Artigo de método

Aplicando um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional para induzir a diferenciação tenogênica de células-tronco derivadas do tendão

DOI:

10.3791/61278

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1 de agosto de 2020

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1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional é um bioreator ideal para diferenciação tenogênica específica de células-tronco derivadas do tendão e formação de neo-tendões.

Resumo

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Tendinopatia é uma doença crônica comum relacionada à inflamação e degeneração em uma área ortopédica. Com alta morbidade, capacidade limitada de auto-reparação e, o mais importante, sem tratamentos definitivos, a tendinopatia ainda influencia negativamente a qualidade de vida dos pacientes. As células-tronco derivadas do tendão (TDSCs), como células precursoras primárias das células tendinosas, desempenham um papel essencial tanto no desenvolvimento da tendinopatia, quanto na restauração funcional e estrutural após a tendinopatia. Assim, um método que pode imitar in vitro a diferenciação in vivo de TDSCs em células tendinosas seria útil. Aqui, o presente protocolo descreve um método baseado em um sistema de alongamento uniaxial tridimensional (3D) para estimular os TDSCs a se diferenciarem em tecidos semelhantes a tendões. São sete estágios do presente protocolo: isolamento de TDSCs camundongos, cultura e expansão de TDSCs de camundongos, preparação de meio de cultura de estimulação para formação de folhas de células, formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação, preparação de construção de células-tronco tendinosas 3D, montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial e avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro como tendão. A eficácia foi demonstrada pela histologia. Todo o procedimento leva menos de 3 semanas. Para promover a deposição da matriz extracelular, utilizou-se ácido ascórbico de 4,4 mg/mL no meio da cultura de estimulação. Uma câmara separada com motor linear fornece carregamento mecânico preciso e é portátil e facilmente ajustada, que é aplicada para o bioreator. O regime de carregamento no presente protocolo foi de 6% de tensão, 0,25 Hz, 8h, seguido de repouso de 16h durante 6 dias. Esse protocolo poderia imitar a diferenciação celular no tendão, o que é útil para a investigação do processo patológico da tendinopatia. Além disso, o tecido semelhante ao tendão é potencialmente usado para promover a cicatrização do tendão na lesão tendinosa como um enxerto autólogo projetado. Resumindo, o presente protocolo é simples, econômico, reproduzível e válido.

Introdução

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Tendinopatia é uma das lesões esportivas comuns. Manifesta-se principalmente por dor, inchaço local, diminuição da tensão muscular na área afetada e disfunção. A incidência de tendinopatia é alta. A presença de tendinopatia de Aquiles é mais comum para corredores de média e longa distância (até 29%), enquanto a presença de tendinopatia patelar também é alta em atletas de vôlei (45%), basquete (32%), atletismo (23%), handebol (15%) e futebol (13%)1,2,,3,,4,5. No entanto, devido à limitada capacidade de auto-cura do tendão e à falta de tratamentos eficazes, a tendinopatia ainda influencia negativamente a vida dos pacientes6,7. Além disso, a patogênese da tendinopatia permanece incerta. Tem havido muitas investigações sobre sua patogênese, principalmente incluindo "teoria da inflamação", "teoria da degeneração", "teoria do uso excessivo", e assim por diante8. Atualmente, muitos pesquisadores acreditavam que a tendinopatia era devido à falha no auto-reparo das micro-lesões causadas pelo carregamento mecânico excessivo das experiências tendinosas9,,10.

As células-tronco derivadas do tendão (TDSCs), como células precursoras primárias das células tendinosas, desempenham um papel essencial tanto no desenvolvimento da tendinopatia quanto na restauração funcional e estrutural após tendinopatia11,,12,,13. Foi relatado que a estimulação do estresse mecânico poderia causar a proliferação e diferenciação de osteocitos, osteoblastos, células musculares lisas, fibroblastos, células-tronco mesenquimais e outras células sensíveis à força14,,15,,16,,17,18. Portanto, os TDSCs, como uma das células mecanosensíveis e multipotentes, podem ser estimulados a diferenciar-se por carregamento mecânico19,,20.

No entanto, diferentes parâmetros de carga mecânica (força de carga, frequência de carga, tipo de carga e período de carregamento) podem induzir TDSCs a se diferenciar em diferentes células21. Assim, um regime de carregamento mecânico eficaz e válido é muito significativo para a tenogênese. Além disso, existem diferentes tipos de bioreatores como sistemas de estimulação atualmente utilizados para fornecer carregamento mecânico para TDSCs. Os princípios de cada tipo de bioreator são diferentes, de modo que os parâmetros de carregamento mecânico correspondentes a diferentes bioreatores também são diferentes. Portanto, é procurado um protocolo de estimulação simples, econômico e reprodutível, incluindo o tipo de bioreator, o meio de estimulação correspondente e o regime de carga mecânica.

O presente artigo descreve um método baseado em um sistema de alongamento uniaxial tridimensional (3D) para estimular os TDSCs a se diferenciarem em tecido semelhante ao tendão. São sete estágios do protocolo: isolamento de TDSCs camundongos, cultura e expansão de TDSCs de camundongos, preparação de cultura de estimulação para formação de folhas de células, formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação, preparação de construção de células-tronco tendinosas 3D, montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial e avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro. Todo o procedimento leva menos de 3 semanas para obter o construto de células 3D, que é muito menor do que alguns métodos existentes22,23. O presente protocolo tem sido provado ser capaz de induzir TDSCs a diferenciar-se em tecido tendão, e é mais confiável do que o sistema de alongamento bidimensional (2D) atualmente usado21. A eficácia foi demonstrada pela histologia. Em suma, o presente protocolo é simples, econômico, reproduzível e válido.

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Protocolo

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Os métodos descritos foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos do Comitê de Ética Animal da Universidade da Austrália Ocidental.

1. Isolamento de TDSCs de camundongos

  1. Eutanize os camundongos C57BL/6 de 6-8 semanas por luxação cervical.
  2. Colher tendões patelares24 e tendões de Aquiles25.
  3. Digestão de tendões de um com 6 mL de colagenase tipo I (3 mg/mL) por 3h.
    NOTA: Como o tamanho do tendão do mouse é pequeno, todos os tendões colhidos de um rato devem ser usados nesta etapa.
  4. Colete as células e a cultura em meio essencial mínimo completo (Alpha-MEM) contendo 10% do soro bovino fetal (FBS) e 1% da mistura de estreptomicina e penicilina por 7 dias.
  5. Identificar TDSCs usando a triagem celular ativada pela fluorescência por citometria de fluxo (expressão de marcadores de superfície celular incluindo CD44, CD90 e Sca-1; falta da expressão de CD34 e CD45).
  6. Células de passagem e congelamento (as células de passagem 4 serão usadas para novas etapas).

2. Cultura e expansão de TDSCs de camundongos

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

  1. Leve as células aquecidas (camundongos TDSCs, 1 milhão de células, passagem 4, a 37 °C).
  2. Adicione lentamente 4-5 mL extras de meio essencial mínimo completo (Alpha-MEM).
  3. Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 15 mL com uma pipeta.
  4. Cubra com médio a 8 mL total com uma pipeta.
    1. Meio pré-aquecido em uma incubadora de forno de 37 °C.
  5. Coloque o tubo em centrífuga e equilibre.
  6. Centrífuga e células de pelota a 347 x g por 5 min.
  7. Tire depois da centrífuga e verifique a pelota na parte inferior.
  8. Decante as células congelantes e resuspende suavemente em 1-2 mL de meio completo (evite fazer muitas bolhas).
  9. Transfira células resuspended para um frasco T-75 por uma pipeta.
  10. Use uma pipeta para adicionar o Medium Alfa-MEM completo ao frasco para atingir um volume total de 10 mL com concentração final de 13.000 células/cm2.
  11. Coloque o frasco na incubadora e cultura a 37 °C com 5% de CO2.
  12. Troque o meio a cada 3 dias.
  13. Observe e monitore as células sob um microscópio ao alterar o meio até que as células sejam cultivadas para 100% de confluência (cerca de 40.000 células/cm2).

3. Preparação do meio de cultura de estimulação para formação de folhas de células

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

  1. Despeje 15 mL de meio Alfa-MEM completo em um tubo estéril de 15 mL.
  2. Adicione 6 μL de ácido ascórbico (11 mg/mL) em 15 mL de meio para uma concentração final de 4,4 μg/mL.
    NOTA: Além disso, adicionar 25 ng/mL de fator de crescimento do tecido conjuntivo no meio da cultura de estimulação pode acelerar todo o processo de crescimento e diferenciação.
  3. Misture suavemente invertendo para cima e para baixo.

4. Formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

  1. Descarte cuidadosamente o meio alfa-MEM completo normal e evite tocar nas células presas à parte inferior do frasco.
  2. Adicione 10 mL de meio de estimulação lentamente e evite causar qualquer perturbação às células totalmente confluentes.
  3. Cultura as células em meio de estimulação por 9 dias (mude o meio a cada 3 dias) para gerar suficientemente a folha celular a 37 °C com 5% de CO2.
    NOTA: A matriz extracelular ficará espessa e presente para ser nublada quando observada a partir da parte inferior do frasco após estimulada pelo ácido ascórbico, o que significa que a folha celular é suficientemente gerada.

5. Preparação da construção de células-tronco tendinosas 3D

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

  1. Tire o frasco da incubadora.
  2. Descarte completamente o meio de estimulação.
  3. Lave a folha de células de monocamadas com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) girando o frasco.
  4. Descarte completamente o PBS.
  5. Use uma pipeta para adicionar 1 mL de 0,25% de trippsina no canto do frasco.
  6. Toque no canto do frasco para desacoplar a folha de células da monocamada até que o canto da folha de células esteja fora da parte inferior do frasco.
  7. Adicione imediatamente 9 mL de meio Alfa-MEM completo para parar a trippsinização.
  8. Continue girando o frasco para descascar completamente a folha de células da monocamada.
  9. Despeje a folha de células totalmente desarmada em uma placa de Petri com meio.
  10. Use uma pinça estéril para pegar um canto da folha de celular e girar no sentido horário por 15 vezes.
  11. Pegue outra extremidade da folha de células e gire em sentido anti-horário por 10 vezes para gerar firmemente uma construção in vitro semelhante ao tendão(Figura 1A).

6. Montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial em bioreator projetado único

NOTA: Conduza todas as etapas em um capô biossegurança estéril.

  1. Conecte os ganchos pelo conector e ajuste à distância desejada (2 cm) entre dois ganchos.
  2. Enrole suavemente os TDSCs 3D construídos no gancho montado por 3 vezes em cada gancho(Figura 1B).
  3. Fixar os ganchos com construção celular na câmara do bioreator apertando os parafusos em duas extremidades.
    NOTA: Toda a câmara, incluindo parafusos e ganchos, é estéril (autoclave por 1,5 h a 134 °C e raios ultravioleta (UV) expõem por 24 horas antes do uso). Para o suporte metálico das câmaras, a luz UV expõe por 48 horas antes do uso.
  4. Encha a câmara com o meio Alfa-MEM completo.
  5. Conecte o atuador à câmara de cultura por cabo.
  6. Corte o conector dos ganchos por uma tesoura estéril.
  7. Ligue a potência e o controlador de canal correspondente para iniciar a estimulação mecânica.
  8. Coloque a tampa na câmara.
  9. Verifique as luzes indicadoras e assegure que o bioreator possa funcionar corretamente.
  10. Coloque o bioreator na incubadora e submia a construção de células 3D ao alongamento mecânico por 6 dias (alongamento de 6%, 0,25 Hz, 8h, seguido de 16h de repouso).

7. Avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro semelhante ao tendão

  1. Solte os parafusos por uma chave de fenda e retire o conjunto com cuidado.
  2. Coloque o tecido tendinoso em 4% de paraformaldeído para fixação por 15 minutos.
  3. Coloque o tecido fixo do tendão em um de biópsia com almofadas de espuma biópsia.
  4. Processo para desidratar a amostra e, finalmente, avaliar por manchas histológicas de H&E.
  5. Repita todo o protocolo e extraia RNA do tecido semelhante ao tendão para avaliar a expressão de marcadores tenogênicos por PCR quantitativo (qPCR). Os primers dos genes selecionados estão listados na Tabela 1.
    NOTA: O protocolo de histologia e o protocolo qPCR são padrão e seguem um estudo anterior21.

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Resultados

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Antes da estimulação mecânica, os TDSCs foram cultivados para 100% de confluência em meio completo e apresentaram uma morfologia ultraestrutural desorganizada(Figura 2A). Após 6 dias de carga mecânica de alongamento uniaxial, a matriz extracelular (ECM) e os alinhamentos celulares foram bem orientados(Figura 2B). As células estavam bem povoadas e bem envoltas em ECM após o carregamento mecânico. A morfologia celular foi apresentada para ser alongada e mais semelhante à célula tendinosa n...

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Discussão

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O tendão é um tecido conjuntivo fibroso mecanosensível. De acordo com pesquisas anteriores, o excesso de carga mecânica poderia levar à diferenciação osteogênica das células-tronco tendinosas, enquanto o carregamento insuficiente levaria à estrutura de fibra de colágeno desordenada durante a diferenciação do tendão21.

Uma visão comum é que a chave para um bioreator ideal é a capacidade de simular o microambiente celular in vitro que as células in vivo sofrem. Portanto, ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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A pesquisa foi realizada enquanto o autor estava recebendo "uma Bolsa de Estudos de Taxa Internacional da Universidade da Austrália Ocidental e um Prêmio de Pós-Graduação universitária na Universidade da Austrália Ocidental". Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81802214).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido ascórbicoSigma-aldrichPHR1008-2G
Soro fetal bovino (FBS)Gibcoä por Life Technologies1908361
processador de histologiaLeicaTP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)Gibcoä por Life Technologies2003802
Célula-troncoderivada de tendão de camundongoIsolado do tendão de Aquiles de camundongos C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade. Em seguida, digerido com colagenase tipo I (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA) por 3 h e passou por um filtro de células de 70 mm para produzir suspensões unicelulares.
ParaformaldeídoSigma-aldrich441244
Mistura de estreptomicina e penicilinaGibcoä por Life Technologies15140122
Sistema de Biorreator de Estimulação Mecânica Uniaxial TridimensionalCentro de Pesquisa Translacional Ortopédica, Faculdade de Medicina, Universidade da Austrália OcidentalDisponível com o autor correspondente mediante solicitação. Ou faça de acordo com nosso design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. A estimulação mecânica programável influencia a homeostase do tendão em um sistema de biorreator. Biotechnol Bioeng. 2013; 110(5):1495-1507. doi:10.1002/bit.24809
TrypsinGibcoä por Life Technologies1858331

Referências

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  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper's knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), Bristol, Avon. 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), Oxford, England. 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), Oxford, England. 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221(2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075(2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), Bristol, England. 014109(2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251(2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810(2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280(2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164(2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), Cambridge, England. 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43(2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, Suppl 1 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

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