Uma tela genética para a frente baseada na elevação de Ca2+ como leitura leva à identificação de componentes genéticos envolvidos em vias de sinalização dependentes de cálcio nas plantas.
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Artigo de método
Tela genética avançada usando aequorin repórter de cálcio transgênico para identificar novos alvos na sinalização de cálcio
Neste artigo
Resumo
Resumo
Telas genéticas avançadas têm sido ferramentas importantes na identificação imparcial de componentes genéticos envolvidos em várias vias biológicas. A base da tela é gerar uma população mutante que pode ser rastreada com um fenótipo de interesse. EMS (sulfonato de metano etílico) é um agente alquilante comumente usado para induzir mutação aleatória em uma tela genética clássica para a frente para identificar múltiplos genes envolvidos em qualquer processo. A elevação do cálcio citosomico (Ca2+) é uma via de sinalização inicial chave que é ativada após a percepção do estresse. No entanto, a identidade dos receptores, canais, bombas e transportadores do Ca2+ ainda é evasiva em muitos sistemas de estudo. Aequorin é uma proteína repórter de cálcio celular isolada da Aequorea victoria e expressa em Arabidopsis. Explorando isso, projetamos uma tela genética avançada na qual ems-mutagenizamos a aequorin transgênica. As sementes das plantas mutantes foram coletadas (M1) e a triagem para o fenótipo de interesse foi realizada na população segregadora (M2). Usando um protocolo de medição Ca2+ de alta produtividade de 96 poços, vários novos mutantes podem ser identificados que têm uma resposta de cálcio variada e são medidos em tempo real. Os mutantes com o fenótipo de interesse são resgatados e propagados até que uma população de plantas mutantes homozigosa seja obtida. Este protocolo fornece um método para encaminhar telas genéticas em fundo de repórter Ca2+ e identificar novos alvos regulamentados ca2+.
Introdução
Uma mudança na concentração de cálcio citosomico (Ca2+) na percepção de estímulo biótico ou abiótico é um evento de sinalização precoce bem estudado que ativa muitas vias de sinalização1,,2,,3,4. Uma célula em seu estado de repouso basal mantém uma concentração ca2+ mais baixa no citosol e sequesters em excesso ca2+ em várias organelas intracelulares e apoplasto extracelular levando a um gradiente Ca2+ íngreme5,6. Após a percepção do sinal,....
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Protocolo
1. Mutagênese EMS e coleção única de sementes baseadas em pedigree (1-3 meses)
- Pesar 150 mg de sementes (~7500) de aequorina para mutagênese EMS (sementes M0). Pese mais 150 mg de sementes para serem usadas como controle.
- Transfira as sementes para um tubo de 50 mL e adicione 25 mL de 0,2% EMS (v/v) (ATENÇÃO) (para tratamento) ou 25 mL de água autoclavada (para controle).
NOTA: O sulfonato de metano é um agente químico para mutagenizar o material vegetal. - Sele o tubo com parafilm e enrole-o em papel alumínio. Gire o tubo de ponta a ponta por 18 h em temperatura ambiente.
- Deixe as sementes se instalarem. Remova cuid....
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Resultados
A população ems foi examinada para elevação H2O2 induzida ca2+. Como discutido anteriormente, 12 mudas individuais M2 foram examinadas de cada linha M1. Na Figura 3,uma dessas linhas M1 é traçada com cada painel mostrando 12 mudas individuais M2. Uma aequorina tipo selvagem é usada como controle para comparar e avaliar a resposta mutante. Um mutante recessivo segrega na proporção de 1:7 (mutante: não mutante). Ao se.......
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Discussão
A mutagênese EMS é uma ferramenta poderosa para gerar mutações na população. As telas genéticas avançadas clássicas usando EMS têm sido uma ferramenta eficaz para identificar novos genes por duas razões principais: em primeiro lugar, eles não exigem quaisquer suposições prévias sobre identidade genética e, em segundo lugar, eles não introduzem qualquer viés. Existem vários métodos para gerar uma triagem de populações como EMS, inserções de T-DNA, radiações etc. De todos os métodos, a mutagênese baseada em EMS tem poucas .......
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Divulgações
Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para declarar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Instituto Nacional de Pesquisa de Genomas Vegetais - Instalação Fitotrona pelo crescimento da planta, Bombaim Locale pela filmagem, e pelo Departamento de Biotecnologia- Consórcio ELibrary por fornecer acesso aos recursos eletrônicos. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Biotecnologia da Índia através do Programa de Núcleo de Pesquisa de Genomas Vegetais do Instituto Nacional de Plantas, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; e CSIR-Junior Research Fellowship (para D.M e S.M) e Departamento de Biotecnologia-Junior Research Fellowship (para R.P).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de tecidos de 24 poços | Jetbiofil | 11024 | para o cultivo de mudas |
| 96 poços cliniplate branco | Thermo Scientific | 9502887 | para medições de luminômetro |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | para crescimento de plantas | |
| Cloreto de cálcio | Fisher Scientific | 12135 | para descarga solução |
| Coelenterazina | PJK | 55779-48-1 | grupo protético para aequorina |
| Eftilmetano sulfonato | Sigma Aldrich | M0880-5G | para mutagênese de sementes |
| Etanol | Reagente analítico | 1170 | para solução de descarga |
| Ácido clorídrico | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | solução de esterilização |
| Peróxido de hidrogênio | Fisher Scientific | 15465 | como estímulo para elevação de cálcio |
| Ascensão de Luminoskan | Thermo Scientific | 5300172 | medição de luminescência de aequorina |
| Buffer MES Himedia | RM1128-100G | crescimento de plantas | |
| Murashige e skoog media | Himedia | PT021-25L | crescimento de plantas |
| Hidróxido de sódio | Fisher Scientific | 27805 | para neutralização EMS |
| Hipoclorito de sódio | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | solução de esterilização |
| Tiossulfato de sódio | Fisher Scientific | 28005 | para lavagem de sementes na etapa 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | para crescimento | |
| de plantas Vasos quadrados | Lab Chem India | para crescimento de plantas | |
| Sacarose | Sigma Aldrich | S0389 | crescimento de plantas |
| Taxim | Alkem | 7180720 | para resgate de mudas |
Referências
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B.
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Reimpressões e permissões
