Artigo de método

Preparação de tecidos cardíacos projetados em forma de malha derivados de células iPS humanas para reparo de miocárdio in vivo

DOI:

10.3791/61246

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9 de junho de 2020

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1Clinical Translational Research Program, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 2Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 3Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Cell and Developmental Biology Center, National Institutes of Health, 4Kosair Charities Pediatric Heart Research Program, Cardiovascular Innovation Institute, University of Louisville, 5Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Louisville, 6Department of Cardiovascular Surgery, Mitsubishi Kyoto Hospital, 7Cincinnati Children's Heart Institute

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo gera tecidos cardíacos projetados em forma de malha contendo células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para permitir a investigação da terapia de implantação celular para doenças cardíacas.

Resumo

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O protocolo atual descreve métodos para gerar tecidos cardíacos escaláveis em forma de malha (ECTs) compostos por células cardiovasculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs), que são desenvolvidas para o objetivo do uso clínico. Cardiomiócitos derivados do HiPSC, células endoteliais e células mural vasculares são misturados com matriz de gel e, em seguida, despejados em um molde de tecido polidimetilsiloxano (PDMS) com postes retangulares e escalonados internos. No dia da cultura, 14 ECTs amadurecem em uma estrutura de malha de 1,5 cm x 1,5 cm com feixes de miofibra de 0,5 mm de diâmetro. Os cardiomiócitos alinham-se ao eixo longo de cada feixe e batem espontaneamente sincronizadamente. Essa abordagem pode ser dimensionada até uma malha ECT de malha maior (3,0 cm x 3,0 cm), preservando a maturação e a função do construto. Assim, os ECTs em forma de malha gerados a partir de células cardíacas derivadas do hiPSC podem ser viáveis para paradigmas de regeneração cardíaca.

Introdução

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Inúmeros estudos pré-clínicos e ensaios clínicos confirmaram a eficiência das terapias regenerativas cardíacas baseadas em células para corações falhando1,,2,3. Entre vários tipos de células, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) são fontes celulares promissoras em virtude de sua capacidade proliferativa, potencial para gerar várias linhagens cardiovasculares4,,5e alergenicidade. Além disso, as tecnologias de engenharia de tecidos permitiram transferir milhões de células para um coração danificado5,,6,,7,8.

Anteriormente, relatamos a geração de tecidos cardíacos tridimensionais (3D) de engenharia linear (ECTs) a partir de linhagens cardiovasculares derivadas do hiPSC usando um sistema de cultura comercialmente disponível para tecidos bioartíficos 3D5,,7. Verificou-se que a coexistência de células endoteliais vasculares e células mural com cardiomiócitos dentro da ECT facilitou a maturação estrutural e eletrofisiológica do tecido. Além disso, validamos o potencial terapêutico de hiPSC-ECTs implantados em um modelo de infarto do miocárdio de rato tolerante imunológico para melhorar a função cardíaca, regenerar o miocárdio e melhorar a angiogênese5. No entanto, os ECTs lineares construídos por este método foram cilindros de 1 mm por 10 mm e, portanto, não são adequados para a implantação em estudos pré-clínicos com animais maiores ou uso clínico.

Com base no uso bem sucedido de moldes de tecido para gerar formação de tecido poroso projetado usando míbios esqueléticos de rato e cardiomiócitos9,cardiomiócitos derivados do ESC humano10 e iPSCs11,desenvolvemos um protocolo para gerar moldes implantáveis derivados de hiPSC escaláveis usando moldes polidimetiloxano (PDMS). Avaliamos uma série de geometrias de moldes para determinar as características mais eficazes do molde. Os ECTs em forma de malha com múltiplos feixes e junções apresentaram excelentes características na viabilidade celular, função tecidual e escalabilidade em comparação com formatos de folha simples ou lineares que não tinham poros ou junções. Implantamos o ECT em forma de malha em um modelo de infarto do miocárdio de rato e confirmamos seus efeitos terapêuticos semelhantes aos ECTs cilíndricos implantados12. Aqui descrevemos o protocolo para gerar um ECT em forma de malha derivado do hiPSC.

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Protocolo

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1. Manutenção de hiPSCs e diferenciação cardiovascular

  1. Expandir e manter hiPSCs na matriz de membrana de porão de camada fina (fator de crescimento reduzido, diluição de 1:60) em meio condicionado extraído de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF-CM) com fator de crescimento do fibroblasto básico humano (hbFGF)4.
    NOTA: Usamos uma linha hiPSCs (4 fatores (Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc): 201B6). Adicione hbFGF na concentração apropriada para cada linha celular. Fragmento laminin-511 também pode ser usado para o revestimento do prato de cultura em vez de matriz de membrana porão. O meio comercialmente disponível projetado para a cultura livre de alimentador de hiPSCs pode ser usado como um substituto para o MEF-CM.
  2. Use versene (0,48 mM de ácido cinacético (EDTA) para desprender e dissociar células quando a confluência celular atingir 90\u2012100%.
    NOTA: Outros produtos disponíveis comercialmente para dissociação celular também podem ser usados.
  3. Células de placa a uma densidade de 10.000 células/mm2 em placas de cultura de células revestidas de matriz em MEF-CM com hbFGF e cultura por dois a três dias.
  4. Quando a cultura se tornar totalmente confluente, cubra as células com matriz (diluição de 1:60 com MEF-CM) por um dia.
  5. Substitua o MEF-CM pelo meio RPMI 1640 + B27. Adicione 100 ng/mL de Activin A e 100 ng/mL de Wnt3A ao meio por um dia.
    NOTA: Este é o dia 0 de diferenciação. Para aumentar a sinalização canônica Wnt, os inibidores GSK3β também podem ser usados em vez de Wnt3A.
  6. No primeiro dia de diferenciação, mude o médio para o novo RPMI 1640 + B27 com 10 ng/mL de BMP4 e 10 ng/mL de hbFGF. Células de cultura para dois (protocolo MC) ou quatro (protocolo CM+CE) dias sem alteração média5.
    NOTA: O protocolo CM+CE é otimizado para induzir simultaneamente cardiomiócitos (CMs) e células endoteliais vasculares (CES). O protocolo MC é otimizado para induzir preferencialmente células mural vascular (MCs).
  7. Protocolo CM+CE para indução de CMs e CEs (Figura 1A).
    1. Substitua o meio no dia 5 de diferenciação com RPMI 1640 + B27 complementado por 50 ng/mL de VEGF165.
    2. Mude o meio de cultura a cada 48 h até o dia 13\u201215 de diferenciação.
  8. Protocolo MC para a indução de células mural vascular (Figura 1B)
    1. Substitua o meio por RPMI1640 + 10% de soro bovino fetal (FBS) no dia 3 de diferenciação.
    2. Mude o meio de cultura a cada 48 h até o dia 13\u201215 de diferenciação.

2. Análise de colheita celular e linhagem no dia da diferenciação 13\u201215

  1. Lave as células com salina tamponada de fosfato livre Ca2+ e Mg2+ (PBS).
  2. Adicione a solução de dissociação celular (contendo proteases, colagens e DNAses) no prato de cultura celular para cobrir a placa. Incubar a placa por 5 min a 37 °C.
  3. Coletar e dissociar as células com meio de cultura usando uma pipeta após a incubação.
  4. Aloque 1 x 106 células para análise de linhagem com citometria de fluxo. Para eliminar células mortas, colorir as células com corante de viabilidade fixável.
  5. Manche as células com marcadores de superfície de membrana em PBS com 5% de FBS. Use as seguintes diluições de anticorpos na fluorescência ativado tampão de coloração celular (FACS): anti-PDGFRβ (1:100), cadherina anti-VE (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
  6. Para proteínas intracelulares, resuspenque e fixe as células com 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS.
  7. Colorir as células com isoforme anti-cardíaca de Troponina T (cTnT) em PBS com 5% de FBS e 0,75% saponina, em seguida, rotular o anticorpo cTnT com 488 mouse IgG1 (diluição 1:50).
  8. Resuspend as células manchadas em PBS com 5% de FBS e coloque-as em tubos FACS com coador celular.
  9. Analise a composição celular das células manchadas de cada protocolo de diferenciação com citometria de fluxo para facilitar a geração de suspensões celulares com distribuições de linhagem definidas.
    NOTA: Durante a realização deste procedimento, a suspensão restante da célula para ECTs é preservada em um refrigerador de 4 °C.

3. Fabricação de molde de tecido PDMS

  1. Lance uma camada de 0,5 mm de espessura e mais de 30 mm x 30 mm de polidimtilsiloxano (PDMS) misturando a solução prepolímero e transfronteiriça a uma proporção de 10:1 e depois curar a 80 °C por 3 h.
  2. Corte a folha PDMS e uni-la com adesivo de silicone para fabricar uma bandeja retangular de 21 mm x 20,5 mm com 7 mm de comprimento, 0,5 mm de largura e 2,5 mm de altura em uma posição retangular escalonada. O espaçamento horizontal do poste entre duas linhas de postes é de 2,5 mm (Figura 2B).
  3. Autoclave a bandeja a 120 °C por 20 min.
  4. Cubra a bandeja com 1% de poloxamer 407 na PBS por 1h. Enxágüe o poloxamer 407 e enxágue o molde com PBS suficientemente antes de usar.

4. Construção da ECT

  1. Após a análise da linhagem celular, combine as células dos protocolos CM+CE e MC para que a concentração final de MCs seja de 10 a 20% em um número celular total de seis milhões de células por construção5.
  2. Suspender seis milhões de células em meio de cultura ECT (meio essencial mínimo alfa suplementado com 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoetanol e 100 U/mL Penicilina-Streptomycina).
  3. Preparação da solução matricial
    1. Misture 133 μL de solução de colágeno de cauda de rato solúvel ácido (2 mg/mL, pH 3) com 17 μL de 10x mínimo essencial médio (MEM). Em seguida, misture a solução com 17 μL de tampão alcalino (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES e 0,1 M NaOH).
      NOTA: O colágeno deve ser mantido no gelo (4 °C). Verifique a cor do tampão e se o meio não ficar rosado quando todas as soluções estiverem misturadas, adicione tampão de álcali adicional ao meio. Os passos de mistura devem ser misturar colágeno I + 10x MEM e, em seguida, adicionar tampão alcalino. NÃO mude esta ordem. NÃO gere bolhas na mistura.
    2. Adicione 67 μL de matriz de membrana de porão à solução neutralizada de colágeno.
      NOTA: A solução mista deve ser mantida no gelo (4 °C).
  4. Centrifugar a suspensão celular preparada contendo seis milhões de células a 1.100 rpm (240 x g) por 5 min e resuspengar as células com 167 μL de DMEM de alta glicose + 20% FBS + 1% penicilina-estreptomicina (100x).
  5. Misture a suspensão celular e a solução matricial. O volume total da mistura celular/matriz para uma construção é de 400 μL.
    NOTA: A mistura celular/matriz deve ser não viscosa e uma cor rosada nesta etapa. Mantenha-o no gelo, pois o gel se solidificará à temperatura ambiente. A concentração final do colágeno tipo I é de 0,67 mg/mL.
  6. Despeje a mistura celular/matriz uniformemente sobre o poloxamer 407 revestido molde de tecido PDMS, que é colocado em uma placa de cultura de seis poços12.
    NOTA: Despeje a mistura cuidadosamente para evitar a geração de bolhas, a fim de evitar defeitos de enchimento no gel derramado.
  7. Incubar a mistura célula/matriz em uma incubadora padrão de CO2 (37C, 5 % DE CO2) por 60 min.
  8. Depois que o tecido for formado, mergulhe o molde de tecido com 4 mL de meio de cultura ECT.
    NOTA: Embora a célula/matriz esteja interligada em 60 minutos, a construção ainda é muito frágil. Adicione o meio suavemente para evitar danificá-lo.
  9. Cultura do tecido por 14 dias com mudança média todos os dias.
  10. Antes da implantação da ECT, remova o ECT dos postes de carregamento suavemente usando fórceps finos esterilizados.
    NOTA: As dimensões finais da ECT após a remoção do molde são inferiores ao molde original. Um molde de 2,1 cm x 2,05 cm gera um ECT liberado de aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm. Um molde maior de 3,9 cm x 4,05 cm gera um ECT de aproximadamente 3 cm x 3 cm. ECT descarregado mostra espancamento espontâneo intrínseco em meio de cultura quente. Embora inicialmente mantenha uma estrutura de malha, uma ECT descarregada encolhe e condensa ao longo do tempo. É possível segurar o tecido suavemente com fórceps finos e, em seguida, usar sutura de seda 7-0 para anexar o ECT ao epicárdio.

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Resultados

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A Figura 1A,B mostra os esquemas do protocolo CM+CE e MC. Depois de induzir CMs e ECs do protocolo CM+EC e MCs do protocolo MC, as células são misturadas ajustando as concentrações finais de MC para representar de 10 a 20% do total de células. O molde de tecido de 2 cm de largura é fabricado de acordo com o desenho de 0,5 mm de espessura da folha PDMS de espessura(Figura 2A,B). Seis milhões de células CM+EC+MC são combinadas com...

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Discussão

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Após a conclusão de nossa investigação de um formato linear, o ECT5derivado do hiPSC, adaptamos o protocolo para misturar CMs, CEs e MCs derivados de hiPSC para facilitar a expansão in vitro de células vasculares dentro dos ECTs e posterior acoplamento vascular in vivo entre ECTs e miocárdio receptor.

Para facilitar a geração de geometrias ECT de malha maiores e implantáveis, utilizamos folhas PDMS finas para projetar os moldes 3D com postes de carregamento dispostos em...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos financeiros ou científicos para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Programa de Pesquisa Cardíaca Pediátrica de Instituições de Caridade Kosair da Universidade de Louisville e pelo Projeto Organoide no RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. Os HiPSCs usados em nossos protocolos publicados foram fornecidos pelo Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MaterialsPlacas de
cultura de células estilo 100x20 mmFalcon / Thomas scientific9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50 / CSFalcon / Thomas scientific6902A01
Sylgard 184 Kit de elastômero de siliconeDow Corning761036
Reagents
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105
BMP4, recombinante (10µ g)R& DRSD-314-BP-010
Colágeno, solução tipo I de cauda de ratoSigmaC3867
Matrigel Corningreduzido por fator de crescimento 356231
VEGF humano (165) IS, grau premiumMiltenyi130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µ m filtrado (10% Solução em Água)Sondas MolecularesP-6866
Humano recombinante bFGFWAKO060-04543
Recombinante Humano/Mouse/Rato ActivinA (50µ g)R& D338-AC-050
rh Wnt-3a (10µ g)R& D5036-WN
Solução VerseneGibco15040066
Meio de cultura e suplementos
10x MEMInvitrogen11430
2 Mercaptro EtanolSIGMAM6250
B27 suplemento menos insulinaGibco
DMEM, alto teor de glicoseGibco11965084
Soro Fetal Bovino (500ml)Qualquer
Soro Fetal Bovino (500ml)Qualquer
L-GlutaminaGibco25030081
NaHCO3Qualquer
PBS 1xGibco10010-031
Penicilina-Estreptomicina (5000 U/mL)Gibco15070-063
RPMI1640 meio Gibco21870092
α MEMInvitrogen11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD BiosciencesBD / Fisher560380
anti-Troponina T, Isoforma Cardíaca Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab VisionFisherMS-295-P0
BD FACS Clean SoluçãoBD340345
BD FACSFlow Bainha FluidaBD342003
BD FACSSosolução de inseBD340346
EDTAQualquer
Tubo Falcon com Tampa de Filtro de Células (Caixa de 500)Corning352235
Soro Fetal Bovino (500ml)Qualquer
Kit de coloração de células mortas Aqua fixável LIVE/DEAD, para excitação de 405 nmSondas molecularesL34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD BiosciencesBD / Fisher558821
SaponinaSigma-Aldrich47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD BiosciencesBD / Fisher560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Kit de rotulagemSondas molecularesZ25002
A1895601

Referências

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  1. Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
  2. Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
  3. Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
  4. Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716(2014).
  5. Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933(2016).
  6. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
  7. Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
  8. Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
  9. Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
  10. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  11. Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963(2013).
  12. Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641(2017).
  13. Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).

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