BDNF recombinante contendo uma sequência de Avi (BDNFAvi) é produzido em células HEK293 de forma econômica e é purificado por cromatografia de afinidade. BDNFavi é então diretamente mono-biotiningado com a enzima BirA em um tubo. BDNFavi e BDNFavi mono-biotiniladas mantêm sua atividade biológica quando comparadas com bdnf disponíveis comercialmente.
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Artigo de método
Um protocolo aprimorado para purificar e diretamente mono-biocombinado recombinante BDNF em um tubo para estudos de tráfico celular em neurônios
Neste artigo
Resumo
Resumo
BDNF recombinante contendo uma sequência de Avi (BDNFAvi) é produzido em células HEK293 e, em seguida, purificado por cromatografia de afinidade. Um protocolo reprodutível foi desenvolvido para mono-biotinilato BDNFAvi com a enzima BirA em um tubo. Nesta reação, o BDNFAvi mono-biotinilado mantém sua atividade biológica.
Neurotrophins são fatores de crescimento derivados da meta que desempenham um papel no desenvolvimento e manutenção neuronal. Eles requerem mecanismos de transporte rápido ao longo da via endocítica para permitir a sinalização de longa distância entre diferentes compartimentos neuronais. O desenvolvimento de ferramentas moleculares para estudar o tráfico de neurotrophins permitiu o rastreamento preciso dessas proteínas na célula usando o registro in vivo. Neste protocolo, desenvolvemos um procedimento otimizado e econômico para a produção de BDNF mono-biotinilado. Uma variante BDNF recombinante contendo uma sequência avi biotinítil (BDNFAvi) é produzida em células HEK293 na faixa de microgramas e, em seguida, purificada em um procedimento facilmente escalável usando cromatografia de afinidade. O BDNF purificado pode então ser homogêneo mono-biotiningado por uma reação in vitro direta com a enzima BirA em um tubo. A atividade biológica do BDNF mono-biotinilato (mbtBDNF) pode ser conjugada a extenuante conjugados a diferentes fluoroforos. BDNFAvi e mbtBDNF mantêm sua atividade biológica demonstrada através da detecção de alvos fosfoilados a jusante usando mancha ocidental e ativação do fator de transcrição CREB, respectivamente. Usando pontos streptavidin-quânticos, pudemos visualizar a internalização mbtBDNF concomitante com ativação do CREB, que foi detectado com um anticorpo específico fosfo-CREB. Além disso, mbtBDNF conjugado a pontos streptavidin-quânticos foi adequado para análise de transporte retrógrado em neurônios corticais cultivados em câmaras microfluidas. Assim, no tubo produzido mbtBDNF é uma ferramenta confiável para estudar a sinalização fisiológica e o tráfico de neurônios.
Introdução
Os neurônios são as unidades funcionais do sistema nervoso que possuem uma morfologia complexa e especializada que permite a comunicação sináptica e, portanto, a geração de comportamento coordenado e complexo em resposta a diversos estímulos. Projeções neuronais como dendritos e axônios são características estruturais críticas envolvidas na comunicação neuronal, e neurotrophins são atores cruciais na determinação de sua morfologia e função1. Neurotrophins são uma família de fatores de crescimento secretos que incluem NGF, NT-3, NT-4 e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)2. No sistema nervoso central (SNC), o BDN....
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Protocolo
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas da CONICYT (Comissão Nacional de Pesquisa Científica e Tecnológica do Chile). Os protocolos utilizados neste estudo foram aprovados pelas Comissões de Biossegurança e Bem-Estar Bioético e Animal da Pontificia Universidad Católica de Chile. Os experimentos envolvendo vertebrados foram aprovados pela Comissão de Bem-Estar Bioético e Animal da Pontifícia Universidad Católica de Chile.
NOTA: O protocolo a seguir foi projetado para purificar o BDNFAvi a partir de um volume total de 500 mL de meio condicionado produzido em células HEK293. A quantidade de meio condicionad....
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Resultados
O uso de um protocolo cromatográfico baseado em coluna permite o processamento de volumes significativos de mídia condicionada HEK293. Na Figura 1,são mostrados os resultados da purificação do BDNFAvi a partir de 500 mL de mídia condicionada. Eluções consecutivas de BDNFAvi do Ni-NTA produzem contas de diminuição das concentrações de BDNFAvi (Figura 1A). Após quatro eluções consecutivas (cada uma com duração de 15 min), a maioria do BDNF capturado pelas contas é.......
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Discussão
Neste artigo, descreve-se uma metodologia otimizada para a produção e purificação do mbtBDNF em um procedimento baseado em cromatografia de afinidade, a partir do trabalho de Sung e colaboradores17. As otimizações incluem o uso de um reagente de transfecção econômico (PEI) mantendo a eficiência de métodos de transfecção mais caros, como a lipofectamina. Essa otimização se traduz em uma redução significativa de custos no protocolo, permitindo a escalabilidade, mantendo o alto custo-benefício. O pro.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro da Fondecyt (1171137) (FCB), do Centro Basal de Excelência em Ciência e Tecnologia (AFB 170005) (FCB), do Millenium-Nucleus (FCB). P07/011-F) (FCB), o Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) e um prêmio da Uk Dementia Research Institute Foundation (GS). Este trabalho contou com o apoio da Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Torneira de 2 vias | BioRad | 7328102 | Componente do aparelho de cromatografia |
| 2-mercaptoetanol | Sigma | M6250 | Tampão de eluição BDNF |
| Acrilamida / Bisacrilamida | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE preparação de gel |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | Concentração de BDNF |
| Persulfato de amônio | Sigma | A9164 | SDS-PAGE preparação |
| de gel anti anticorpo B-III-Tubulina | Sigma | T8578 | Ensaios de Western blot para detecção de atividade biológica BDNF |
| anticorpo anti BDNF | Alomone | AGP-021 | Ensaios de Western blot para quantificação de BDNF |
| anticorpo anti BDNF | Alomone | ANT-010 | Ensaios de Western blot para quantificação de BDNF |
| Anti ERK anticorpo | Cell Sinalização | 9102 | Ensaios de Western blot para detecção de atividade biológica BDNF |
| anticorpo anti pCREB (S133) | Sinalização celular | 9198 | Ensaios de Western blot para detecção de atividade biológica BDNF |
| anticorpo anti pERK (T202, Y204) | Sinalização celular | 4370 | Ensaios de Western blot para detecção de atividade biológica BDNF |
| anticorpo anti pTrkB (Y515) | Abcam | ab109684 | Ensaios de Western blot para detecção de atividade biológica BDNF |
| Antibiótico / Antimicótico | Gibco | 15240-062 | Manutenção HEK293 |
| ATP | Sigma | A26209 | Tampão de monobiotinilação BDNF |
| B-27 Suplemento | Gibco | 17504-044 | Manutenção de neurônios |
| Bicine | Sigma | B3876 | Tampão de monobiotinilação BDNF |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzima para BDNF AviTag monobiotinilação |
| Soro Fetal Bovino | HyClone | HC. SH30396.02 | HEK293 manutenção |
| Albumina de soro bovino | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Componente de modificação do tampão BDNF, bloqueando tampão para western blot e imunofluorescência |
| D-Biotina | Sigma | B4639 | BDNF tampão de monobiotinilação |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Semeadura de neurônios |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 manutenção |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Componente do aparelho de cromatografia |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Detecção de proteínas por western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron e HEK293 manutenção |
| Glycerol | Merck | 104094 | Tampão de eluição BDNF, tampão de lise para ensaios de western blot |
| Centrífuga Hettich Rotina 46R Centrífuga | descontinuada | Hettich | usada para limpar o meio de detritos |
| Centrífuga Hettich Universal 32R Centrífuga | descontinuada | usada para centrifugação do concentrador de proteínas | |
| Soro de cavalo | Gibco | 16050-122 | Semeadura de neurônios |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Aquisição de imagem Western blot |
| Imidazol | Sigma | I55513 | Componente de modificação do buffer BDNF |
| KCl | Winkler | BM-1370 | Componente PBS |
| KH2PO4 | Componente Merck | 104873 | PBS |
| Laminina | Invitrogen | 23017-015 | Revestimento de cobertura para neurônios compartimentados |
| Adaptador de Tubulação Luer | BioRad | 7323245 | Componente de aparelho de cromatografia |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Detecção de proteínas por western blotting |
| Mg (CH3< / sub>COO) < sub>2< / sub> | Merck | 105819 | BDNF monobiotinilação tampão |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Reagente de montagem para ensaios de imunofluorescência |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Verificação de biotinilação |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | Componente de modificação do tampão BDNF |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | Componente PBS, componente de modificação do tampão BDNF |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | Componente de modificação do tampão BDNF |
| Meio neurobasal | Gibco | 21103-049 | Manutenção de neurônios |
| Ni-NTA Contas de agarose | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purificação |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscópio para imagem de fluorescência | |
| Membrana de nitrocelulose | BioRad | 1620115 | transferência de proteínas para western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Câmera digital CMOS | Hamamatsu | C13440-20CU | Câmera para imagem de imagem de epifluorescência |
| P8340 Coquetel de inibidor de protease | Sigma | P8340 | BDNF componente de modificação do tampão |
| Paraformaldeído | Merck | 104005 | Fixador para ensaios de imunofluorescência |
| Penicilina / estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Manutenção de neurônios |
| Poli-D-Lisina | Corning | DLW354210 | Revestimento da tampa para neurônios compartimentados |
| Poli-L-Lisina | Millipore | P2363 | Revestimento de cobertura para neurônios não compartimentados |
| Coluna de Cromatografia Poly-Prep BioRad | 7311550 | Componente do aparelho de cromatografia | |
| Polietilenoimina 25K Polysciences | Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfecção |
| Quantum Dots 655 conjugado de estreptavidina | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinilado BDNF Etiqueta AviTag para experimentos de células vivas e fixas |
| Saponina | Sigma | S4521 | Detergente para ensaios de imunofluorescência |
| Syldgard 184 base de elastômero de silicone | Poirot | 4019862 | Preparação da câmara microfluídica |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparação |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Componente tampão de lise |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Permeabilização celular em ensaios de imunofluorescência e western blot |
| Tripsina-EDTA 0,5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passando |
Referências
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology.
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Reimpressões e permissões
