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Artigo de método

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

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⸱

DOI:

10.3791/61258

⸱

8 de maio de 2020

 , 
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio nãoradioativo para medir a atividade de quinase de quinases (PNKs) em pequenos substratos de DNA e RNA.

Resumo

As quinases de polinucleotídeos (PNKs) são enzimas que catalisam a fosforilação da extremidade hidroxila de 5' do DNA e oligonucleotídeos de RNA. A atividade dos PNKs pode ser quantificada por meio de abordagens diretas ou indiretas. Apresentada aqui é uma abordagem direta e in vitro para medir a atividade PNK que se baseia em um substrato de oligonucleotídeo fluorescente e eletroforese de gel de poliacrilamida. Esta abordagem fornece a resolução dos produtos fosforilados, evitando o uso de substratos radiolabelados. O protocolo detalha como configurar a reação de fosforilação, preparar e executar grandes géis de poliacrilamida e quantificar os produtos de reação. A parte mais tecnicamente desafiadora deste ensaio é derramar e executar os grandes géis de poliacrilamida; assim, são fornecidos detalhes importantes para superar as dificuldades comuns. Este protocolo foi otimizado para o Grc3, um PNK que se reúne em um complexo de processamento de RNA pré-ribossômico obrigatório com seu parceiro de ligação, o nuclease Las1. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para medir a atividade de outras enzimas PNK. Além disso, este ensaio também pode ser modificado para determinar os efeitos de diferentes componentes da reação, como o triphosfato nucleosídeo, íons metálicos e oligonucleotídeos.

Introdução

As quinases de polinucleotídeos (PNK) desempenham papéis críticos em muitas vias de processamento de DNA e RNA, como reparação de DNA e conjunto ribossomo1,,2,,3,,4,,5. Essas enzimas fundamentais catalisam a transferência do monofosfato terminal (gama) de um triptofato nucleosídeo (NTP, na maioria das vezes ATP) para a extremidade hidroxila de 5' de um substrato nucleotídeo. Um dos PNKs mais bem caracterizados é o bacteriófago T4 PNK, que tem ampla especificidade de substrato e é fortemente utilizado por laboratórios de biologia molecular para incorporar rótulos de isótopos radioativos no 5 terminus de um substrato de DNA ou RNA6,7,,8,,9,10,,11,12. Outro exemplo de enzima PNK é o CLP1, que é encontrado em Eukarya, Eubacteria e Archaea, e está implicado em várias vias de processamento de RNA4,,13,,14,15.

Historicamente, a maioria dos ensaios que medem a atividade de quinase polinucleotídeo dependem da rotulagem de isótopos radioativos e da autoradiografia subsequente5,16. Nos últimos anos, uma série de ensaios adicionais foram desenvolvidos para medir a atividade de PNK, incluindo abordagens de molécula única, eletroforese de microchip, balizas moleculares, bem como ensaios colorimétricos e baseados em luminescência17,,18,,19,,20,21,22. Embora muitas dessas novas abordagens forneçam limites de detecção aprimorados e evitem o uso de radioatividade, cada uma tem desvantagens, como custo, dependência de resina imobilizada e limitações na escolha do substrato.

Grc3 é um polinucleotídeo quinase que desempenha um papel fundamental no processamento do RNA pré-ribossômico2,3,23. Grc3 forma um complexo obrigatório com o endoribonuclease Las1, que corta o Spacer Transcrito Interno 2 (ITS2) do RNA pré-ribossômico3. O decote do ITS2 por Las1 gera um produto que abriga um hidroxil de 5' que é posteriormente fosforilado pela quinase Grc33. Para investigar a especificidade do nucleotídeo e substrato do Grc3, foi necessário um ensaio barato que permitia o teste de diferentes substratos oligonucleotídeos. Por isso, foi desenvolvido um ensaio de fosforilação PNK usando substratos fluorescentes rotulados. Este ensaio foi usado com sucesso para determinar que o Grc3 pode utilizar qualquer NTP para atividade de transferência de fosforila, mas favorece o ATP24. Este protocolo adapta o ensaio original para medir a atividade PNK de Grc3 em uma mímica de RNA de seu substrato de RNA pré-ribossômico (SC-ITS2, Tabela 1). Um aspecto desafiador dessa abordagem baseada em fluorescência é a dependência de grandes géis de poliacrilamida para resolver efetivamente substratos fosforilados e não fosforilados. O protocolo fornece detalhes específicos sobre como derramar esses géis grandes e evitar armadilhas comuns ao fazê-lo.

Trabalhar com RNA requer cuidados particulares porque é fortemente suscetível à degradação. Existem medidas preventivas simples que se pode tomar para limitar a contaminação por ribonuclease. Uma estação de trabalho RNA separada que pode ser facilmente tratada com um agente de limpeza contendo inibidores de RNase é muitas vezes útil. É sempre necessário usar luvas ao manusear amostras e usar materiais de consumo certificados sem RNase. Como a água é outra fonte comum de contaminação, é melhor usar água recém-purificada e esterilizar todas as soluções usando um filtro de 0,22 μm.

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Protocolo

1. Preparação

  1. Prepare tampão e reagentes.
    1. Faça 1x Tampão de Reação combinando 20 μL de 1 M Tris (pH = 8,0), 40 μL de cloreto de sódio de 5 M, 2,5 μL de cloreto de magnésio de 2 M, 100 μL de 50% (v/v) glicerol e água livre de RNase para atingir um volume total de 1 mL.
    2. Faça corante de carregamento de ureia combinando 4,8 g de ureia, 200 μL de 1 M Tris (pH = 8,0), 20 μL de 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 mL de 1% (w/v) azul bromofenol e água livre de RNase para atingir um volume total de 10 mL.
    3. Faça 10x tampão TBE combinando 108 g de base Tris, 55 g de ácido bórico, 40 mL de 0,5 M EDTA (pH = 8,0) e água livre de RNase para atingir um volume total de 1 L.
    4. Faça 10% (w/v) persulfeto de amônio (APS). Pesar 0,5 g de APS e adicionar 3 mL de água sem RNase para dissolver o sólido. Adicione água sem RNase para atingir um volume total de 5 mL. Enrole o tubo em papel alumínio e armazene a solução a 4 °C.
      NOTA: O APS dissolvido decai ao longo do tempo. Substitua as ações de 10% da APS a cada 2 semanas.
  2. Obter enzima de quinase de polinucleotídeo.
    1. Adquira a enzima Las1-GRC3 PNK2 armazenada no Buffer de Reação (ver passo 1.1.1) em uma concentração de estoque de 20 μM. O buffer de armazenamento variará dependendo do PNK específico.
  3. Prepare o substrato nucleico de ácido.
    NOTA: Este protocolo monitora a fosforilação de 5'-fosforilação de um substrato RNA de 27 nts que abriga o local de processamento Las1-Grc3 (local C2) contido no saccharomyces cerevisiae pré-ribossômico interno transcrito spacer 2 (SC-ITS2; ver Tabela 1) 2,25,,26.2
    1. Sintetiza quimicamente um substrato de oligonucleotídeo de RNA contendo uma extremidade de hidroxe de 5'-hidroxilo, juntamente com um rótulo fluorescente de 3'. O fluoróforo será usado para a visualização do RNA. Certifique-se de que o fluorohore está posicionado na extremidade RNA que não é alvo de fosforilação. Como alternativa às fontes comerciais, a rotulagem fluorescente interna e terminal de substratos de RNA pode ser realizada internamente usando protocolos econômicos27.
    2. Remova o excesso de fluoróforo da reação de rotulagem de RNA por hplc-purificação28.
    3. Resuspend o RNA liofilizado usando água sem RNase para 500 nM.
    4. Armazene alíquotas de RNA a -80 °C para armazenamento a longo prazo ou -20 °C para armazenamento a curto prazo.
  4. Prepare a série de concentração da ATP.
    1. Faça um estoque de 20 mM de trabalho de ATP usando Reaction Buffer (ver passo 1.1.1). Use este estoque de trabalho para gerar quatro diluições seriais que variam de 20 mM-0,02 mM.
    2. Para fazer a primeira diluição da série de concentração, misture 1 μL do estoque de trabalho ATP de 20 mM com 9 μL de Reaction Buffer. Isso resultará em uma diluição de 10 vezes da ATP com uma concentração final de 2 mM.
    3. Use as ações atp de 2 mM geradas na etapa 1.4.2 para fazer a próxima diluição na série de concentração. Misture 1 μL das ações ATP de 2 mM com 9 μL de Reaction Buffer. Isso fará com que uma nova concentração de ações da ATP de 0,2 mM.
    4. Continue diluindo 1 μL das ações anteriores da ATP com 9 μL de Reaction Buffer para fazer as ações subsequentes da ATP na série de concentração.

2. Reação in vitro RNA quinasase

NOTA: Este ensaio pode ser usado para medir várias variáveis, como tempo, níveis de nucleotídeos ou concentração de enzimas. O objetivo deste experimento é avaliar a quantidade de RNA fosfoilado na presença de níveis constantes de LAS1-Grc3 complexos e diferentes níveis de ATP.

  1. Para cada reação de quinase RNA-enzima, combine 1 μL de 500 nM RNA substrato, 8,3 μL de 130 nM Las1-Grc3 e 0,2 μL de 5 mM EDTA.
    NOTA: Se realizar várias reações, prepare um estoque mestre da mistura RNA-enzima e alíquota de 9,5 μL desta mistura mestre a cada tubo de reação.
  2. Comece o ensaio.
    1. Coloque o bloco de calor em 37 °C.
    2. Nos intervalos de 10 s, misture 0,5 μL de um substock ATP da série de concentração ATP preparado na etapa 1.4 com uma mistura de enzima RNA e coloque a reação no bloco de calor de 37 °C.
      NOTA: Adicione 0,5 μL de Tampão de Reação em vez de ATP a uma mistura de enzima RNA para um controle negativo PNK. Use outro controle necessário também (ou seja, substrato de RNA na ausência de enzima PNK).
    3. Incubar as reações por 60 min a 37 °C.
      NOTA: O RNA fluorescente é sensível à luz; portanto, cubra as reações com papel alumínio.
    4. Usando a mesma ordem da etapa 2.2.2, sacie cada reação a cada 10 s, espiando a reação com 10 μL de corante de carregamento de ureia (ver passo 1.1.2).
      NOTA: Além da ureia de 4 M, a proteinase K pode ser adicionada nesta etapa para degradar a enzima. Siga as instruções fornecidas pelo fornecedor para determinar a quantidade de protease necessária e as condições de reação.
    5. Use as reações de quinase in vitro saciada de RNA imediatamente para análise a jusante (ver seção 3) ou armazene a -20 °C para ser analisada posteriormente.

3. Eletroforese de gel

  1. Prepare a solução de gel de ureia 15%/8 M.
    ATENÇÃO: A crilamida deve ser tratada com cuidado, porque é uma neurotoxina. Use sempre luvas, jaleco e óculos ao manuseá-lo.
    1. Em um béquer de vidro de 150 mL, combine 22,5 mL de pré-mistura de 40% de acrilamida/bis-acrilamida 29:1 solução, 6 mL de 10x TBE (ver passo 1.1.3), 28,8 g de ureia e água sem RNase para um volume total de 59 mL. Mexa suavemente a solução.
      NOTA: Dependendo do comprimento do substrato RNA, alterar a porcentagem de poliacrilamida pode melhorar a resolução entre RNA não fosforilado e fosforilado.
    2. Para dissolver a ureia, aqueça a solução no micro-ondas por 20 s, mexa o líquido e coloque imediatamente a solução de volta no micro-ondas por mais 20 s. Mexa suavemente a solução até que a ureia se dissolva completamente.
    3. Esfrie lentamente a solução colocando o béquer de vidro em um banho de água rasa contendo água fria. Certifique-se de que o nível de água fria ao redor do copo de vidro está acima do nível de solução dentro do béquer de vidro. Isso promoverá uma transferência de calor eficiente. Espere 5 min.
      NOTA: Não continue com este protocolo se o béquer de vidro se sentir quente; a água deve ficar abaixo de 25 °C. Se ainda estiver quente depois de 5 minutos, substitua a água no banho de água por água fria e espere mais 5 minutos.
    4. Filtrar e desgas a solução usando uma unidade de filtragem descartável de 0,22 μm para remover partículas e bolhas de ar microscópicas.
  2. Despeje o gel de desnaturação.
    1. Use sabão e água morna para limpar uma placa de vidro curta e longa projetada para géis com dimensões gerais de 31,0 cm x 38,5 cm. Pulverize cada placa de vidro com 95% de etanol e limpe o vidro para remover qualquer umidade.
      NOTA: Uma das duas placas pode ser siliconeizada para evitar danos ao gel ao separar o sanduíche de placa de vidro. No entanto, este passo não é necessário porque este protocolo foi projetado para visualizar o RNA sem separar as placas de vidro.
    2. Coloque a placa de vidro longa horizontalmente em cima de uma caixa para que ela seja elevada para fora do banco.
      ATENÇÃO: A crilamida é tóxica, portanto, a estação de derramamento de gel deve ser coberta por papel de banco que pode absorver qualquer líquido derramado e ser imediatamente colocado em um saco de lixo após a conclusão do procedimento.
    3. Coloque um espaçador limpo de 0,4 mm ao longo das longas bordas da placa de vidro longa.
    4. Coloque a placa de vidro curta em cima da placa longa e certifique-se de que as bordas da placa curta, placa longa e espaçadores estejam alinhados. Aperte cada lado usando três grampos metálicos espaçados uniformemente.
    5. Adicione 24 μL de TEMED à solução de ureia de 15% /8 M preparada na etapa 3.1 e misture a solução.
    6. Adicione 600 μL de 10% (w/v) APS (ver passo 1.1.4) à solução na etapa 3.2.5 e misture suavemente a solução.
    7. Despeje imediatamente a solução entre as placas de vidro.
      NOTA: Para evitar bolhas, toque no vidro à medida que a solução é derramada.
    8. Adicione cuidadosamente um pente limpo de 0,4 mm, 32 bem na parte superior do sanduíche de placa de vidro.
    9. Permita um mínimo de 30 min para que a acrilamida polimerize.
  3. Executar o gel de desnaturação.
    1. Coloque o bloco de calor em 75 °C.
    2. Retire os grampos metálicos segurando o sanduíche de placa de vidro e lave e seque completamente o sanduíche de placa de vidro.
    3. Coloque o sanduíche de placa de vidro no aparelho de gel com a placa curta voltada para dentro.
    4. Prepare o buffer de execução 0,5x TBE combinando 100 mL de 10x TBE com água sem 1,9 L RNase. Adicione 600 mL do buffer de execução às câmaras superior e inferior do aparelho de gel.
    5. Retire suavemente o pente e enxágue bem os poços usando uma seringa.
      NOTA: Esta etapa é fundamental para remover a ureia dos poços.
    6. Pré-executar o gel por 30 min a 50 W. Voltagem é aproximadamente 2.000 V.
      ATENÇÃO: Este aparelho de gel opera em alta potência e os usuários devem apresentar precaução.
    7. Enxágüe bem os poços usando uma seringa.
      NOTA: Este passo é fundamental até mesmo para o carregamento da amostra nos poços.
    8. O pulso gira as reações saciadas da etapa 2.2.5. Em seguida, incubar os tubos a 75 °C por 3 min. Repita o giro de pulso.
    9. Carga imediatamente de 10 μL de amostra por poço e execute o gel por 3 h a 50 W.
      NOTA: O RNA fluorescente é sensível à luz; portanto, cubra o aparelho de gel com papel alumínio.
  4. Imagem do gel de desnaturação.
    1. Desligue a fonte de alimentação e drene a câmara superior do aparelho de gel.
    2. Lave e seque o lado externo do sanduíche de placa de vidro usando água e sabão. Cubra o sanduíche de placa de vidro com papel alumínio enquanto transporta o gel.
    3. Coloque o sanduíche de placa de vidro no palco de um scanner laser capaz de detecção quantitativa e sensível de fluorescência.
      NOTA: Este gel é extremamente fino para a resolução máxima. Por essa razão, este protocolo é projetado para evitar as dificuldades de remover o gel do sanduíche de placa de vidro, visualizando diretamente o RNA fluorescentemente rotulado através das placas de vidro. O uso de placas de vidro de baixa fluorescência disponíveis comercialmente aumentará o sinal capturado melhorando a relação sinal-ruído.
    4. Defina os comprimentos de onda de excitação e emissão do scanner laser para o fluoróforo desejado.
      NOTA: Os comprimentos de onda de excitação e emissão ideais podem diferir para fluoroforos específicos. Para o fluorohore FAM, os comprimentos de onda de excitação e emissão são de 495 nm e 535 nm, respectivamente.
    5. Defina a área a ser visualizada no estágio do scanner a laser e imagine o gel de acordo com as instruções do fabricante(Figura 1).

4. Análise de imagem e quantificação de sinais

  1. Carregue a imagem de gel digital adquirida na etapa 3.4.5 em software de procesing de imagem (ver Tabela de Materiais).
  2. Usando o botão esquerdo do mouse, clique e arraste um retângulo para definir uma caixa de modelo para marcar os limites na imagem de gel digital que será usada para quantificar cada banda de RNA. A banda RNA vista na mistura de reação definida na ausência de enzima PNK é geralmente uma boa banda para gerar este modelo.
    NOTA: Para evitar viés causado pelo sinal de fundo, é fundamental que a área ao redor de cada banda de RNA que está sendo medida seja idêntica. Por essa razão, é melhor usar a mesma caixa de modelo para demarcar cada banda RNA.
  3. Abra o gerenciador de ROI em "Ferramentas" e marque a posição da caixa de modelo clicando em "Adicionar".
    NOTA: Programas de quantitação também podem desenhar caixas automaticamente seguindo o manual do usuário do software.
  4. Usando o botão esquerdo do mouse, clique e arraste a caixa de modelos para a próxima banda RNA e repita o passo 4.3. Continue este processo até que a posição de todas as bandas de RNA não fosforiladas e fosforiladas em cada reação tenham sido marcadas.
  5. Meça a densidade integrada dentro de cada caixa clicando em "Medida" no Gerenciador de ROI.
  6. Para calcular a quantidade relativa de RNA fosfoilado em uma reação, divida a densidade integrada da banda RNA fosforilada pela soma das densidades integradas das bandas de RNA não fosforiladas e fosfoiladas da mesma reação. Esta abordagem também pode ser aplicada para calcular a quantidade relativa de RNA não fosforylated.
  7. Para visualizar o acúmulo de produto RNA fosfoilado e o esgotamento correspondente do substrato de RNA não fosforilado em toda a série de concentração ATP, plote a quantidade relativa de RNA calculada na etapa 4.6 contra a concentração de ATP.

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Resultados

Um gel de desnaturamento representativo bem-sucedido de uma titulação de ATP com uma quantidade fixa do complexo Las1-Grc3 é mostrado na Figura 1. A adição de enzima resultou no decote de RNA mediado em Las1 do substrato RNA SC-ITS2, levando a um fragmento de RNA definido (5-OH C2 RNA). Após a adição de ATP, o fragmento de RNA C2 foi fosfoilado por Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Em géis desnaturação, o RNA fosfoilado migra mais rápido do que sua contraparte não fosfo...

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Discussão

Descrito é um ensaio para medir a atividade de quinase do Grc3 PNK em substratos de nucleotídeos fluorescentes. Este protocolo pode ser aplicado para caracterizar outras enzimas PNK adaptando o buffer de reação e o substrato de oligonucleotídeo. Por exemplo, o protocolo exige uma quantidade de traço de EDTA. A adição de EDTA é benéfica por duas razões: Primeiro, essa abordagem favorece o Grc3 ligado ao magnésio, impedindo que a enzima se ligue a vestígios de metais contaminantes na mistura. Em segundo lugar, uma pequena ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Andrew Sikkema e Andrea Kaminski pela leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramuros do Instituto Nacional de Saúde dos EUA; Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental dos EUA (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S) e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR; 146626 a M.C.P).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pente de 0,4 mm com 34 poçosBioRad1653848
espaçador de 0,4 mmBioRad1653812
0,5 M EDTA ph 8,0KD MedicalRGF-3130
1M Cloreto de MagnésioKD MedicalCAC-5290
1M Tris pH 8,0KD MedicalRGF-3360
40% Acrilamida/Bis Solução 29:1BioRad
5M cloreto de sódioKD MedicalRGF-3720
persulfato de amônio (APS)BioRad161-0700
ATPSigmaA2383-1G
ácido bóricoSigmaB0394
sal de sódio azul de bromofenolSigmaB5525-5G
de vidroThomas Scientific1188K51
Hoefer SQ3 SequenciadorHoeferN / A
Imagem J SoftwareN / AN / Ahttps://imagej.nih.gov/ij/< / a >
Oligonucleotídeos de RNA MarcadosIDTOrdem
Personalizada Pharmacia EPS 3500 Fonte de AlimentaçãoPharmaciaN / A
Filtro Steriflip 0. 22 umMillipore5FCP00525
TEMEDBioRad161-0800
base tris SigmaTRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gerador de imagens em gelGE HealthcareN/A
Ultra Pure DEPC WaterInvitrogen750023
Ultra Pure GlycerolInvitrogen19E1056865
ureiaFisher ChemicalU15-500
1610146 placas

Referências

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Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos
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