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Artigo de método

Tela genética avançada usando aequorin repórter de cálcio transgênico para identificar novos alvos na sinalização de cálcio

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DOI:

10.3791/61259

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1 de agosto de 2020

 ,  ,  , 
1National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India

Neste artigo

Resumo

Uma tela genética para a frente baseada na elevação de Ca2+ como leitura leva à identificação de componentes genéticos envolvidos em vias de sinalização dependentes de cálcio nas plantas.

Resumo

Telas genéticas avançadas têm sido ferramentas importantes na identificação imparcial de componentes genéticos envolvidos em várias vias biológicas. A base da tela é gerar uma população mutante que pode ser rastreada com um fenótipo de interesse. EMS (sulfonato de metano etílico) é um agente alquilante comumente usado para induzir mutação aleatória em uma tela genética clássica para a frente para identificar múltiplos genes envolvidos em qualquer processo. A elevação do cálcio citosomico (Ca2+) é uma via de sinalização inicial chave que é ativada após a percepção do estresse. No entanto, a identidade dos receptores, canais, bombas e transportadores do Ca2+ ainda é evasiva em muitos sistemas de estudo. Aequorin é uma proteína repórter de cálcio celular isolada da Aequorea victoria e expressa em Arabidopsis. Explorando isso, projetamos uma tela genética avançada na qual ems-mutagenizamos a aequorin transgênica. As sementes das plantas mutantes foram coletadas (M1) e a triagem para o fenótipo de interesse foi realizada na população segregadora (M2). Usando um protocolo de medição Ca2+ de alta produtividade de 96 poços, vários novos mutantes podem ser identificados que têm uma resposta de cálcio variada e são medidos em tempo real. Os mutantes com o fenótipo de interesse são resgatados e propagados até que uma população de plantas mutantes homozigosa seja obtida. Este protocolo fornece um método para encaminhar telas genéticas em fundo de repórter Ca2+ e identificar novos alvos regulamentados ca2+.

Introdução

Uma mudança na concentração de cálcio citosomico (Ca2+) na percepção de estímulo biótico ou abiótico é um evento de sinalização precoce bem estudado que ativa muitas vias de sinalização1,,2,,3,4. Uma célula em seu estado de repouso basal mantém uma concentração ca2+ mais baixa no citosol e sequesters em excesso ca2+ em várias organelas intracelulares e apoplasto extracelular levando a um gradiente Ca2+ íngreme5,6. Após a percepção do sinal, os níveis de Ca2+ aumentam no citosol devido a um influxo de Ca2+ de fontes extracelulares e/ou intracelulares e geram uma assinatura específica de cálcio7,,8,,9. As elevações ca2+ no citosol são ativadas por muitos estímulos, mas a especificidade é mantida por lojas distintas que liberam Ca2+,uma assinatura ca2+ exclusiva e proteínas sensoriais apropriadas10,,11.

O uso de agente alquilante, sulfonato de metano etílico (EMS) para mutagênese é uma ferramenta poderosa em telas genéticas avançadas clássicas para identificar múltiplos genes independentes envolvidos em um processo. EMS é um mutagênico químico que induz as transições C para T e G para A aleatoriamente em todo o genoma e produz uma mudança de 1 bp em cada 125 kb do genoma. A mutagênese EMS induzirá ≈1000 alterações de par de base única, inserção/exclusões (InDel) ou polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) por genoma12. Mutações induzidas pelo EMS são mutações de vários pontos com uma frequência de mutação que varia de 1/300 a 1/30000 por lócus. Isso reduz o número de plantas M1 necessárias para encontrar uma mutação em um determinado gene. Uma faixa populacional de sementes M1 de 2000-3000 é tipicamente usada para obter mutações de interesse em Arabidopsis thaliana13,14.

Os transgênicos de aequorin são plantas ecotipos Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) expressando p35S-apoaequorin (pMAQ2) no citosol15. Aequorina é uma proteína de ligação Ca2+ composta de apoproteína e um grupo protético composto por molécula de luciferina, coelenterazina. A ligação de Ca2+ à aequorina, que possui três sítios ca2+ de ligação EF-hands, resulta em coelenterazina sendo oxidada e ciclizada para dar o intermediário dioxetanona, seguida de uma alteração conformacional da proteína acompanhada pela liberação de dióxido de carbono e coelenteramida singlet-excited16. A coelenteramida tão produzida emite uma luz azul (λmax, 470 nm) que pode ser detectada pelo luminômetro17. As elevações extremamente rápidas de Ca2+ podem, portanto, ser medidas em tempo real e exploradas para telas genéticas rápidas. Este protocolo visa usar a especificidade da resposta ao cálcio para identificar novos atores-chave que estão envolvidos na assinatura do Ca2+. Para alcançar essa tarefa, usamos mutagênese EMS em aequorina transgênica e identificamos os SNPs associados à sinalização alterada de Ca2+. O protocolo identifica mutantes que não mostram elevações de Ca2+ reduzidas após a adição de estímulos. Esses mutantes podem então ser mapeados para identificar os genes responsáveis pela resposta ca2+. O método é aplicável a qualquer tipo de estímulo líquido em plantas que resulte em uma elevação de Ca2+. Uma vez que a elevação do Ca2+ é uma das primeiras respostas na via de sinalização de defesa vegetal, a identificação de componentes de resposta a montante pode fornecer candidatos para a engenharia genética para desenvolver plantas resistentes.

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Protocolo

1. Mutagênese EMS e coleção única de sementes baseadas em pedigree (1-3 meses)

  1. Pesar 150 mg de sementes (~7500) de aequorina para mutagênese EMS (sementes M0). Pese mais 150 mg de sementes para serem usadas como controle.
  2. Transfira as sementes para um tubo de 50 mL e adicione 25 mL de 0,2% EMS (v/v) (ATENÇÃO) (para tratamento) ou 25 mL de água autoclavada (para controle).
    NOTA: O sulfonato de metano é um agente químico para mutagenizar o material vegetal.
  3. Sele o tubo com parafilm e enrole-o em papel alumínio. Gire o tubo de ponta a ponta por 18 h em temperatura ambiente.
  4. Deixe as sementes se instalarem. Remova cuidadosamente a solução EMS e descarte em um recipiente de resíduos contendo 1 M NaOH em volumes iguais (o NaOH ajuda a neutralizar/inativar o EMS tornando-o seguro para descartar). Descarte o plástico usado em uma solução NaOH de 1 M.
    NOTA: Após 24 horas, descarte os descartes de acordo com as práticas laboratoriais de materiais perigosos.
  5. Lave bem as sementes mutagenizadas com 40 mL de água autoclavada pelo menos 8 vezes. Descarte o EMS contendo água em um recipiente de resíduos NaOH como mencionado acima.
  6. Para a lavagem final, adicione 40 mL de tiossulfito de sódio de 100 mM e enxágue 3 vezes para remover traços de EMS.
  7. Mergulhe as sementes em 40 mL de água autoclavada por ~1h para difundir o EMS das sementes e, em seguida, coloque-as no papel do filtro até secar completamente.
  8. Transfira as sementes para um tubo de microcentrífuga e estratifice as sementes a 4 °C em 40 mL de água autoclavada por 2-4 dias. Isso ajuda a quebrar a dormência das sementes e garante um crescimento homogêneo.
  9. Transfira tanto as sementes mutagenizadas (M0) quanto as sementes de controle para o solo (composição do solo: agropet: soilrite, 1:1) e transfira-as para salas de crescimento com um fotoperíodo escuro de 16h/8h, uma intensidade leve de 150 μmol∙m−2∙s−1 e ~70% de umidade relativa.
  10. Para determinar se a mutagênese foi bem sucedida, procure a redução da velocidade de germinação e o crescimento das mudas, e o setor de clorofila18 (Figura 1A). Compare as plantas mutagenizadas com as plantas de controle para identificar essas diferenças fisiológicas e de desenvolvimento.
    NOTA: Diferentes métodos podem ser usados para a colheita de sementes de plantas M1. Neste protocolo, usamos o método único de coleta de sementes baseado em pedigree. Cada planta M1 recebe um número único, começando de A1 a A3500.
  11. Manter plantas numeradas individualmente como linhas de plantas discretas(Figura 1B).
  12. Após a maturação, colhem sementes dessas plantas mutantes individuais e armazenam como linhas individuais de M1 (Figura 2). A partir da única coleção de sementes baseadas em pedigree, obtivemos cerca de 5000 linhas M1 das quais 3500 M1 foram rastreadas.

2. Triagem de alto rendimento para selecionar mutantes (8 meses)

  1. Identifique novos mutantes com base na resposta ca2+ a um estímulo selecionado. Aqui, usamos H2O2 como exemplo.
  2. Para identificar mutantes, tela a geração M2. Uma vez que os mutantes recessivos segregam-se em 1/8 de frequência na geração M2 sobre a mutagênese EMS14, a triagem de 8-12 M2-segregando plantas cobre uma linha M1 e identifica um mutante recessivo homozigoso (usando 12 mudas aumenta a probabilidade de encontrar um mutante). De cada linha Independente M1, teste 12 M2 mudas para resposta Ca2+ para H2O2 (12 M2 mudas por linha M1).
  3. Use um protocolo de esterilização de sementes de alto rendimento e protocolo de crescimento de plantas hidropônicas19. Coloque quase 12-15 M2 sementes por linha M1 em poços individuais de uma placa de cultura tecidual de 24 poços e estérilize usando gás cloro (40 mL de hipoclorito de sódio de 12% e ácido clorídrico, 3:1, v/v) em um desiccator por 4h em um capô de fumaça. Após o procedimento, abra o desiccador e deixe durante a noite para que o gás cloro evapore.
  4. Após a esterilização, leve as placas para fora e adicione mídia líquida de 1/2 MS (MS sem ágar) a poços individuais. Sele as placas com parafilm e estratifice as sementes por 2-4 dias a 4 °C e depois mova as sementes para uma câmara de crescimento com 10h de luz/ 14h de fotoperíodo escuro a 20-22 °C com 70% de umidade relativa.
  5. Uma vez que as mudas têm 8-12 dias de idade, coloque 12 M2 mudas de cada linha individualmente em uma placa de 96 poços de luminômetro. Para medir a resposta ca2+ para H2O2,use um leitor de placas de luminômetro.
  6. Após a transferência de mudas, adicione 150 μL de solução de coelentrazina de 5-10 μM (diluída em água autoclavada a partir de um estoque de 5 mM em metanol) (CUIDADO) em poços individuais em uma área escura/baixa luz e armazenar no escuro a 21 °C por 8h.
    NOTA: Coelentrazina é um grupo protético que se liga à apo-aequorina e a reconstitui à aequorina funcional. A coelentrazina é sensível à luz e, portanto, é armazenada em garrafas de cor escura, protegidas da luz.
  7. No dia seguinte, realize a tela mutante usando 10 mM H2O2 como estímulo e meça a resposta ca2+ subsequente.
  8. Para medição simultânea de 24 poços, crie um programa cinético automatizado que mede o fundo por 1 min, seguido de adição de estímulos (40 μL) e medição de 10 min, seguido de descarga total de aequorina (2 M CaCl2 em 150 μL 20% etanol) por 1-2 min.
    NOTA: É necessária uma descarga final para a aequorina total para quantificar o Ca2+ medido e como controle adicional para a aequorina funcional. A descarga final é de um curto prazo de 1-2 min e não causa morte significativa da planta. Alternativamente, se as plantas morrerem após a etapa de descarga, então re-tela a linha M1 específica e resgate sem descarga. Tais mutantes podem ser confirmados nas gerações M3 e M4 usando a etapa de descarga.
  9. Use um método de digitalização de formato de 24 poços que mede cada linha em intervalo de 7 s com tempo de integração de 300 ms por poço por ponto de medição. Use uma muda tipo selvagem como controle em cada linha para comparação e avaliação do mutante.
    NOTA: Uma única placa de 96 poços contendo mudas M2 cobrirá 8 linhas individuais M1 (8 M1*12= 96 M2) e poderá ser examinada em 2,5 h e a cada dia 32 linhas M1 seriam rastreadas, 640 M1 plantas por mês. Todo o procedimento de triagem após as plantas estarem prontas levaria cerca de 8 meses.
  10. Identificar mutantes com base na perda ou redução da resposta Ca2+ com H2O2. Resgate os mutantes selecionados através de um processo de lavagem à base de antibióticos. Lave a muda com solução de cefotaxime de 25 mg/L duas vezes e depois transfira para o meio de resgate que contém 25 mg/L cefotaxime em 1/2 MS ágar.
  11. Plante as placas a um fotoperíodo escuro de 10h/ 14h para obter uma planta mutante. A lavagem do cefotaxime ajuda a remover quaisquer microrganismos prejudiciais na muda. Uma vez que as mudas após a reconstituição são mantidas não seladas, minimize a contaminação ao transferir de volta para condição estéril.
  12. Transfira a planta mutante para o solo para obter a população homozigosa M3.

3. Análise de dados e identificação de mutantes (1-3 meses)

NOTA: As leituras fornecidas a partir do método acima estão em unidades de luz relativa (RLU).

  1. Para calcular [Ca2+] concentraçãode cite, use a seguinte equação de concentração20.
    pCa = 0,332588 (-log (L/Lmax)) + 5,5593
    Contagem de luminescência () e contagem total restante(max).
  2. Converta os valores pCa obtidos para [Ca2+] valoresde cite em μM multiplicando por 106. Em seguida, plote graficamente contra um controle de aequorina (Col-0 transgênico) para identificar mutantes putativos H2O2 para resposta Ca2+.
  3. Mudas de resgate mostrando uma perda ou redução da resposta ao aplicativo H2O2 resgatado.
  4. Após o amadurecimento, colhem sementes do mutante resgatado e re-tela para resposta a H2O2 em M3 mudas. Se todas as mudas de 12 M3 apresentarem uma resposta Ca2+ semelhante à planta mãe, considere a população como uma população mutante homozigosa M3. Se todas as 12 mudas não mostrarem tal resposta, então leve-as para a geração M4 e re-tela para obter população homoziga.
  5. Uma vez que uma linha de plantas homozigos tenha sido obtida, identifique o gene que leva ao fenótipo alterado usando sequenciamento de próxima geração.

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Resultados

A população ems foi examinada para elevação H2O2 induzida ca2+. Como discutido anteriormente, 12 mudas individuais M2 foram examinadas de cada linha M1. Na Figura 3,uma dessas linhas M1 é traçada com cada painel mostrando 12 mudas individuais M2. Uma aequorina tipo selvagem é usada como controle para comparar e avaliar a resposta mutante. Um mutante recessivo segrega na proporção de 1:7 (mutante: não mutante). Ao se...

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Discussão

A mutagênese EMS é uma ferramenta poderosa para gerar mutações na população. As telas genéticas avançadas clássicas usando EMS têm sido uma ferramenta eficaz para identificar novos genes por duas razões principais: em primeiro lugar, eles não exigem quaisquer suposições prévias sobre identidade genética e, em segundo lugar, eles não introduzem qualquer viés. Existem vários métodos para gerar uma triagem de populações como EMS, inserções de T-DNA, radiações etc. De todos os métodos, a mutagênese baseada em EMS tem poucas ...

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Divulgações

Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para declarar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Instituto Nacional de Pesquisa de Genomas Vegetais - Instalação Fitotrona pelo crescimento da planta, Bombaim Locale pela filmagem, e pelo Departamento de Biotecnologia- Consórcio ELibrary por fornecer acesso aos recursos eletrônicos. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Biotecnologia da Índia através do Programa de Núcleo de Pesquisa de Genomas Vegetais do Instituto Nacional de Plantas, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; e CSIR-Junior Research Fellowship (para D.M e S.M) e Departamento de Biotecnologia-Junior Research Fellowship (para R.P).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de cultura de tecidos de 24 poçosJetbiofil11024para o cultivo de mudas
96 poços cliniplate brancoThermo Scientific9502887para medições de luminômetro
Aequorin
AgropetLab Chem Indiapara crescimento de plantas
Cloreto de cálcioFisher Scientific12135para descarga solução
CoelenterazinaPJK55779-48-1grupo protético para aequorina
Eftilmetano sulfonatoSigma AldrichM0880-5Gpara mutagênese de sementes
EtanolReagente analítico1170para solução de descarga
Ácido clorídricoMerck Life Sciences1.93001.0521solução de esterilização
Peróxido de hidrogênioFisher Scientific15465como estímulo para elevação de cálcio
Ascensão de LuminoskanThermo Scientific5300172medição de luminescência de aequorina
Buffer MES HimediaRM1128-100Gcrescimento de plantas
Murashige e skoog mediaHimediaPT021-25Lcrescimento de plantas
Hidróxido de sódioFisher Scientific27805para neutralização EMS
Hipoclorito de sódioMerck Life Sciences1.93607.5021solução de esterilização
Tiossulfato de sódioFisher Scientific28005para lavagem de sementes na etapa 1.6
soilriteLab Chem Indiapara crescimento
de plantas Vasos quadradosLab Chem Indiapara crescimento de plantas
SacaroseSigma AldrichS0389crescimento de plantas
TaximAlkem7180720para resgate de mudas

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