Este artigo descreve o isolamento e a culminação de neurônios simpáticos de ratos embrionários da gânglio cervical superior. Também fornece protocolos detalhados para coloração imunocitoquímica e para preparação de extratos neuronais para análise espectrométrica em massa.
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Artigo de método
Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neurônios simpáticos da gânglio cervical superior de rato embrionário (SCG) têm sido usados como um sistema modelo in vitro para neurônios periféricos estudarem crescimento axonal, tráfico axonal, sinápgeno, crescimento dendrático, plasticidade dendrítica e interações de alvo nervoso em sistemas de cocultura. Este protocolo descreve o isolamento e dissociação de neurônios da gânglio cervical superior dos embriões de ratos E21, seguido pela preparação e manutenção de culturas neuronais puras em meio livre de soro. Como os neurônios não aderem ao plástico não revestido, os neurônios serão cultivados em tampas de vidro de 12 mm ou em placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina. Após o tratamento com um agente antimitotico (Ara-C, citose β-D-arabinofuranoside), este protocolo gera culturas neuronais saudáveis com menos de 5% de células não neuronais, que podem ser mantidas por mais de um mês in vitro. Embora os neurônios SCG de ratos embrionários sejam multipolares com dendritos de 5-8 in vivo; sob condições livres de soro, esses neurônios estendem apenas um único axônio na cultura e continuam a ser unipolares durante a duração da cultura. No entanto, esses neurônios podem ser induzidos a estender dendritos na presença de extrato de membrana do porão, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), ou 10% de soro fetal da panturrilha. Essas culturas neuronais homogêneas podem ser utilizadas para coloração imunocitológica e para estudos bioquímicos. Este artigo também descreve o protocolo otimizado para coloração imunocitômica para microtúbulos associados à proteína-2 (MAP-2) nesses neurônios e para a preparação de extratos neuronais para espectrometria de massa.
Introdução
Neurônios simpáticos derivados de gânglios cervicais superiores embrionários (SCG) têm sido amplamente utilizados como um sistema de cultura neuronal primária para estudar muitos aspectos do desenvolvimento neuronal, incluindo a dependência do fator de crescimento, interações neurônio-alvo, sinalização neurotransmissor, crescimento axonal, desenvolvimento de dendrite e plasticidade, sinápsogênese e mecanismos de sinalização subjacentes às interações nervo-alvo/neurônio-glia1,,2,,3,,4,,5,,
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Protocolo
Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Saint Mary's College of California. As diretrizes de cuidado e uso de animais no Colégio Santa Maria foram desenvolvidas com base nas diretrizes fornecidas pelo Escritório de Bem-Estar Animal Laboratorial do Instituto Nacional de Saúde (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf e https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).
1. Preparação de meios culturais (também referido como meio de controle)
- Adicione os seguint....
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Resultados
Isolar e manter culturas neuronais de neurônios SCG embrionários
As células dissociadas do SCG embrionário de rato foram banhadas em uma placa revestida de poli-D-lisina ou deslizamento de cobertura e mantidas em meios de cultura livre de soro contendo fator de crescimento b-nervo. As células dissociadas contendo uma mistura de neurônios e células gliais parecem circulares sobre o revestimento(Figura 1A). Dentro de 24 horas após o revestimento, os neurônios estendem peque.......
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Discussão
Este artigo descreve os protocolos para cultivar neurônios simpáticos de gânglios cervicais superiores de filhotes de ratos embrionários. As vantagens de utilizar esse sistema modelo são que é possível obter uma população homogênea de neurônios fornecendo uma resposta semelhante aos fatores de crescimento, e como os requisitos do fator de crescimento para esses neurônios têm sido bem caracterizados, é possível cultivar esses neurônios in vitro em meios definidos, sob condições livres de soro10. Em.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Desenvolvimento da Faculdade e pelo Programa de Pesquisa de Verão do Saint Mary's College of California. Os autores também gostariam de agradecer à Dra. Os autores também gostariam de agradecer Haley Nelson no Escritório de Comunicações Universitárias do Saint Mary's College of California por sua ajuda na produção e edição de vídeo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Bicarbonato de amônio | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R& D Systems | 354-BP | |
| Soro Bovino Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Raspador de células | Corning | CLS-3010 | |
| Colagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar ou Nunc Placas de cultura de células de fundo plano | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Citosina- β- D-arabinofuranosídeo | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-fosfato tamponado salino (sem cálcio e magnésio) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Água Destilada | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM - Baixa glicose + Glutamina, + piruvato de sódio | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Calbiochem | BSA Livre de Ácidos Graxos | 126609 | 20 mg/mL estoque em baixa glicose DMEM |
| Fórceps Fina Dumont no.4 e no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Fórceps e Tesouras para Dissecção | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Lábios de cobertura de vidro - 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| IgG Anti Camundongo Cabra Alexa 488 conjugado | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Mistura de Nutrientes F-12 da Ham's | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Solção de sal balanceada Hank's (sem cálcio e magnésio) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulina-Selênio-Transferrina (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamida | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 meio | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mídia de montagem para lamínulas | de vidro Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Anticorpo anti-MAP2 de camundongo (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Fator de crescimento nervoso | Envigo Bioproducts (anteriormente Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μ g/mL em 0,2% de Prionex em DMEM |
| Paraformaldeído | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicilina-Estreptomicina (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poli-D-Lisina | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | Solução de 10%, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 Espectrometria de Massa de Alta Definição | Waters Corporation | ||
| Trifluoro ácido acético - Grau de sequenciamento | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tripsina | Promega ou NEB | V511A, P8101S | 100 μ g ou 5 |
| frascos de recuperação total de águas | Waters Corporation | 186000385c |
Referências
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Re....
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Reimpressões e permissões
