Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medir rapidamente e semiquantitativamente as interações ligantes-receptores em trans em um sistema celular heterologous usando microscopia de fluorescência.

Abstract

As interações proteicas nas interfaces celulares ditam uma infinidade de desfechos biológicos que vão desde o desenvolvimento de tecidos e progressão do câncer até a formação e manutenção da sinapse. Muitas dessas interações fundamentais ocorrem em trans e são tipicamente induzidas por interações heterofílicas ou homofílicas entre células expressando pares de ligação ancorados na membrana. Elucidar como mutações relevantes para doenças interrompem essas interações proteicas fundamentais pode fornecer uma visão de uma miríade de campos de biologia celular. Muitos ensaios de interação proteína-proteína não normalmente desambiguam entre interações cis e trans, o que potencialmente leva a uma superestimação da extensão da ligação que está ocorrendo in vivo e envolve purificação intensiva de proteínas e/ou equipamentos de monitoramento especializados. Aqui, apresentamos um protocolo simples otimizado que permite a observação e quantificação de apenas interações trans sem a necessidade de purificações de proteínas longas ou equipamentos especializados. O ensaio de agregação celular HEK envolve a mistura de duas populações independentes de células HEK, cada uma expressando ligantes cognatos ligados à membrana. Após um curto período de incubação, as amostras são imagens e os agregados resultantes são quantificados.

Introduction

Interações sinápticas facilitadas por moléculas de adesão sináptica são fundamentais para o desenvolvimento, organização, especificação, manutenção e função das sinapses e da geração de redes neurais. A identificação dessas moléculas de adesão celular transsináptica está aumentando rapidamente; assim, é fundamentalmente importante identificar parceiros vinculantes e entender como essas novas moléculas de adesão interagem entre si. Além disso, o sequenciamento do genoma identificou mutações em muitas dessas moléculas de adesão que estão comumente ligadas a uma infinidade de distúrbios neurodesenvolvimentos, neuropsiquiátricos e de dependência¹. ....

Protocol

1. Cultura celular e transfecção

1. Faça mídia celular HEK com DMEM, 1x (Modificação do Meio da Águia) de Dulbecco com glicose de 4,5 g/L, l-glutamina & piruato de sódio e 10% FBS. Filtro estéril.
2. Ligantes e receptores adequados para agregação de pré-determinantes e receptores para ensaio de agregação.
   NOTA: Neurexin3α SS4+/- e um de seus ligantes conhecidos, LRRTM2, foram utilizados neste estudo. Ligantes e receptores de interesse foram expressos a partir de cDNAs em pcDNA3.1. Um conjunto Gibson foi usado para inserir Neurexin3α no pcDNA3.1¹². Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCCTACTC/

Results

A mutação A687T aumenta a ligação Neurexin3α SS4 ao LRRTM2⁷
Para investigar como as interações intercelulares de duas proteínas sinápticas conhecidas são afetadas pela introdução de uma mutação pontual encontrada em um paciente com deficiência intelectual e epilepsia, utilizamos o ensaio de agregação celular HEK acima(Figura 1). As células foram transfeinadas de acordo com a seção 1 e preparadas para imagens de acordo com as seções 1 e 2 do protocolo. As célula.......

Discussion

Dissecar as interações proteína-proteína que ocorrem em trans durante a adesão celular pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes aos processos celulares básicos, incluindo a formação, função e manutenção de sinapses durante a maturação e remodelação. As implicações das interações célula-célula se expandem além da neurobiologia e têm papéis mais amplos na transdução de sinais, migração celular e desenvolvimento de tecidos¹⁴. Aberrações na adesão celular podem interr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtubos descartáveis de 1,5 mL com tampas de pressão	VWR	89000-028	Incubação de população mista de células HEK
1000 mL Rápido— Unidade de filtro de fluxo, membrana aPES de 0,2 um	Thermo Fisher	567-0020	Esterilização de meios HEK
15 mL Tubos de centrífuga SpectraTube	Ward' s Science	470224-998	Colheita de células HEK
6 placas de cultura de tecidos estéreis VWR		100062-892	cultura de células HEK
Cloreto de cálcio	Sigma	223506-500G	Transfecção de fosfato de cálcio, ressuspensão de células HEK
Centrífuga - Sorvall Legend RT	Kendro Produtos de laboratório	75004377	Colheita de células HEK
Incubadora	de células CO2Thermo Scientific	HERACELL 150i	Incubação de células HEK durante o crescimento
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) com 4,5 g/L de glicose, L-glutamina e piruvato de sódio	Corning	10-013-CV	Manutenção de células HEK
Dulbecco' s Fosfato Tampolado com Solução Salina PBS (1X)	Gibco	14190-144	Passagem / colheita de células HEK
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma	ED-500G	Colheita de células HEK
Falcão Frascos de cultura ventilados, área de crescimento de 75 cm < sup>2< / sup>	Corning	9381M26	Cultivo de células HEK
Soro bovino fetal	Sigma	17L184	Manutenção
HEK293T células	ATCC		Sistema modelo
ImageJ	NIH	V: 2.0.0-rc-69 / 1.52p	Análise de imagem
Cloreto de magnésio hexahidratado	Sigma	M9272-500G	Ressuspensão de células HEK
Fosfato de sódio dibásico anidro	Fisher BioReagents	BP332-500	Transfecção de fosfato de cálcio
Tripsina 0,25% (1X) Solução	GE Healthcare Life Ciências	SH30042.01	Células HEK passageiras
Rotador			de tubos Incubação de população mista de células HEK
UltraClear Lâminas de microscópio. Branco fosco, carregado positivamente	Denville Scientific Inc.	M1021
Aquisição de imagem Microscópio de campo amplo	Zeiss	Axio Vert 200M	Aquisição de imagem