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Summary

Este protocolo descreve três etapas para preparar os lobos ópticos de larvas e adultos de Drosophila para imagem: 1) dissecções cerebrais, 2) imuno-histoquímica e 3) montagem. A ênfase é colocada na etapa 3, pois são necessárias orientações de montagem distintas para visualizar estruturas específicas do lóbulo óptico.

Abstract

O lobo óptico de Drosophila , composto por quatro neurópilos: lâmina, medula, lóbula e placa de lóbula, é um excelente sistema modelo para explorar os mecanismos de desenvolvimento que geram diversidade neural e conduzem a montagem do circuito. Dada a sua complexa organização tridimensional, a análise do lobo óptico requer que se entenda como seus neurópilos adultos e progenitores larvais estão posicionados em relação uns aos outros e ao cérebro central. Aqui, descrevemos um protocolo para dissecção, imunocoloração e montagem de cérebros larvais e adultos para imagens do lobo óptico. Ênfase especial é colocada na relação entre a orientação de montagem e a organização espacial do lobo óptico. Descrevemos três estratégias de montagem na larva (anterior, posterior e lateral) e três no adulto (anterior, posterior e horizontal), cada uma das quais fornece um ângulo de imagem ideal para uma estrutura distinta do lobo óptico.

Introduction

O sistema visual da Drosophila, composto pelo olho composto e pelo lobo óptico subjacente, tem sido um excelente modelo para o estudo do desenvolvimento e função do circuito neural. Nos últimos anos, o lobo óptico, em particular, emergiu como um sistema poderoso para estudar processos de neurodesenvolvimento, como neurogênese e fiação de circuitos 1,2,3,4,5,6,7,8. É composto por quatro neurópilos: lâmina, medula, lóbula e placa lobular (as duas últimas compõem o complexo lobular)1,2,3,4,5,6. Os fotorreceptores do olho têm como alvo os neurônios da lâmina e da medula, que processam as entradas visuais e as transmitem aos neurópilos do complexo do lóbulo 1,2,3,4,5,6. Os neurônios de projeção no complexo lobular subsequentemente enviam informações visuais para os centros de processamento de ordem superior no cérebro central ^1,5,9. A complexa organização do lobo óptico, necessária pela necessidade de manter a retinotopia e processar diferentes tipos de estímulos visuais, torna-o um sistema atraente para estudar como circuitos neurais sofisticados são montados. Notavelmente, a medula compartilha semelhanças impressionantes em sua organização e desenvolvimento com a neurorretina, que há muito é um modelo para o desenvolvimento do circuito neural de vertebrados ^3,8.

O desenvolvimento do lobo óptico começa durante a embriogênese, com a especificação de ~ 35 células ectodérmicas que formam o placódio óptico 2,4,5,6,7,8. Após a eclosão larval, o placódio óptico é subdividido em dois primórdios distintos: 1) o centro de proliferação externo (OPC), que gera os neurônios da lâmina e da medula externa e 2) o centro de proliferação interno (IPC), que gera neurônios da medula interna e do complexo da lóbula 4,5,6,10 . Na larva do segundo ínstar tardio, as células neuroepiteliais do OPC e IPC começam a se transformar em neuroblastos que subsequentemente geram neurônios por meio de células-mãe ganglionares intermediárias 4,5,11,12. Os neuroblastos do lobo óptico são padronizados por fatores de transcrição espacial e temporalmente restritos, que atuam juntos para gerar diversidade neural em sua progênie 11,12,13,14. Na pupa, os circuitos dos neurópilos do lobo óptico são montados por meio da coordenação de vários processos, incluindo morte celular programada ^11,15, migração neuronal^12,16, direcionamento axonal / dendrítico^10,17, formação de sinapses^18,19 e rotações do neurópilo^10,17.

Aqui, descrevemos a metodologia pela qual os cérebros larvais e adultos são dissecados, imunomarcados e montados para imagens do lobo óptico. Dada a sua complexa organização tridimensional, a análise do lobo óptico requer que se entenda como seus neurópilos adultos e progenitores larvais estão posicionados em relação uns aos outros e ao cérebro central. Assim, colocamos ênfase especial em como a orientação da montagem se relaciona com a organização espacial das estruturas do lobo óptico. Descrevemos três estratégias de montagem para cérebros larvais (anterior, posterior e lateral) e três para cérebros adultos (anterior, posterior e horizontal), cada uma das quais fornece um ângulo ideal para imagens de uma população progenitora específica do lobo óptico ou neurópilo.

Protocol

1. Preparando cérebros larvais para imagens confocais

1. Dissecações
   NOTA: Antes de iniciar a dissecção, prepare a correção (formaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS)) e PBT (0,1-0,3% Triton em PBS). A solução fixa deve ser colocada em gelo durante a dissecção. Embora o fixador de paraformaldeído (PFA) seja usado neste protocolo, estratégias alternativas de fixação (usando PLP²⁰ ou PEM²¹) foram descritas para epítopos específicos. Para dissecções larvais, são necessários dois pares de pinças (Dumont #5 ou #55s). Consulte a Tabela de Materiais para obter mais detalhes.
   1. Comece enchendo cada poço da placa de dissecação com 400 μL de 1x PBS. Use uma pinça para escolher suavemente as larvas errantes de terceiro ínstar rastejando no interior do frasco. Coloque as larvas no primeiro poço do prato cheio de PBS.
   2. Pegue uma larva e transfira-a para o poço do meio. Usando a mão não dominante, segure o corpo da larva na base do poço.
   3. Com a mão dominante, segure suavemente o gancho da boca larval e afaste-se do corpo. O cérebro larval deve ser preso ao gancho da boca e a outros tecidos acessórios e se soltará à medida que o tecido for retirado.
   4. Remova os discos imaginais acessórios e transfira o cérebro larval para o terceiro poço da placa de dissecação. Os discos imaginários são tecidos epiteliais que circundam o cérebro larval, que geram estruturas adultas como antenas, olhos, pernas e asas²⁰. Se deixados no tecido, os discos imaginários podem obstruir a imunocoloração adequada do cérebro larval.
      1. Para remover os discos imaginários, use um par de pinças para segurar firmemente o cérebro através do cordão nervoso ventral. Usando outro par de pinças, retire suavemente os discos.
      2. Remova o disco ocular com cuidado, pois ele envolve a superfície dos lobos cerebrais. Para remover o disco ocular, use uma pinça para segurar o cérebro contra a base do prato. Em vez de segurar o cérebro através do cordão nervoso ventral, use a pinça para agarrar levemente o lobo cerebral, tomando cuidado para não apertar o lobo. Usando outro par de pinças, puxe suavemente o disco ocular.
         NOTA: O disco imaginário do olho acabará por dar origem a fotorreceptores da retina. Para os interessados em estudar a conectividade neural entre a retina e o lobo óptico, o disco ocular pode ser deixado no cérebro. No entanto, para aqueles interessados apenas em estruturas do lobo óptico, é recomendável remover o disco ocular, pois pode prejudicar a qualidade da imagem devido à sua localização na superfície do cérebro.
   5. Repita as etapas 1.1.2 a 1.4 até que um número suficiente de cérebros tenha sido coletado (ou 30 minutos de tempo de dissecação tenham decorrido). As dissecções não devem durar mais de 30 minutos para garantir que a integridade do tecido não seja comprometida.
   6. Terminado o período de dissecação, use uma pipeta P200 para remover cuidadosamente o PBS do terceiro poço. Certifique-se de que um pequeno volume de líquido permaneça no poço para manter os cérebros imersos.
      NOTA: É crucial manter os cérebros imersos em líquido em todos os pontos do protocolo. Se o tecido secar, a qualidade da mancha pode ser comprometida por autofluorescência indesejada na imagem confocal.
   7. Adicione 500 μL da solução de correção a frio no terceiro poço. Use uma pinça para mexer o líquido suavemente, permitindo que o cérebro gire no prato. Cubra o prato com uma lâmina de vidro e coloque-o no gelo por 30 min para permitir a fixação do tecido.
   8. Remova a solução de fixação e lave os cérebros com 400 μL PBT, 5 vezes.
      NOTA: Triton é um detergente em PBT que evita que os cérebros grudem uns nos outros ou no prato e prepara o tecido para a penetração ideal de anticorpos.
2. Imuno-histoquímica
   NOTA: Existem vários anticorpos primários disponíveis no Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) que podem ser usados para rotular estruturas específicas do lobo óptico ou tipos de células. DE-Caderina marca o neuroepitélio IPC e OPC, Bruchpilot (Brp) marca o neurópilo em desenvolvimento e Dachshund marca neurônios de lâmina e lóbula (bem como um pequeno subconjunto de neurônios medulares). Além disso, o Elav pode ser usado para rotular neurônios, o Prospero para marcar as células-mãe ganglionares e o Repo para identificar a glia.
   1. Preparar a solução de anticorpos primários adicionando anticorpos ao PBT até um volume total de 100 μl. Um agente bloqueador (soro de cabra normal a 10%) pode ser usado para prevenir a ligação não específica entre o anticorpo primário e o tecido 20,22,23. Os anticorpos usados neste protocolo marcam especificamente o tecido cerebral sem a necessidade de agentes bloqueadores.
   2. Remova a lavagem final pós-fixação e adicione a solução primária de anticorpos. Certifique-se de que haja apenas uma pequena quantidade de PBT no poço antes de adicionar a solução de anticorpos. Depois de adicionar a solução, mexa suavemente os cérebros com uma pinça de 5 a 10 vezes. Cobrir com uma lâmina de vidro, selar com película de laboratório e incubar a 4 °C durante a noite.
      1. Alternativamente, se um agitador orbital refrigerado estiver disponível, coloque o prato no agitador para otimizar a incubação durante a noite.
         NOTA: A incubação primária de anticorpos e todas as etapas subsequentes podem ser realizadas alternativamente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. O volume das incubações primárias e secundárias pode permanecer em 100 μL, mas as etapas de lavagem devem ser realizadas com 800 μL ou mais de PBT.
   3. Após a incubação, lave os anticorpos primários com PBT como na etapa 1.1.8 da seção anterior.
      NOTA: A solução primária de anticorpos deve ser guardada e armazenada a 4 °C, uma vez que pode ser reutilizada em experiências subsequentes. Muitos anticorpos primários podem ser reutilizados até quatro vezes.
   4. Adicione 400 μL de PBT ao cérebro para uma lavagem final. Cubra o prato com uma lâmina, sele com filme de laboratório e coloque-o em um agitador orbital em baixa velocidade (100 rpm) e temperatura ambiente (RT) por ~ 4 h.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os cérebros podem ser lavados por 2 a 3 dias a 4 °C.
   5. Preparar a solução de anticorpos secundários num volume total de 100 μl.
      NOTA: Neste protocolo, todos os anticorpos secundários são usados em uma diluição de 1:500, sem agentes bloqueadores.
   6. Remova a lavagem PBT do poço e adicione a solução de anticorpos secundários. Misture o tecido na solução usando um par de pinças. Cubra o prato com uma lâmina e filme de laboratório. Colocar a placa num agitador orbital à temperatura de saída durante um período mínimo de incubação de 2 h. Como os anticorpos secundários contêm fluoróforos sensíveis à luz, cubra o prato com papel alumínio.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os cérebros podem ser deixados em solução de anticorpos secundários durante a noite a 4 °C.
   7. Lave os anticorpos secundários conforme descrito na etapa 1.2.3. Adicione 400 μL de PBT ao cérebro para uma lavagem final. Cubra o prato com uma lâmina, feche com filme de laboratório e papel alumínio. Coloque os cérebros em um shaker em RT por 4 h.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os cérebros podem ser lavados por 2 a 3 dias a 4 °C.
3. Montagem
   1. Remova a lavagem final do PBT e substitua por duas gotas de mídia de montagem segura contra fluorescência. Coloque uma gota da mídia de montagem no centro de um slide.
   2. Transfira os cérebros do poço para a gota na lâmina usando uma pinça. Para evitar danos aos lobos ópticos, os cérebros podem ser mantidos pelo cordão nervoso ventral durante a transferência para a lâmina.
   3. Monte os cérebros de acordo com as estratégias de montagem a seguir (Figura 1A).
      1. Lado anterior para cima
         NOTA: Para os interessados em visualizar a medula anterior, lâmina ou plugue de lóbula, esta orientação de montagem é ideal. A melhor maneira de distinguir as montagens anterior e posterior é examinando a posição do cordão nervoso ventral em relação aos lobos cerebrais.
         1. Use a orientação anterior para observar o cordão nervoso ventral projetando-se sobre os lobos (Figura 1B).
      2. Lado posterior para cima
         NOTA: Esta orientação é recomendada para aqueles interessados em visualizar as pontas posteriores do OPC (pOPC) ou IPC ^10,11.
         1. Use a orientação posterior para visualizar o cordão nervoso ventral projetando-se sob os lobos cerebrais (Figura 1C).
      3. Vista lateral
         NOTA: Uma orientação de montagem lateral é usada para visualizar o crescente dos neurônios da lâmina, medula ou plugue da lóbula nos eixos dorsal-ventral e ântero-posterior em um único plano (Figura 1G).
         1. Para uma montagem lateral, divida os lobos cerebrais um do outro para cair de lado, com a lâmina e o tampão da lóbula voltados para cima.
         2. Usando dois pares de pinças afiadas, divida o cordão nervoso ventral ao meio, começando de onde o cordão se liga aos lóbulos. Observe que os dois lobos já estão separados um do outro, com o cordão nervoso ventral mantendo-os intactos. Assim, divida o cordão nervoso ventral a partir do ponto de clivagem entre os lobos, para separá-los. Em seguida, vire cada lobo cerebral e o cordão nervoso ventral anexado de lado, com as superfícies laterais voltadas para cima.
            NOTA: Para montagem em vista lateral, recomenda-se usar uma agulha de tungstênio com uma ponta fina para orientar o lobo do cérebro de lado. Para visualizar claramente a orientação dos lóbulos e a direção do cordão nervoso ventral durante a montagem, a iluminação do microscópio pode ser ajustada. Se estiver usando uma fonte de luz LED pescoço de ganso, os pescoços de ganso devem ser posicionados paralelamente à superfície do slide para uma visibilidade clara. Além disso, a intensidade da iluminação pode ser aumentada ou diminuída para aumentar o contraste entre as estruturas cerebrais e fornecer clareza durante a montagem.
   4. Coloque uma pequena gota de PBS em ambos os lados da mídia de montagem contendo os cérebros. Coloque uma lamínula em cada gota e uma lamínula final sobre os miolos. As bordas direita e esquerda da lamínula superior devem repousar sobre as outras duas lamínulas (Figura 1A).
      NOTA: Antes de colocar uma lamínula sobre os cérebros, uma ponte deve ser construída. Os cérebros das larvas têm aproximadamente 200 μm de espessura e, portanto, para manter a integridade do tecido, é criada uma ponte que aumenta a distância entre a lamínula e a superfície da lâmina.
   5. Sele as bordas da ponte com esmalte para prender os cérebros montados.
   6. Imagem dos cérebros usando microscopia confocal.

2. Preparando cérebros adultos para imagens confocais

1. Dissecações
   NOTA: As dissecções cerebrais adultas são mais desafiadoras do que os cérebros larvais e requerem um manuseio cuidadoso. É altamente recomendável usar pelo menos um par de pinças ultrafinas (Dumont # 55) para esta parte do protocolo.
   1. Anestesie as moscas com CO₂, usando uma agulha ou flypad, e coloque-as em um lenço de laboratório ou toalha de papel sobre o gelo (para mantê-las anestesiadas).
   2. Adicione 400 μL de PBS aos três poços do prato de vidro. Use uma pinça para agarrar suavemente uma mosca adulta pelas asas e coloque-a no primeiro poço do prato.
   3. Use um par de pinças seguradas na mão não dominante para segurar o tórax da mosca contra a base do poço. Com a mão dominante, puxe suavemente a cabeça do resto do corpo.
   4. Transfira a cabeça para o segundo poço. Freqüentemente, a cabeça flutua no PBS e pode ser difícil de manusear. Use uma pinça para segurá-lo contra a base do poço pela tromba.
   5. Retire uma região da cutícula entre os olhos usando as duas pinças. Como o cérebro fica logo abaixo da cutícula, seja o mais gentil possível para evitar danos ao tecido subjacente. Continue a descascar a cutícula um pedaço de cada vez, até que o cérebro fique exposto. Remova qualquer tecido acessório (ou seja, retina, traqueia, sacos de ar) que possa permanecer preso ao cérebro.
      NOTA: A remoção da retina foi descrita em protocolos anteriores^22,24, mas a lâmina também pode ser separada do resto do lobo óptico. Isso é útil para aqueles que desejam estudar o complexo medular ou lóbulo, uma vez que a lâmina fica na superfície e pode obstruir a visualização desses outros neurópilos do lobo óptico durante a imagem. Para remover a lâmina, use um par de pinças afiadas para puxar suavemente o recuo entre a lâmina e o neurópilo da medula. A lâmina começará lentamente a se desprender da medula. Repita esse movimento até que toda a lâmina seja removida. Durante esse processo, é importante manter um controle firme do cérebro. Use outro par de pinças para segurar o cérebro contra a base do prato, posicionando-o de forma que a parte superior e inferior do cérebro central se encaixem perfeitamente entre as pontas da pinça. Um aperto firme ao redor do cérebro central evitará danos indesejados ao lobo óptico.
   6. Transfira o cérebro limpo para o terceiro poço. Repita as etapas 2.1.2 a 1.6 até que um número suficiente de cérebros seja obtido ou um período máximo de dissecção de 30 minutos tenha decorrido.
   7. Remova o PBS no terceiro poço e adicione 500 μL de solução fixa. Certifique-se de que os cérebros não sequem aqui ou durante qualquer etapa de lavagem, pois isso levará à fluorescência de fundo nas imagens confocais. Cubra o prato com uma lâmina de vidro e deixe os cérebros incubarem em correção por 20 min em RT.
   8. Após a fixação, lave o cérebro com 400 μL de PBT, 5 vezes.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os cérebros podem ser cobertos com uma lâmina de vidro e filme de laboratório e lavados por 2 a 3 dias a 4 ° C. Para pesquisadores novos no sistema, pode ser mais fácil deixar tecido acessório no cérebro antes e durante a fixação. Isso permitirá que os pesquisadores maximizem o número de amostras cerebrais obtidas em um determinado período de dissecação. Depois que o tecido foi fixado e lavado, os cérebros podem ser cuidadosamente limpos antes de adicionar a solução primária de anticorpos. Cérebros adultos com tecido acessório tendem a flutuar e, portanto, correm o risco de secar. Como resultado, recomenda-se usar um par de pinças para agrupar cuidadosamente todos os cérebros no centro do prato ao adicionar a solução fixa e limpar os cérebros imediatamente após a fixação.
2. Imuno-histoquímica
   1. Realize a imuno-histoquímica conforme descrito para cérebros larvais na seção 1.2.
   2. Os anticorpos primários úteis do DSHB incluem aqueles mencionados no protocolo de imuno-histoquímica larval na seção 1.2. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista completa de anticorpos e diluições correspondentes.
      NOTA: Deve-se tomar cuidado extra durante as etapas de lavagem para cérebros adultos, pois eles podem flutuar para a superfície da solução de lavagem e correr o risco de secar nas laterais do poço quando a solução for removida (o que levará à fluorescência de fundo). Uma boa prática é segurar a pipeta em uma mão para adicionar ou retirar o líquido e um par de pinças na outra para manter os cérebros submersos.
3. Montagem
   1. Antes da etapa de montagem, execute uma lavagem final com PBS (em vez de PBT). O PBS faz com que os cérebros fiquem ligeiramente pegajosos, o que permite que eles permaneçam na orientação desejada durante a montagem.
   2. Remova a lavagem final e substitua por três gotas de mídia de montagem à prova de fluorescência. Coloque uma gota da mídia de montagem no centro de uma lâmina de microscópio.
   3. Transfira os cérebros do poço para a gota na lâmina usando uma pinça. Para evitar danificar os lobos ópticos e evitar que o tecido seque, recupere cuidadosamente um cérebro por ação capilar. Feche lentamente um par de fórceps ao redor de um cérebro até que um pequeno volume de líquido contendo o cérebro seja puxado entre as pontas.
      NOTA: Ao transferir o cérebro para a lâmina, tome cuidado para não fechar a pinça, pois isso danificará o cérebro. Alternativamente, uma pipeta P200 pode ser usada para transferir os cérebros. Corte a ponta da ponta para alargar a abertura e pré-enxágue com PBT para evitar que o cérebro grude no interior da ponta.
   4. Monte os cérebros de acordo com as seguintes estratégias (Figura 2A).
      1. Lado anterior para cima
         NOTA: Para visualizar os neurônios da lâmina e da medula, oriente o cérebro com o lado anterior para cima (Figura 2B). Isso pode ser alcançado examinando a anatomia e a curvatura dos lobos antenais centrais.
         1. Com um par de pinças, vire suavemente o cérebro de lado para examinar os lados anterior e posterior. Observe que, no lado anterior, a curvatura do cérebro é pronunciada e os lobos antenais se projetam ligeiramente para fora do centro.
      2. Lado posterior para cima
         1. Posicione os cérebros com o lado posterior (plano) voltado para cima e os lobos antenais para baixo (Figura 2C).
            NOTA: Isso aproximará o lóbulo e a placa do lóbulo da superfície de imagem e é ideal para os interessados em visualizar os neurônios do complexo do lóbulo.
      3. Vista horizontal
         NOTA: Para visualizar todos os neurópilos do lobo óptico simultaneamente, use uma estratégia de montagem horizontal (Figura 2G). Nessa orientação, corpos celulares neuronais, trajetórias axonais e arborizações dendríticas podem ser visualizados no mesmo plano.
         1. Inicialmente, oriente o cérebro com o lado anterior para cima. Com uma agulha de tungstênio, incline suavemente o cérebro 90° para cima, de modo que ele fique no lado dorsal com os lobos antenais voltados para fora. Verifique se os lados anterior e posterior do cérebro são visíveis nesta orientação.
   5. Em vez de uma ponte de capa, use argila para elevar a lamínula do slide. O uso de argila permite a remontagem dos cérebros após a imagem (descrita na seção de discussão).
      1. Coloque um pequeno pedaço de argila em cada canto de uma lamínula. Certifique-se de que cada pedaço de argila tenha relativamente a mesma espessura. Os pedaços de argila devem ter entre 0,5–1 mm de espessura. Coloque suavemente a lamínula sobre os cérebros e aplique uma leve pressão nos cantos. A lamínula deve pegar imediatamente o líquido e formar uma vedação. O slide agora está pronto para geração de imagens.
         NOTA: Para armazenamento prolongado da lâmina, recomenda-se selar a lamínula com esmalte e armazená-la a 4 °C longe da luz.

Representative Results

Discussion

Neste protocolo, descrevemos um método para imunocorar cérebros de larvas e adultos de Drosophila e montá-los em várias orientações. Embora os métodos para corar cérebros larvais e adultos tenham sido descritos anteriormente^{22 , 23 , 24 , 27 , 28} , as estratégias de montagem para a visualização ideal de estruturas específicas do lobo óptico receberam menos atenção²⁸ . Prevê-se que o protocolo descrito aqui forneça aos pesquisadores uma maior compreensão da relação entre a orientação da montagem e as estruturas do lobo óptico visualizadas.

Além das orientações descritas neste protocolo, ângulos alternativos de visualização do lobo óptico adulto e larval podem ser alcançados separando o lobo óptico do cérebro central. Os lobos ópticos podem ser separados do cérebro central usando tesoura de inseto, fórceps ou agulha de tungstênio. No adulto, essa pode ser uma estratégia útil nos casos em que a curvatura do cérebro central inibe a montagem plana dos lobos, resultando em ângulos irregulares durante a imagem. Deve-se notar que um lobo isolado será mais difícil de montar sem os pontos de referência fornecidos pelo cérebro central (ou seja, lobos antenais, curvatura do cérebro, etc.) que são usados para determinar a orientação da montagem. Essa limitação pode ser superada analisando os lobos ópticos sob um microscópio GFP de fluorescência (se o cérebro estiver corado para o marcador fluorescente apropriado) para garantir que a orientação desejada seja alcançada antes de adicionar a lamínula. Da mesma forma, na larva, a remoção de um lobo cerebral do lobo contralateral anexado e do cordão nervoso ventral permite que o cérebro seja montado em qualquer orientação. Um microscópio GFP pode ser usado para determinar o ângulo de montagem em relação às estruturas do lobo óptico de interesse.

Os cérebros também podem ser visualizados em várias orientações, removendo a lamínula após a imagem e remontando o cérebro. Para a remontagem, a ponte original deve ser feita com argila e não deve ser aplicado esmalte. Para reorientar os cérebros, um par de pinças pode ser inserido embaixo da lamínula para quebrar o selo. Uma vez que a lamínula é levantada, a maioria dos cérebros deve permanecer na mídia de montagem. Os cérebros podem então ser remontados e uma nova lamínula pode ser colocada em cima dos cérebros. Essa técnica já foi usada para obter imagens de um único cérebro em várias orientações para construir uma imagem tridimensional de alta resolução da morfologia de um neurônio medular¹⁷. Embora a remontagem seja frequentemente feita com cérebros adultos, a técnica também pode ser aplicada a cérebros larvais, o que também exigiria a construção da ponte com argila. É importante manusear as amostras de cérebro de larvas com cuidado ao remontar, porque sua fragilidade as torna mais propensas a rasgar quando a lamínula é removida.

Os protocolos acima mencionados também podem ser aplicados ao tecido cerebral pupal 10,22,24. Como os cérebros das pupas sofrem rápidas mudanças morfogênicas durante o desenvolvimento, as orientações de montagem para a pupa inicial (0\u201230 h APF) se assemelham às dos cérebros larvais, enquanto as pupas do estágio intermediário tardio (>50 h APF) estão mais próximas das orientações de montagem do cérebro adulto. Os cérebros das pupas são mais frágeis do que os cérebros larvais e adultos e, portanto, requerem cuidados extras ao serem manipulados.

Finalmente, além do tecido fixo e corado, uma compreensão das orientações de montagem do cérebro é importante para aplicações de imagem ao vivo. Cérebros larvais e adultos podem ser cultivados e fotografados em condições vivas para acompanhar as divisões celulares e as mudanças na morfologia e atividade neuronal ao longo do tempo 24,27,29. Aqui, a orientação de montagem usada é crítica, pois a fluorescência endógena mais fraca exige que os tipos de células de interesse estejam localizados o mais próximo possível da superfície do cérebro para uma detecção de sinal ideal durante a imagem.

Materials

10x PBS	Bioshop	PBS405
37% formaldehyde	Bioshop	FOR201
Alexa Fluor 488 (goat) secondary	Invitrogen	A-11055	use at 1:500
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary	Invitrogen	A-31570	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary	Invitrogen	A-21450	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (rat) secondary	Invitrogen	A-21247	use at 1:500
Cover slips	VWR	48366-067
Dissecting forceps – #5	Dumont	11251-10
Dissecting forceps – #55	Dumont	11295-51
Dissection Dish	Corning	722085
Dry wipes	Kimbery Clark	34155
Goat anti-Bgal primary antibody	Biogenesis		use at 1:1000
Guinea pig anti-Bsh primary antibody	Gift from Claude Desplan		use at 1:500
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody	Erclik et al. 2008		use at 1:1000
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Microscope slides	VWR	CA4823-180
Mouse anti-dac primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	mabdac2-3	use at 1:20
Mouse anti-eya primary antibody	DSHB	eya10H6	use at 1:20
Mouse anti-nc82 primary antibody	DSHB	nc82	use at 1:50
Mouse anti-svp primary antibody	DSHB	Seven-up 2D3	use at 1:100
Polymer Clay	Any type of clay can be used
Rabbit anti-GFP	Invitrogen	A-11122	use at 1:1000
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody	DSHB	DCAD2	use at 1:20
Slowfade mounting medium	Invitrogen	S36967	Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used
Triton-x-100	Bioshop	TRX506