Aplicação de terapia phage para neutralizar pseudomonas aeruginosa infecção em embriões de zebrafish fibrose cística

A terapia phage, o uso dos inimigos naturais das bactérias para combater infecções bacterianas, está ganhando interesse renovado à medida que a resistência bacteriana aos antibióticos se torna generalizada^1,,2. Esta terapia, utilizada há décadas na Europa Oriental, poderia ser considerada um tratamento complementar a antibióticos na cura de infecções pulmonares em pacientes com CF e uma possível alternativa terapêutica para pacientes infectados com bactérias resistentes a todos os antibióticos atualmente em uso^2,,3. As vantagens da terapia antibiótico são que os bacteriófagos se multiplicam no local da infecção, enquanto os antibióticos são metabolizados e eliminados do corpo^4,,5. De fato, a administração de coquetéis de phages virulentos isolados em diferentes laboratórios tem se mostrado eficaz no tratamento de infecções pseudomonas aeruginosa em modelos animais tão diferentes quanto insetos e mamíferos^6,,7,,8. A terapia de phage também mostrou-se capaz de reduzir a carga bacteriana em feridas de queimadura infectadas com P. aeruginosa e Escherichia coli em um ensaio clínico randomizado⁹.

O zebrafish (Danio rerio) emergiu recentemente como um modelo valioso para estudar infecções com vários patógenos, incluindo P. aeruginosa^10,11, Mycobacterium abscessus e Burkolderia cepacia^12,13. Ao microinjetar bactérias diretamente na circulação sanguínea do embrião¹⁴ é fácil estabelecer uma infecção sistêmica que é neutralizada pelo sistema imunológico inato de zebrafish, que é conservado evolutivo com neutrófilos e geração de macrófagos semelhante à contraparte humana. Além disso, durante o primeiro mês de vida, os embriões de zebrafish carecem da resposta imune adaptativa, tornando-os modelos ideais para estudar a imunidade inata, que é o mecanismo crítico de defesa em infecções pulmonares humanas¹⁵. O zebrafish surgiu recentemente como um poderoso sistema de modelo genético para entender melhor o início da CF e desenvolver novos tratamentos farmacológicos^10,,16,17. O modelo de zebrafish CF de cftr knock-down gerado com injeção de morfolino em zebrafish apresentou uma resposta de explosão respiratória amortecida e reduziu a migração de neutrófilo¹⁰, enquanto o nocaute do CFTR leva à posição do órgão interno prejudicada e à destruição do pâncreas exócrino, um fenótipo que espelha a doença humana^16,17. De maior interesse foi a constatação de que a carga bacteriana P. aeruginosa foi significativamente maior em embriões de perda de função cftrdo que em controles em 8 horas pós-infecção (hpi), o que paralelamente aos resultados obtidos com camundongos e células epiteliais brônquias humanas^2,,18.

Neste trabalho, demonstramos que a terapia de phage é eficaz contra infecções por P. aeruginosa em embriões de zebrafish.

Os zebrafish adultos (Danio rerio) da cepa AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) são mantidos de acordo com as diretrizes internacionais (Diretiva da UE 2010/63/UE) e nacionais (decreto italiano 4^de março de 2014, n. 26) sobre a proteção de animais usados para fins científicos. As condições padrão são definidas na instalação de peixes com um ciclo escuro de 14 horas/10 h e temperatura da água do tanque a 28° C.

1. Elaboração de soluções e ferramentas

1. Prepare uma solução de estoque de 50x e soluções de trabalho 1x para o meio de embrião E3 para embriões de zebrafish em crescimento (ver Tabela 1).
2. Faça solução de bloqueio de pigmentação, para bloquear a pigmentação do embrião a partir de 24 horas após a fertilização (24 hpf) (ver Tabela 1).
3. Prepare estoque de 25x e solução anestésica tricane de trabalho 1x, conforme descrito na Tabela 1.
   NOTA: Para evitar o congelamento e o descongelamento repetidos da solução que poderia danificar a solução de estoque, faça alíquotas de 2 mL de tricaine 25x e armazene-as a -20 °C.
4. Prepare as faixas para microinjeção de embriões dissolvendo 1 g de agarose em 100 mL de H₂O destilado em um frasco ou garrafa microwavable. Micro-ondas por 1-3 min até que a agarose esteja completamente dissolvida.
5. Posicione os moldes de microinjeção de zebrafish (ver Tabela de Materiais) virados de cabeça para baixo em uma placa de Petri (90 mm x 15 mm) e cubra toda a superfície derramando o gel líquido de agarose com uma largura de aproximadamente 10 mm.
6. Remova o molde assim que a agarose se solidificar. Encha a placa de Petri com 1x de meio de embrião E3. Isso pode ser armazenado a 4 °C por aproximadamente uma semana. Antes de usar, substitua pelo meio E3 fresco contendo Tricaine.
   NOTA: Moldes mais antigos podem desenvolver fungos ou contaminações bacterianas.
7. Use capilares de 10 cm polidos de fogo para preparar agulhas para microinjeção e fixá-las no puxador de micropipette apertando as alças. Ajuste o puxador com as seguintes configurações: calor 500, velocidade 100, tempo 150, puxe 150.

2. P. aeruginosa (PAO1) preparação inóculo

1. Inoculação 1 colônia de GFP⁺P. aeruginosa cepa PAO1¹⁹ em 5 mL de caldo LB (ver Tabela 1) e crescer durante a noite a 37 °C com agitação (200 rpm).
2. Diluir a cultura da noite para OD₆₀₀ = 0,1 em 10 mL de caldo LB e crescer para OD₆₀₀ = 0,5 a 37 °C com agitação (200 rpm).
3. Centrifugar 2 mL da cultura por 2 min a 4 °C a 16.100 x g e resuspengar a pelota celular para OD₆₀₀ = 1, equivalente a cerca de 1 x 10⁹ cfu/mL, em 1 mL da solução fisiológica (ver Tabela 1).
4. Diluir a suspensão celular para cerca de 5 x 10⁷cfu/mL em solução fisiológica e armazenar a 4 °C.

3. Preparação de estoque de phage

1. Inocular 1 colônia de P. aeruginosa cepa PAO1 em 5 mL de caldo LB e incubar durante a noite a 37 °C com agitação. Diluir a cultura da noite para_{OD 600} = 0,01 em 500 mL de caldo LB e crescer a 37 °C com agitação para OD₆₀₀ = 0,05, equivalente a cerca de 2,5 x 10⁷ cfu/mL.
2. À cultura diluída de P. aeruginosa,adicione cerca de 1,25 x 10⁷ phages, para obter a multiplicidade de infecção (M.O.I.) de 10^-3. Incubar a 37 °C com agitação até que o OD₆₀₀ caia para cerca de 0,1-0,3 (em cerca de 3 a 5 horas, dependendo do phage utilizado).
   NOTA: Foram selecionados quatro phages para este experimento que infectam a cepa PAO1: Dois Podoviridae, números de adesão do GenBank vB_PaeP_PYO2, MF490236 e vB_PaeP_DEV, MF490238, e dois Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 e vB_PaeM_E217, MF490240. Realize as etapas abaixo para cada phage individualmente.
3. Incubar o lysate com 1 mg/mL de DNase e RNase por 30 min a 37 °C. Centrifugar a 5.000 x g por 30 min a 4 °C e recuperar cuidadosamente o supernaspe (SN). Filtre o SN com um filtro com 0,8 μm de diâmetro de poros.
4. Ao SN, adicione 58 g/L de NaCl e 105 g/L de PEG6000. Dissolva-se com agitação em RT 20 min e, em seguida, mantê-lo durante a noite a 4 °C. Centrífuga a 20.000 x g por 30 min a 4 °C para precipitação de phage. Remova o SN e dissolva cuidadosamente a pelota de phage em 15 mL de tampão TN (ver Tabela 1).
5. Purifique os phages com gradiente de densidade CsCl, conforme descrito nas etapas abaixo.
   1. Em um tubo de ultracentrificação de poliallômero para rotor SW41, prepare um gradiente de densidade de passo CsCl estratificando 2 mL das quatro soluções CsCl descritas na Tabela 1.  Adicione 3,5 mL de suspensão de phage em cada um dos 4 tubos.
      NOTA: CsCl é tóxico, adotar procedimentos de segurança adequados para manuseá-lo e descartá-lo.
   2. Introduza os tubos no rotor e certifique-se de que os tubos estejam equilibrados (a diferença de peso entre os dois tubos voltados deve ser ≤ 0,01g).
   3. Centrifugar por 2h a 4 °C e 100 x g (25.000 rpm para rotor SW41). Após a centrifugação, remova lentamente os tubos e imobilize-os cuidadosamente em um suporte. Usando uma seringa com agulha de 19 G, elas desenhe a faixa branca/opalescente que está localizada geralmente entre a região de densidade d=1,5 e a d=1,4.
   4. Transfira as suspensões da seringa para novos tubos de polinômero para rotor SW60 e use a solução d=1.4 para equilibrar com precisão os tubos.
   5. Centrifugar a suspensão a 4 °C e 150.000 x g (38.000 rpm para o rotor SW60) por pelo menos 16 h.
   6. Colete a faixa visível como acima (ver passo 3.3.3) e transfira-as para tubos de diálise com 6.000 da cut-off. Dialise a faixa visível obtida 2x por 20 min contra 500 mL de água e durante a noite contra 500 mL de tampão TN. Filtrar com um filtro de poros de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.

4. Preparação para coquetéis de phage

1. Faça uma mistura de quatro phages que infectam a cepa PAO1, anteriormente isolada e caracterizada⁸. Antes de misturar, estime o título de cada estoque de phage por ensaio de placa²⁰.
2. Monte o coquetel de phage, com um titer global de 5 × 10⁸ pfu/mL, misturando igualmente quatro preparações de phage no mesmo pfu/mL imediatamente antes de cada experimento, para garantir titulações phage precisas.

5. Coleta e preparação de embriões de zebrafish para microinjeção de morfolnos cftr

NOTA: Coletar 1-2 embriões de células de zebrafish tipo selvagem para microinjeção cftr morpholinos(cftr-MOs).

1. Dois dias antes do experimento de microinjeção bacteriana, configure pares de reprodução e colete embriões conforme descrito anteriormente²¹. Os zebrafish adultos (Danio rerio) da cepa AB foram comprados do European Zebrafish Resource Center, EZRC.
2. No dia seguinte, colete os embriões imediatamente após a fertilização com uma pipeta plástica ou usando um coador de malha fina. Coloque os embriões coletados em uma placa de Petri contendo meio embrião E3 e remova cuidadosamente os detritos com uma pipeta plástica para evitar contaminação que possa prejudicar o desenvolvimento do embrião.
3. Prepare 5 μL de solução de injeção de morfolino diluindo as duas soluções de estoque de morfolino (1 mM) em água estéril para uma concentração final de 0,25 pmol/embrião ATG-MO + 0,25 pmol/embrião-MO. Para rastrear a injeção de embrião, adicione 0,5 μL de fenol vermelho à mistura da solução de injeção de morfolino.
4. Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL da solução de mistura de morfelino usando uma micropipette de 20 μL com uma ponta de carregamento de gel fino. Fixar a agulha no micromanípulo conectado a um suporte e posicioná-la sob um estereótipo.
   NOTA: Não é necessário que a solução atinja a ponta da agulha, pois a pressão da bomba microinjetor irá empurrá-la.
5. Corte a ponta da agulha cortando a ponta da agulha com pinças finas e estéreis. Meça o diâmetro da gota usando uma barra de escala no ocular do microscópio. Alternativamente, crie uma gota de óleo mineral em um slide de micrômetro e ajuste o volume de microinjeção injetando a solução na gota de óleo para avaliar o tamanho da gotícula. Use uma gota com um diâmetro de 156 μm para injetar um volume de 2 nL.
6. Ajuste o microinjetor ajustando a pressão de compensação para 15 hPa, tempo de injeção para 0,5 s e pressão de injeção entre 300 e 600 hPa para obter o volume correto de injeção dependendo da agulha utilizada.
7. Com uma pipeta plástica organize os embriões da etapa 5.2 em um vidro posicionado em uma placa de Petri de 96 mm de diâmetro.
   NOTA: Muito meio E3 impedirá a penetração adequada da agulha de microinjeção na coro dos embriões.
8. Penetre o acorde e, em seguida, a gema com a agulha para injetar 2 nL no embrião como descrito anteriormente²².
9. Coloque embriões injetados em uma placa de Petri com meio E3 e coloque-os em uma incubadora a 28 °C para deixá-los se desenvolver até o dia seguinte.

6. Microinjeção de embriões de zebrafish com bactérias e coquetel de phage

NOTA: Para realizar uma infecção sistêmica, o embrião deve ter circulação sanguínea que geralmente começa após 26 hpf.

1. Após 26 hpf (para estágios de desenvolvimento de zebrafish, consulte Kimmel²¹) embriões descorrionatos com solução de pronase preparados pela dissolução do pó de pronase em meio E3 a uma concentração de 2 mg/mL. Pipeta suavemente os embriões para quebrar o acorde. Descarte o meio pronase/E3 e enxágue o prato várias vezes com E3 fresco para remover toda a pronase.
2. Anesthetize embriões de zebrafish em E3 médio contendo Tricaine aproximadamente 5 minutos antes das injeções.
3. Pipeta os embriões anestesiados na pista preparados na etapa 1. Use uma ponta de carregamento de gel fino para forrar os embriões na posição lateral.
4. Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL da preparação de P. aeruginosa conforme descrito na parte 5.
5. Insira a agulha dorsalmente ao ponto de partida do duto de Cuvier, onde ela começa a se espalhar sobre o saco de gema. Injete um volume de 1-3 nL e certifique-se de que o volume se expanda diretamente dentro do duto e entre na circulação.
6. Aproximadamente após cada 50 embriões injetados, injete uma gota da bactéria em um tubo de centrífuga de 1,5 mL com 100 μL de PBS estéril para verificar se o volume de injeção permanece o mesmo. Emplaque o inóculo no ágar LB (ver Tabela 1) a 37 °C durante a noite para avaliar a UFC.
7. Transfira os embriões microinjetados em duas placas de Petri limpas com e3 médio fresco + PTU e incuba-os a 28 °C.
8. Em dois pontos de tempo selecionados: 30 min ou 3 h após a injeção bacteriana, retire uma das placas de Petri com embriões injetados por bactérias da incubadora e alinhe-os na pista, conforme descrito em 6.3 para a injeção de coquetel phage.
9. Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL do coquetel de phage (preparado na etapa 4) com uma ponta de carregamento de gel fino e fixe-a no microinjetor (ver passo 5).
10. Injete o coquetel de phage no duto de Cuvier dos embriões previamente injetados com bactérias.
11. Transfira os embriões microinjetados em duas placas de Petri limpas com e3 médio fresco + PTU e incuba-os a 28 °C.

7. Avaliação da carga bacteriana de embriões injetados com PAO1 e phages

1. A 8 hpi, pipeta 15 embriões anestesiados da placa de Petri para um tubo de centrífugas de 1,5 mL.
2. Substitua a solução anestésica por 300 μL de 1% Triton X-100 em PBS (PBSTritonX) e homogeneize os embriões passando-os pelo menos 15x através de uma seringa de insulina com uma agulha estéril de 27 G.
3. Prepare diluições seriais de homogeneizadores em PBS estéreis transferindo 100 μL do homogenate diluído em 900 μL de PBS estéril.
4. Para selecionar para a cepa PAO1 naturalmente resistente, a placa 100 μL das diluições no ágar LB adicionada com ampicillina (100 μg/mL) e incubar a 37 °C durante a noite.
5. No dia seguinte, conte o número de colônias, multiplique pelo fator de diluição para determinar o número total de UFC, e divida pelo número de embriões homogeneizados para obter o número médio de UFC/embrião infectado.

8. Avaliação da letalidade dos embriões injetados com PAO1 e phages

1. Para avaliar a letalidade da infecção por PAO1, escore os embriões injetados em 20 hpi sob um estereótipo e conte para os embriões mortos (branco/não transparente).
2. Calcule a dose de concentração letal semi-máxima de 50 (LD50) de PAO1 que determina a morte de 50% dos embriões injetados a 20 hpf.

9. Preparação embrionária para imagens de lapso de tempo estereomicroscope da infecção por GFP⁺ PAO1

1. Prepare o molde para imagens de embriões vivos dissolvendo 1,5% de baixa agarose de fusão em 100 mL de solução E3.
2. Adicione 1% de Tricaine (ver Tabela 1) para anestesiar os embriões.
3. A 4 hpi transfira um embrião com uma pipeta de plástico em um prato de fundo de vidro e adicione a solução agarose de ponto de fusão baixa quente.
4. Posicione a placa de fundo de vidro sob um estereótipo e com uma ponta posicione o embrião na orientação desejada. Use uma pipeta de plástico para adicionar cuidadosamente uma gota de agarose no embrião.
5. Deixe a agarose esfriar por 5-10 min e encha delicadamente o prato de fundo de vidro com E3 contendo a solução anestésica para manter o embrião úmido.
6. Coloque a antena inferior de vidro com o embrião sob o estereóscópio fluorescente com um filtro fluorescente (canal 488 nm) para bactérias GFP^+. Não remova a placa de Petri até novas aquisições com os mesmos parâmetros de 9, 14 e 18 cv.

10. Análises de expressão de citocinas pró-inflamatórias

1. A 20 hpi anestesia os embriões com solução tricaine 1x e transfira-os da placa de Petri para um tubo de centrífugas de 1,5 mL.
2. Sob um capô de fumaça remova a solução anestéstica e substitua por 200 μL de reagente de cloridrato de guanidium.
3. Homogeneize os embriões ao pipetá-los repetidamente através de uma pipeta de 200 μL primeiro e, em seguida, pelo menos 15x com uma seringa de insulina com uma agulha estéril de 27 G.
4. Extrair RNA total de embriões homogeneizados de zebrafish usando um reagente de cloridrato de guanidium comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante.
5. Trate 1 μg de cada amostra de RNA com 2 μL de 1U/μL de DNase I (sem RNase), seguindo as instruções do fabricante.
6. Use 1 μg de RNA tratado DNase I para reação de transcrição reversa (RT) usando kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais),em um volume total de 20 μL de acordo com as instruções do fabricante.
7. Execute a reação qPCR RT em um volume total de 10 μL contendo 1x SYBR Green mastermix usando 1,5 μL de uma diluição de 1:6 da reação RT. Para fins de normalização, use os primers para os genes de manutenção da casa rpl8 e para citocinas pró-inflamatórias, use primers para TNF-α e IL-1β (ver Tabela 2). o protocolo qPCR foi: ciclo 1 passo 1: 95 °C, 2 min, repetir uma vez; ciclo 2: passo 1 95 °C, 10 s, passo 2 55 °C, 30 s, repetir 40x; ciclo 3: passo 1 72 °C, 15 min.

Os resultados e os números aqui apresentados são encaminhados aos embriões cf gerados através da injeção de morfoolinos cftr como descrito anteriormente10 e na etapa 5. Para validar o fenótipo cf, considerou-se a posição prejudicada de órgãos internos como coração, fígado e pâncreas, conforme descrito anteriormente17 (Figura 1). Resultados semelhantes foram obtidos no caso dos embriões WT, conforme relatado em nossa publicação anterior19.

A carga bacteriana foi reduzida pela fisioterapia em embriões CF infectados com PAO1. Além disso, avaliamos a carga bacteriana em 8 hpi por homogeneizar grupos de 15 embriões: o número médio de bactérias (cfu/embrião) presente nos embriões infectados pao1 foi reduzido para cerca de 20% após o tratamento administrativo da phage, confirmando assim uma infecção menos grave na presença do coquetel phage(Figura 2).

A letalidade foi reduzida pela fisioterapia em embriões CF infectados com GFP+ bactéria PAO1. Os embriões de zebrafish CF a 48 hpf foram injetados com GFP+ bactérias da cepa PAO1 em uma dose que causou 50% de letalidade após 20 hpi (30 cfu/embrião, Figura 3A). O local da injeção foi a gema ou o ducto de Cuvier para gerar uma infecção sistêmica. A terapia de phage contra a infecção pelo PAO1 foi testada injetando 2 nL do coquetel de phage igualmente misto (300-500 pfu/embrião). A injeção foi realizada em dois pontos de tempo diferentes: 30 minutos (cedo) e 7 horas (atrasado) após injeção bacteriana. Em ambos os casos, a letalidade foi reduzida a 20 hpi, indicando que a terapia phage é eficaz(Figura 3B).

Com imagens ao vivo, utilizando um estereótipo fluorescente, também acompanhamos a progressão da infecção em embriões CF injetados com GFP+ PAO1 e mostramos a eficácia da terapia de phage na redução da propagação de bactérias fluorescentes sobre o saco de gema. O embrião injetado CF+PAO1 com multiplicação de bactérias GFP+ em 4, 9, 14 e 18 hpi é mostrado na parte superior da Figura 4, enquanto o embrião CF+PAO1+phages com fluorescência reduzida devido à ação de phage contra bactérias é mostrado na parte inferior(Figura 4).

A terapia de phage reduziu a resposta inflamatória gerada pela infecção por PAO1 em embriões CF. Também avaliamos a resposta imune gerada pela injeção de PAO1 e PAO1 + phages a 8 hpi. Como esperado, a expressão das citocinas pró-inflamatórias TNF-a e IL-1β analisadas pelas técnicas qPCR foi significativamente aumentada após a injeção de PAO1 em comparação com os controles, enquanto foi reduzida com a co-injeção do coquetel de phage(Figura 5A,B).

Figura 1: Geração e validação de embriões CF após injeção de cftr morpholinos(cftr-MOs). (A) Posição prejudicada e looping do coração em embriões injetados cf em comparação com embriões do tipo selvagem (WT). O coração é visualizado com expressão cmlc2 pela técnica de hibridização in situ. (B) Posição prejudicada do fígado (setas) e pâncreas em embriões CF em comparação com WT. Fígado e pâncreas são visualizados com expressão prox1a por técnicas de hibridização in situ. As barras de escala indicam 100 μm. liv: fígado; p: pâncreas. A figura é reimpressa a partir de19 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Carga bacteriana em embriões CF infectados com PAO1 ou PAO1+phages. A porcentagem relativa de cfu/embrião em embriões PAO1+phages vs PAO1 é dada. A média e a SD de três experimentos independentes são relatadas. O número é reimpresso a partir de19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Letalidade de embriões de zebrafish CF infectados com PAO1 e com PAO1+phages.  (A) Determinação de LD50 em embriões de zebrafish de 48 hpf microinjetados com cftr-MOem estágio de 1 célula (embriões CF) e infectados a 48 hpf com 2 nL de uma cultura de PAO1 contendo número crescente de bactérias (cfu/embrião). A letalidade dos embriões foi observada em 20 hpi. (B) Letalidade a 20 hpi de embriões CF infectados com PAO1 a 48 hpf e tratados com o coquetel phage (PAO1+ Φ). A média e a SD relatadas são de seis e quatro experimentos, respectivamente, cada um com 25-40 embriões. A transformação angular foi aplicada à porcentagem de letalidade e a ANOVA unidirecional seguida pelo teste de Duncan foi usada. O número é reimpresso a partir de19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagem da eficácia da terapia de phage em zebrafish. Progressão da infecção em embriões CF após injeção de PAO1 (embrião superior) e eficácia da terapia de phage em pao1+phages injetou embriões (embrião inferior) em 4, 9, 14 e 18 hpi. A barra de escala indica 100 mícrons. O número é reimpresso a partir de19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias seguindo a administração PAO1 e PAO+phage. Níveis de expressão dos genes TNF-a (A) e IL-1β medidos por RT-qPCR a 8 hpi em embriões CF injetados com PAO1 e PAO1+Φ a 48 hpf e normalizados usando a expressão de rpl8. A média e a SD de quatro experimentos são relatadas. A significância estatística foi avaliada pela ANOVA seguida do teste de Duncan: para TNF- a (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,015*; (CF) vs (CF+PAO1+Φ) p = 0,019*; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,77 n.s.; para IL-1β (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,00014**; (CF) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,00068***; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,031*. O número é reimpresso a partir de19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Preparação de soluções.

Tabela 2: Primers usados para RT-qPCR.

Os autores não têm nada a revelar.