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Artigo de método

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

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⸱

DOI:

10.3791/61270

⸱

20 de maio de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

Neste artigo

Aviso de errata

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Resumo

A injeção intravenosa de células cancerígenas é frequentemente usada em pesquisas de metástase, mas a carga tumoral metastática pode ser difícil de analisar. Aqui, demonstramos um modelo de injeção de veias traseiras de metástase e incluímos uma nova abordagem para analisar a carga do tumor pulmonar metastático resultante.

Resumo

A metástase, a principal causa de morbidade e mortalidade para a maioria dos pacientes com câncer, pode ser desafiadora para modelar preclinicamente em camundongos. Poucos modelos de metástase espontânea estão disponíveis. Assim, o modelo experimental de metástase envolvendo injeção de veias traseiras de linhas celulares adequadas é um pilar da pesquisa de metástase. Quando as células cancerígenas são injetadas na veia traseira lateral, o pulmão é seu local preferido de colonização. Uma limitação potencial dessa técnica é a quantificação precisa da carga do tumor pulmonar metastático. Enquanto alguns pesquisadores contam macrometastases de um tamanho pré-definido e/ou incluem micrometastases após a secção do tecido, outros determinam a área de lesões metastáticas em relação à área normal do tecido. Ambos os métodos de quantificação podem ser extremamente difíceis quando a carga metastática é alta. Aqui, demonstramos um modelo de injeção intravenosa de metástase pulmonar seguido de um método avançado para quantificar a carga do tumor metastático usando o software de análise de imagem. Esse processo permite a investigação de múltiplos parâmetros de ponto final, incluindo tamanho médio de metástase, número total de metástases e área total de metástase, para fornecer uma análise abrangente. Além disso, este método foi revisado por um conselho veterinário certificado pelo American College of Veterinary Pathologists (SEK) para garantir a precisão.

Introdução

Apesar de ser um processo altamente complexo e ineficiente1, a metástase é um contribuinte significativo para a morbidade e mortalidade de pacientes com câncer2. De fato, a maioria das mortes relacionadas ao câncer é atribuída à disseminação metastática da doença3,4. Para que as células tumorais se metástasizem com sucesso, elas devem se desprender do local primário, invadir através do estroma adjacente, intravasar em circulação sanguínea ou linfáticos, viajar para o leito capilar de um local secundário, extravasar no tecido secundário e proliferar ou crescer para formar lesões metastáticas5. O uso de modelos de camundongos tem sido fundamental para promover a compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis pela semeadura metastática e crescimento6,7. Aqui, focamos na metástase do câncer de mama, para a qual tanto modelos de camundongos geneticamente modificados quanto métodos de transplante são frequentemente utilizados – cada um com seu próprio conjunto de vantagens e limitações.

Modelos de tumor mamário geneticamente modificados fazem uso de promotores específicos da glândula mamária, incluindo MMTV-LTR (vírus tumoramático de camundongos longa repetição terminal) e WAP (Whey Acidic Protein), para impulsionar a expressão de transgenes no epitélio mamário8. Oncogenes incluindo antígeno T médio de polioma (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 e vírus símio 40 (SV40) foram expressos desta forma9,10,11,12,13, e embora esses modelos genéticos sejam úteis para estudar a iniciação e progressão do tumor primário, poucos prontamente metástases para órgãos distantes. Além disso, esses modelos genéticos de camundongos são muitas vezes mais tempo e custo proibitivos do que modelos de metástase espontânea ou experimental. Dada a limitação da maioria dos modelos de tumores mamários geneticamente modificados para estudar a metástase, as técnicas de transplante tornaram-se métodos atraentes para estudar esse processo complexo. Isso inclui ortotópica, veia traseira, intracardiac e injeção intracraniana de linhas celulares adequadas.

Embora várias linhas de células cancerígenas de mama prontamente metástases após a injeção ortotópica na almofada de gordura mamária14,15, a consistência e a reprodutibilidade da carga tumoral metastática podem ser um desafio, e a duração desses estudos pode ser na ordem de vários meses. Para avaliar a metástase pulmonar, em particular, a injeção intravenosa na veia traseira é muitas vezes um método mais reprodutível e eficaz com propagação metastática tipicamente ocorrendo dentro do período de algumas semanas. No entanto, uma vez que o modelo de injeção intravenosa contorna as etapas iniciais da cascata metastática, deve-se tomar cuidado na interpretação dos resultados desses estudos. Nesta demonstração, mostramos a injeção de veias traseiras de células tumorais mamárias, juntamente com um método de análise preciso e abrangente.

Embora a comunidade de pesquisa tenha feito progressos significativos na compreensão do complexo processo de metástase do câncer de mama, estima-se que mais de 150.000 mulheres tenham atualmente câncer de mama metastático16. Das pessoas com câncer de mama estágio IV, >36% das pacientes têm metástase pulmonar17; no entanto, o padrão específico do local e a incidência de metástases podem variar de acordo com o subtipo molecular18,19,20,21. Pacientes com metástases pulmonares associadas ao câncer de mama têm uma sobrevida mediana de apenas 21 meses, destacando a necessidade de identificar tratamentos eficazes e novos biomarcadores para esta doença17. O uso de modelos experimentais de metástase, incluindo a injeção intravenosa de células tumorais, continuará avançando nosso conhecimento sobre este importante desafio clínico. Quando combinadas com a patologia da imagem digital e o método de análise da carga de tumores pulmonares metastáticos descritos neste protocolo, as injeções de veias traseiras são uma ferramenta valiosa para a pesquisa de metástase do câncer de mama.

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Protocolo

O uso de animais seguiu as regulamentações do University Laboratory Animal Resources (ULAR) sob o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da OSU – protocolo aprovado 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).

1. Injeção de veias traseiras de células cancerígenas de mama

  1. Preparação de células e seringas para injeção
    1. Placa um número apropriado de células com base no número de camundongos e concentração celular a ser usado.
      NOTA: O número de células injetadas e o tempo para o desenvolvimento de metástases dependerão da linha celular utilizada e precisarão ser otimizadas. Nesta demonstração, 1 x 106 células MDA-MB-231 são injetadas por via intravenosa em camundongos NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) e lesões pulmonares macroscópicas são observadas no máximo 24 dias após a injeção. Para a linha de células tumores mamárias MVT1 murina17, 3 x 106 células são injetadas em camundongos FVB/N imuno-competentes com numerosas metástases pulmonares observadas por 14 dias22,23.
    2. Aspirar mídia e enxaguar placas celulares com 1x PBS. Células de trypsinize em volume mínimo, adicione o volume apropriado de mídia e conte células usando um hematócito ou outro método preferido. O azul trypan (0,4%) ou outros corantes de células vivas/mortas podem ser usados para determinar a contagem de células viáveis.
    3. Células de pelota girando a 180 x g por 5 min.
    4. Resuspenque o número apropriado de células em 1x PBS estéril, de tal forma que um volume de 100 μL seja injetado por mouse. Mantenha a suspensão celular no gelo para manter a viabilidade.
    5. Antes da injeção, ressuspendam completamente as células com uma pipeta de 200 μL ou 1 mL para evitar a aglomeração. Desenhe 100 μL em uma seringa de insulina de 28 G (ver Tabela de Materiais).
    6. Elimine quaisquer bolhas de ar mantendo a seringa vertical, tocando na seringa e ajustando lentamente o êmbolo. A injeção de bolhas de ar na veia pode causar uma embolia de ar/gás que pode ser fatal.
  2. Injeção lateral da veia traseira
    NOTA: Para ensaios experimentais de metástase do câncer de mama, as injeções são realizadas em camundongos fêmeas de > 6 semanas de idade.
    1. Manuseie o mouse pela cauda e deslize animal em um tubo ranhuted/dispositivo de contenção de um tamanho apropriado (consulte a Tabela de Materiais para o dispositivo de contenção usado).
    2. Insira a porção do plugue do dispositivo de contenção e posicione o mouse de lado, de forma que sua veia traseira lateral seja fácil de visualizar. O camundongo tem uma artéria ventral alinhada com a genitália, uma veia dorsal e duas veias caudais laterais.
    3. Limpe a superfície da cauda do rato com um lenço asséptico. Segure a cauda entre o dedo indicador e o polegar com a mão não dominante e aplique uma leve tensão.
    4. Começando pela porção distal da cauda, insira a agulha paralela à veia com o bisel acabar.
    5. Se permitido, recapitula a agulha cuidadosamente e dobre para um ângulo de 20-30°. Uma abordagem individual ou dispositivo de recapeamento de agulhas é altamente recomendado.
      NOTA: Não é necessário aspirar, pois isso pode causar o colapso da veia. No entanto, um pequeno flash de sangue pode ser visto quando colocado pela primeira vez. A agulha avançará suavemente na veia com a colocação adequada.
    6. Distribua lentamente o volume completo na veia. Não deve haver resistência quando o êmbolo é empurrado.
    7. Se houver alguma resistência, remova prontamente a agulha da seringa. Se necessário, reinsira a agulha (idealmente não mais do que 3 tentativas) movendo-se em direção à extremidade proximal da cauda ou veia lateral oposta.
    8. Um pequeno volume de sangue provavelmente será deslocado após a injeção. Aplique pressão suave com gaze estéril e limpe com limpeza asséptica.
    9. Descarte prontamente a seringa no recipiente afiado apropriado.
    10. Devolva o mouse a uma gaiola limpa e ventilada e monitore por sinais de angústia.
    11. Monitore camundongos 2-3x/semanalmente para sinais de formação de metástase (respiração trabalhada, postura curvada, perda de peso) e sofrimento geral. O tempo para o desenvolvimento da metástase dependerá da linha celular e da tensão do rato.
    12. Se usar um dispositivo de imagem animal in vivo vivo, os ratos de imagem imediatamente após a injeção da veia traseira para confirmar a injeção bem sucedida de células e obter dados "zero" do tempo (detalhes específicos sobre imagens de bioluminescência in vivo não estão incluídos aqui, mas são descritos por Yang et al.24).

2. Fixação do tecido pulmonar e análise da carga do tumor pulmonar metastático

  1. Inflação do tecido pulmonar para manter o formato estrutural dos pulmões para histopatologia
    1. Após os procedimentos aprovados de eutanásia (por exemplo, dióxido de carbono a 30 - 70% de deslocamento do volume da câmara/min) são seguidos, proteja a carcaça do rato em uma placa de dissecação com pinos. Pulverizar ou aplicar 70% de etanol para manter a pele do rato fora do caminho durante a dissecação.
      NOTA: Asfixia por dióxido de carbono pode causar hemorragia pulmonar como lesão de fundo esperada, especialmente em taxas de fluxo mais lentas.
    2. Abra o tórax com uma incisão midline, estenda a incisão cranially/caudally através do peritônio, e corte o diafragma agarrando o processo xifoide.
    3. Usando um conjunto separado de tesouras para não entorpecer as lâminas, corte as costelas ao longo de cada lado do esterno e remova cuidadosamente a caixa torácica deixando espaço para os pulmões se expandirem.
    4. Isole a traqueia removendo glândulas salivares submandibulares e musculatura infra-ióide. Colocar pinos em ambos os lados da traqueia pode evitar movimentos indesejados durante a inserção da agulha.
    5. Encha uma seringa de 26 G com 2-3 mL de formalina tamponada neutra de 10% e insira na traqueia.
    6. Injete lentamente formalina e observe que os pulmões se expandam (geralmente requer ~1,5 mL de formalina).
    7. Uma vez que a formalina começa a vazar dos pulmões (evite a inflação), belisque a traqueia com um par de fórceps, remova a agulha da seringa e desprende todo o aparelho respiratório. Coloque pulmões, coração, etc. diretamente em formalina, pois o corte adicional de tecido pode ser feito após a fixação.
    8. Processamento completo, incorporação, secção de tecido e hematoxilina e eosina (H&E) de coloração usando métodos padrão.
  2. Análise da carga do tumor pulmonar metastático
    1. Escaneie seções pulmonares manchadas de H&E em um scanner de slides de alta resolução a 40x de ampliação (Figura 3).
    2. Importar imagens em software de análise de imagens (por exemplo, Análise de Imagem visiopharm) para quantificação de metástases pulmonares.
      NOTA: Recomendamos que novos usuários obtenham treinamento no local ou online para usar o software de análise de imagens. Inúmeros webinars também estão disponíveis através da página comercial.
    3. Selecione o Aplicativo de Metástase pulmonar do Visiopharm 10118 H&E Na biblioteca de aplicativos do software.
      NOTA: O objetivo deste aplicativo é rotular e quantificar a metástase pulmonar em slides manchados de H&E. Como parte do Aplicativo de Metástase Pulmonar 10118, a primeira etapa de processamento de imagem segmenta o tecido pulmonar com o Aplicativo de Detecção de Tecidos. A segunda etapa de processamento de imagem usa o Aplicativo de Detecção de Metástase que identifica as metástases dentro do tecido pulmonar. Metástases são identificadas via forma juntamente com regiões que são muito desacompusadas, muito vermelhas ou muito esparsas para serem identificadas como metástases.
    4. Ajuste os parâmetros que definem a forma e a escassez para melhor se encaixar em imagens representativas. Áreas segmentadas de metástases tumorais e tecido pulmonar normal podem ser exibidas usando diferentes rótulos de cor para cada tipo de tecido.
      NOTA: No caso de o aplicativo não conseguir separar com precisão metástases do tecido pulmonar normal, um aplicativo personalizado usando o programa Visiopharm Decision Forest pode precisar ser escrito como foi feito para os experimentos (ver Figura 2 e Figura 3). Os detalhes para escrever um algoritmo personalizado seguem abaixo. Caso contrário, prossiga para a etapa 2.2.9.
    5. Abra o programa Floresta de Decisão, que funciona treinando várias classes [ou seja, tecido pulmonar (não neoplásico), metástases, glóbulos vermelhos, epitélio e/ou espaço branco] em uma imagem desejada. Na Figura 2, as metástases tumorais são azuis, o tecido normal é verde, e o epitélio bronquiolar é amarelo. Além disso, os glóbulos vermelhos estão em espaços vermelhos e de ar em rosa.
    6. Siga a série solicitada de perguntas sim ou não para treinar adequadamente cada Classe para uma imagem. A precisão do algoritmo determinará o número de perguntas sim/não. Para a análise, o algoritmo/aplicativo personalizado foi escrito com precisão definida para 50 (faixa 0-100).
    7. Ajuste recursos para cada classe aplicando filtros para afiar, desfocar, classificar por forma, etc. para melhorar a precisão do algoritmo/App. Visiopharm visualiza cada Classe através de uma ou várias lentes conhecidas como Recursos. As características mudam a forma como a Classe vê a imagem para trazer certas cores ou intensidades.
      NOTA: Para o algoritmo personalizado, metástases medindo 8500 μm2 ou mais são rotuladas e medidas como metástases. Isso explica a variância de tamanho e metástases muito pequenas para detectar. Pequenas áreas desalinhadas e pequenas áreas metastáticas abaixo de 8500 μm2 foram incluídas na quantificação normal do tecido.
    8. Salve as configurações modificadas do aplicativo ou do algoritmo personalizado e, em seguida, aplique o algoritmo/aplicativo a um conjunto inteiro ou série de tecidos manchados de H&E.
    9. Por fim, exporte todas as variáveis de produção, que incluem as listadas na Tabela 1. A área em mícrons ao quadrado (μm2) pode ser quantificada para cada tipo de tecido e as porcentagens são derivadas da área total do tecido líquido da amostra (ou seja, tecido total menos espaço aéreo).
    10. Ao criar um algoritmo personalizado, revise as marcações teciduais em consulta com um conselho de patologista veterinário certificado pelo American College of Veterinary Pathologists para garantir medidas precisas e diferenciar entre os tipos de tecidos.

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Resultados

Se usar células não rotuladas para injeção de veias traseiras, pode ser difícil confirmar a colonização pulmonar até (1) o tempo de necropsia se macrometastases podem ser observadas ou (2) após análise histológica se existem metástases microscópicas. Com extensa carga de tumores pulmonares metastáticos, os camundongos terão a respiração trabalhada. Como em qualquer estudo de tumor, os camundongos devem ser cuidadosamente monitorados durante toda a duração do estudo. O uso de células rotuladas é uma maneira fácil de confi...

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Discussão

À medida que os pesquisadores continuam a usar a injeção intravenosa de células tumorais como modelo experimental para metástase, faltam práticas padrão para analisar a carga tumoral metastática resultante. Em alguns casos, diferenças significativas na carga tumoral metastática após a manipulação de linhas celulares específicas e/ou uso de compostos químicos podem ser observadas macroscopicamente. No entanto, em outros casos, diferenças sutis na semeadura metastática e no crescimento podem ser negligenciadas ou mal inter...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os dados representativos foram financiados por meio do Instituto Nacional de Câncer (K22CA218549 para S.T.S). Além de sua ajuda no desenvolvimento do método de análise abrangente aqui relatado, agradecemos ao Centro Abrangente de Câncer da Universidade estadual de Ohio e ao Recurso Compartilhado de Fenotipagem de Camundongos (Director – Krista La Perle, DVM, PhD) pelos serviços de histologia e imunohistoquímica e pelo Núcleo de Imagem de Patologia para desenvolvimento e análise de algoritmos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
almofadas de preparação de álcoolFisher Scientific22-363-750para limpar a cauda antes da injeção
dissecaçãoFisher Scientific08-951-5para dissecção de camundongos e inflação do tecido pulmonar
DMEM com L-Glutamina, 4,5g/L de Glicose e Piruvato de SódioFisher ScientificMT10013CVbase de meios de cultura celular para linhas celulares MDA-MB-231 e MVT1
Solução de sal tamponada com fosfato de Dulbecco 1xFisher ScientificMT21030CVusado para ressuspender células tumorais para injeção
de etanol (solução a 70%)OSUusado para minimizar a pele do camundongo durante a dissecção; use cuidado -
corante azulde Evan Millipore SigmaE2129utilizado a 1 % em PBS estéril para a prática com o método de injecção na veia da cauda; use cuidado - reagente
perigoso Soro bovino fetalMillipore SigmaF4135aditivo de meios de cultura de células; usado a 10% em
pinçasFisher Scientific10-270para dissecção e insuflação do tecido pulmonar
Camundongos FVB/NJO Laboratório Jackson001800cepa de camundongo singênico para células MVT1
hemacitômetro (Bright-Line)Millipore SigmaZ359629para uso em cultura de células para obter contagens de células
seringa de insulina (28 G)Fisher Scientific14-829-1Bpara injeções na veia da cauda (BD 329424)
Células MDA-MB-231celular de câncer de mama humanoATCC
Célulasde tumor mamário de camundongo
agulhas (26 G)Fisher Scientific14-826-15usado para inflar o mouse pulmões
formalina tamponada neutra (10%)Fisher Scientific245685usado como fixador de tecido e para inflar tecido pulmonar; tenha cuidado - NOD de reagente perigoso
. Camundongos Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)O Laboratório Jackson005557mantido pela OSUCCC Target Validation Recurso Compartilhado
Penicilina Estreptomicina 100xThermoFisher15140163gaze
estérilFisher ScientificNC9379092para aplicar pressão na cauda do camundongo se ocorrer sangramento
seringa (5 mL)Fisher Scientific14-955-458usado para inflar o
contenor da veia da caudaBraintree Scientific, Inc.TV-150 STDusado para conter o camundongo para injeções na veia da cauda
Azul de tripano (0,4%)ThermoFisher15250061usado em cultura de células para avaliar a viabilidade
Tripsina-EDTA 0,25ThermoFisher25200-114usado em cultura de células para separar células tumorais da placa
forte inflamável DMEM Linha MVT1 células do tecido pulmonar do camundongo %

Referências

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

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Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

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Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais
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