Este protocolo descreve três etapas para preparar os lobos ópticos de larvas e adultos de Drosophila para imagem: 1) dissecções cerebrais, 2) imuno-histoquímica e 3) montagem. A ênfase é colocada na etapa 3, pois são necessárias orientações de montagem distintas para visualizar estruturas específicas do lóbulo óptico.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Dissecção, imuno-histoquímica e montagem de cérebros de larvas e adultos de Drosophila para visualização do lobo óptico
Neste artigo
Resumo
Resumo
O lobo óptico de Drosophila , composto por quatro neurópilos: lâmina, medula, lóbula e placa de lóbula, é um excelente sistema modelo para explorar os mecanismos de desenvolvimento que geram diversidade neural e conduzem a montagem do circuito. Dada a sua complexa organização tridimensional, a análise do lobo óptico requer que se entenda como seus neurópilos adultos e progenitores larvais estão posicionados em relação uns aos outros e ao cérebro central. Aqui, descrevemos um protocolo para dissecção, imunocoloração e montagem de cérebros larvais e adultos para imagens do lobo óptico. Ênfase especial é colocada na relação entre a orientação de montagem e a organização espacial do lobo óptico. Descrevemos três estratégias de montagem na larva (anterior, posterior e lateral) e três no adulto (anterior, posterior e horizontal), cada uma das quais fornece um ângulo de imagem ideal para uma estrutura distinta do lobo óptico.
Introdução
O sistema visual da Drosophila, composto pelo olho composto e pelo lobo óptico subjacente, tem sido um excelente modelo para o estudo do desenvolvimento e função do circuito neural. Nos últimos anos, o lobo óptico, em particular, emergiu como um sistema poderoso para estudar processos de neurodesenvolvimento, como neurogênese e fiação de circuitos 1,2,3,4,5,6,7,8. É composto por quatro neurópilo....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparando cérebros larvais para imagens confocais
- Dissecações
NOTA: Antes de iniciar a dissecção, prepare a correção (formaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS)) e PBT (0,1-0,3% Triton em PBS). A solução fixa deve ser colocada em gelo durante a dissecção. Embora o fixador de paraformaldeído (PFA) seja usado neste protocolo, estratégias alternativas de fixação (usando PLP20 ou PEM21) foram descritas para epítopos específicos. Para dissecções larvais, são necessários dois pares de pinças (Dumont #5 ou #55s). Consulte a Tabela de Materiais para obter mais detalhes.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Imagens confocais de lobos ópticos larvais e adultos montados nas orientações descritas no protocolo são apresentadas na Figura 1 e na Figura 2.
A Figura 1 mostra esquemas e fatias confocais representativas de cérebros larvais posicionados nas orientações anterior, posterior e lateral. Na orientação de montagem anterior, o epitélio OPC (DE-Cadherin), neuroblastos medulares (deadpan>βgal) e neu.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Neste protocolo, descrevemos um método para imunocorar cérebros de larvas e adultos de Drosophila e montá-los em várias orientações. Embora os métodos para corar cérebros larvais e adultos tenham sido descritos anteriormente22 , 23 , 24 , 27 , 28 , as estratégias de montagem para a visualização ideal de estruturas específicas do lobo óptico receberam .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Claude Desplan por compartilhar conosco uma alíquota do anticorpo Bsh. Os anticorpos monoclonais DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up e Bruchpilot foram obtidos do Developmental Studies Hybridoma Bank, criado pelo NICHD do NIH e mantido na Universidade de Iowa, Departamento de Biologia, Iowa City, IA 52242. Este trabalho foi apoiado por um NSERC Discovery Grant concedido a T.E.. A UA é apoiada por uma bolsa de pós-graduação NSERC Alexander Graham Bell Canada. PV é apoiado por uma bolsa de estudos de pós-graduação de Ontário.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Bioshop | PBS405 | |
| 37% formaldeído | Bioshop | FOR201 | |
| Alexa Fluor 488 (cabra) secundário | Invitrogen | A-11055 | uso em 1:500 |
| Alexa Fluor 555 (camundongo) secundário | Invitrogen | A-31570 | uso em 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (cobaia) secundário | Invitrogen | A-21450 | uso em 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (rato) secundário | Invitrogen | A-21247 | use a 1:500 |
| Lamínulas | VWR | 48366-067 | |
| Pinça de dissecação - #5 | Dumont | 11251-10 | |
| Pinça de dissecação - #55 | Dumont | 11295-51 | |
| Prato de dissecação | Corning | 722085 | |
| Toalhetes secos | Kimbery Clark | 34155 | |
| Anticorpo primário anti-Bgal de cabra | biogênese | a 1:1000 | |
| Anticorpo primário anti-Bsh de cobaia | Presente de Claude Desplan | uso a 1:500 | |
| Anticorpo primário anti-Vsx1 de cobaia | Erclik et al. 2008 | uso a 1:1000 | |
| Filme de laboratório | Parafilm | PM-996 | |
| Tubos de | microcentrífugaSarstedt | 72.706.600 | |
| Lâminas de microscópio | VWR | CA4823-180 | |
| Estudos de desenvolvimento de anticorpo primário anti-dac de camundongo | hibridoma (DSHB) | mabdac2-3 | em 1:20 |
| Anticorpo primário anti-eya de camundongo | DSHB | eya10H6 | uso em 1:20 |
| Anticorpo primário anti-nc82 de camundongo | DSHB | nc82 | uso em camundongo 1:50 |
| anticorpo primário anti-svp | DSHB | Uso de 2D3 de sete para cima | a 1:100 |
| Argila de polímero | Qualquer tipo de argila pode ser usado | ||
| Coelho anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | uso a 1:1000 |
| Anticorpo primário anti-DE-caderina de rato | DSHB | DCAD2 | uso a 1:20 |
| Meio de montagem Slowfade | Invitrogen | S36967 | O meio de montagem Vectashield (cat# H-1000) também pode ser usado |
| Triton-x-100 | Bioshop | TRX506 |
Referências
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Research. 258, (1989).
- Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. Prolif....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
