RT) por 30 minutos.
  3. Após a incubação, lave o canal puxando 0,5 mL de buffer A através do canal usando uma seringa. Tome cuidado para não introduzir ar no canal.
  4. Após a funcionalização, monte a célula de fluxo em um microscópio invertido. Ligue o tubo de saída a uma bomba de seringa e coloque o tubo de entrada em um tubo de microcentrifuuagem contendo tampão A.
  5. Puxe manualmente pelo menos 0,5 mL de tampão A para lavar o sistema e preparar a bomba. Deixe a bomba funcionar a 10 μL/min por pelo menos 5 minutos para equilibrar o sistema.
  6. Para preparar as contas(Tabela de Materiais),vórtice a garrafa de caldo de contas e pipeta 1,6 μL das contas de caldo de 10 mg/mL em 50 μL de tampão A, depois vórtice.
  7. Usando um separador magnético, pipeta para fora do buffer e resuspend em 50 μL de tampão A, em seguida, vórtice.
  8. Repita o passo 3,7 2x para um total de três lavagens. Para a última lavagem, resuspense em 100 μL de tampão A e vórtice para alcançar uma concentração final de 160 μg/mL.
  9. Para complexar o DNA e as contas, primeiro prepare 480 μL de 0,5 pM rotulado substrato de DNA no buffer A. Em seguida, pipeta em 20 μL de 160 μg/mL suspensão de contas, certificando-se de vórtice das contas antes da pipetação. Coloque em um rotador por 3 minutos.
  10. Após 3 min, carregue imediatamente no canal a uma vazão de 10 μL/min por ~15 min ou até que seja observada a amarração de contas suficiente.
    NOTA: As contas não devem ser tão densamente embaladas que interagem entre si na superfície (ver seção de discussão).
  11. Para lavar o canal de todas as contas livres, troque o tubo de entrada para um tubo fresco de tampão A e flua a 50 μL/min por pelo menos 10 minutos ou até que não sejam observadas contas soltas.

4. Coleta e análise de dados

  1. Para se preparar para a coleta de dados, coloque o tubo de entrada em um tubo de microcentrifuuge contendo pelo menos 100 μL de NdeI (0,25-4,00 U/mL) no buffer A. Abaixe o ímã permanente sobre o canal de fluxo e posicione a fonte de luz fora do eixo para imagens de darkfield.
    NOTA: Dois ímãs de terras raras anulares, epóxidos juntos, são mantidos 8 mm acima da superfície ativa do canal de fluxo usando um post óptico cantilevered durante a coleta de dados. Uma lâmpada de pescoço de ganso é usada para o curso de luz fora do eixo.
  2. Use um microscópio comercial, câmera de vídeo e software de coleta de dados(Tabela de Materiais). No software, clique na guia "Exposição" e defina "Tempo de Exposição" a 10 ms. Clique em "Timelapse" tab e definir "Contagem de Imagens" para 600, "Duração" a 20 minutos, e "Intervalo" para 2 s. Clique em "Executar" para iniciar a coleta de dados.
  3. Em uma bomba de seringa, ajuste a taxa de fluxo para 150 μL/min e o volume de injeção para 80 μL.Pressione" Executar " a 1 min na coleta de dados. Após a injeção, desligue a bomba e feche a válvula para evitar o fluxo durante a coleta de dados.
  4. Uma vez coletados dados, o software de análise de imagens aberta(Tabela de Materiais). Sob a guia "Arquivo", escolha "Importar" | "Sequência de Imagens". Localize os arquivos de imagem no menu pop-up e clique em "Abrir".
  5. Defina o limiar escolhendo "Ajustar Theshold" sob o menu de retirada "Imagem". Use a barra de controle deslizante para definir o valor do limiar para identificar pontos brilhantes correspondentes às contas na imagem.
  6. Conte os pontos brilhantes em cada quadro clicando em "Analisar partículas" no menu pull-down "" Analyze". Clique em "OK", e escolha "Sim" para processar todas as imagens. Salve o arquivo de resultados.
    NOTA: Isso salvará um arquivo de dados que contém o número de contas em cada quadro de vídeo gravado.
  7. Abra o software de análise de dados(Tabela de Materiais) e importe o arquivo de resultados clicando em "Importar de Arquivo de Texto" no menu de retirada " "arquivo". Plote os dados da contagem de contas versus o tempo.
  8. Encaixe o número de contas vs. tempo clicando em "Curve Fit" no menu pull-down "Analyze". Escolha a equação "Expoente Natural" e clique em "Try Fit" | "OK".
    NOTA: Somente os dados registrados após a injeção da amostra devem ser incluídos na região de montagem. O parâmetro de ajuste no expoente da função de montagem será a taxa de decote.

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Resultados

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Utilizando esta técnica, as taxas de SSDC de NdeI foram medidas para uma gama de concentrações proteicas (0,25-4,00 U/mL) em duas concentrações diferentes de magnésio (2 mM e 4 mM). Cada uma dessas condições foi replicada pelo menos duas vezes, com algumas centenas a 1.000 DNAs amarrados por experimento. A Figura 2 descreve o design experimental. A Figura 3 mostra exemplos de detalhes de coleta e análise de dados. A Figura 4 ilustra...

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Discussão

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O protocolo pode ser usado para medir a cinética de qualquer sistema SSDC, desde que a separação da vertente seja observada durante o experimento. A detecção do decote é afetada pela observação do desprendimento da conta amarrada e, portanto, marca o instante da separação do fio. Todas as etapas anteriores ocorrem antes da detecção do decote; assim, apenas o tempo total de trânsito é registrado.

O deslizamento de cobertura da célula de fluxo é funcionalizado através de adsorção não específica ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência do MCB-1715317.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fragmentos de FAB anti-digoxigeninaEpoxy
câmera e softwareJenoptikGRYPHAX SUBRA
Fita dupla faceGrace BiolabsSA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered SalineCorning21-031-CV
etanol 95%VWR89370-082
primer direto: digoxigenina-CCAACTTAATCGCCTTGCIntegrated DNA Technologiesn/a
software de análise de imagemNational Institutes of HealthImageJ
NikonTE2000
faca impressoraSilhouette
M13mp18 DNANew England BiolabsN4040S
MyOne streptavidin beadsThermo Fisher Scientific65601
NdeI enzimaNew England BiolabsR0111S
kitde limpeza de PCRQiagen28104
pluronic F-127AnatraceP305
tubo de polietileno PE-20BD Intramedic427406
tubo de polietileno PE-60BD Intramedic427416
Q5 MastermixNew England BiolabsM0492S
ímã de terras raras 0.5" OD 0.25" IDImportações NacionaisNSN0814
ímã de terras raras 0,75 "OD 0,5" IDImportações nacionaisNSN0615
primer reverso: biotina-TGACCATTAGATACATTTCGCTecnologias integradas de DNAn / a
bomba de seringaKent ScientificGenie Plus
β -Caseína de leite bovinoSigma-AldrichC6905
Devcon 14250 de 5 minutos Roche Diagnostics 11214667001 software de análise de dados Vernier Inc. LP Microscópio invertido

Referências

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