Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais

Resumo

Aqui são apresentados métodos para entender os efeitos anticânculos do supernatante livre de células Lactobacillus (LCFS). As linhas de células cancerígenas colorretais mostram mortes celulares quando tratadas com LCFS em culturas 3D. O processo de geração de esferoides pode ser otimizado dependendo do andaime e os métodos de análise apresentados são úteis para avaliar as vias de sinalização envolvidas.

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo para avaliar as mortes de células cancerígenas em esferoides tridimensionais (3D) de tipos multicelulares de células cancerígenas usando supernacantes da cultura celular fermentum Lactobacillus, consideradas culturas probióticas. O uso de culturas 3D para testar o supernante livre de células Lactobacillus (LCFS) é uma opção melhor do que testar em monocamadas 2D, especialmente porque l. fermentum pode produzir efeitos anti-câncer dentro do intestino. L. fermentum supernante foi identificado por possuir efeitos anti-proliferativos aumentados contra várias células de câncer colorretal (CRC) em condições de cultura 3D. Curiosamente, esses efeitos estavam fortemente relacionados com o modelo de cultura, demonstrando a notável capacidade de L. fermentum para induzir a morte celular cancerígena. Esferoides estáveis foram gerados a partir de diversos CRCs (células cancerosas colorretais) utilizando o protocolo apresentado abaixo. Este protocolo de geração de spheroid 3D é uma economia de tempo e rentável. Este sistema foi desenvolvido para investigar facilmente os efeitos anticâncológicos do LCFS em vários tipos de spheroids CRC. Como esperado, os spheróides crc tratados com LCFS induziram fortemente a morte celular durante o experimento e expressaram marcadores moleculares específicos de apoptose, conforme analisado por qRT-PCR, manchas ocidentais e análise FACS. Portanto, este método é valioso para explorar a viabilidade celular e avaliar a eficácia de medicamentos anticâncológicos.

Introdução

Os probióticos são os microrganismos mais vantajosos no intestino que melhoram a homeostase imunológica e o metabolismo energético hospedeiro¹. Os probióticos de Lactobacillus e Bifidobacterium são os mais avançados do seu tipo encontrados no intestino^2,3. Investigações anteriores mostraram que Lactobacillus tem efeitos inibitórios e antiproliferativos em vários cânceres, incluindo câncer colorretal⁴. Além disso, os probióticos previnem doenças inflamatórias intestinais, doença de Crohn e colite ulcerativa^5,....

Protocolo

1. Culturas celulares bacterianas e preparação de supernanato livre de células Lactobacillus (LCFS)

NOTA: As etapas 1.2 – 1.9 são realizadas em câmara anaeróbica.

1. Prepare uma placa de ágar MRS e caldo contendo L-cisteína e esterilize por autoclaving.
2. Pré-incubar a placa de ágar MRS em H₂ câmara anaeróbica mantida a 37 °C com 20 ppm de oxigênio.
3. Descongele o caldo bacteriano Lactobacillus e inocula a placa de ágar com a cultura bacteriana (Figura 1A (i)).
4. Incubar bactérias por 2 a 3 dias em H₂ câmara anaeróbica a 37....

Resultados

Descrevemos o protocolo de obtenção de esferoides de diversas linhas de células cancerígenas colorretais. A suplementação com metilcelulose foi necessária para gerar esferoides. Também apresentamos um método de preparação do LCFS e apresentamos um modelo para estudar a correlação entre probióticos e câncer colorretal. Os protocolos de formação de spheroid e LCFS são ilustrados esquematicamente na Figura 1A,B. Como mostrado na Figura 2A,a concent.......

Discussão

O microambiente tecidual, incluindo células vizinhas e a matriz extracelular (ECM), é fundamental para a geração de tecidos e crucial no controle do crescimento celular e desenvolvimento de tecidos¹³. No entanto, as culturas 2D têm diversas desvantagens, como a interrupção das interações celulares, bem como alterações na morfologia celular, ambientes extracelulares e a abordagem da divisão¹⁴. Os sistemas de cultura celular 3D foram rigorosamente estudados para melhor reprod.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados, 15 poços, 15 µ l	Biorad	4561036	Pkg de 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 capas
10x tampão de transferência	Intron	IBS-BT031A	1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)	Intron	IBS-BT014	1 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polipropileno, Transparente, Não Estéril, 500 Tubos/Pacote, 10 Pacotes/Caixa	Corning	SCT-200-C	500 Tubos/Pacote, 10 Pacotes/Caixa
BD Difco Bacto Agar	BD	214010	500 g
BD Difco Lactobacilos MRS Caldo	BD	DF0881-17-5	500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viabilidade assay	Promega	G9681	100μ l/ensaio em placas de 96 poços
Coquetel Completo de Inibidor de Protease	Sigma-Aldrich	11697498001	frasco de 20 comprimidos
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X sem cálcio e magnésio, PH 7,4 ± 0,1	Corning	21-040-CV	500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Membranas de Transferência	fisher Scientific	IPVH00010	rolo de 26,5cm x 3,75m; Tamanho dos poros: 0.45um
Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo Falcon 5 mL, com tampa de pressão do filtro de células	Corning	352235	25/Pack, 500/Caixa
Soro Fetal Bovino, certificado, origem americana	Thermo Fisher Scientific	16000044	Kit
Síntese de cDNA iScript, 25 x 20 µ l rxns #1708890	Biorad	1708890	25 x 20 µ L rxns
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Biorad	1725121	5 x 1 mL
Lactobacillus fermentum	Coleção Coreana para Culturas Tipo	KCTC 3112
Cloridrato de L-Cisteína monohidratado	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
Metilcelulose (3500-5600mPa· s, 2% em Água a 20° C)	TCI	M0185	500 g
MicroAmp Placa de Reação Óptica Rápida de 96 Poços com Código de Barras, 0,1 mL	Applied Biosystems	4346906	20 placas
Unidade de Filtro de Seringa Millex-GS, 0,22 µ m, ésteres de celulose mistos, 33 mm, esterilizado por óxido de etileno	Millipore	SLGS033SB	250
PE Kit de detecção de apoptose de anexina V com 7-AAD	Biolegend	640934	100 testes
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 mL
introgênio	de iodeto de propídio	P1304MP	100 mg
de tampão de lise e extração RIPA	Thermo Fisher Scientific	89901	250 mL
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106	250
RPMI-1640	Gibco	11875-119	500 mL
Tripsina-EDTA (0.25%), vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 mL
Nome dos Materiais/Equipamento/Software	Empresa	Número de Catálogo	Comentários/Descrição
anti - p-Iκ B&alfa; (B-9)	Santa cruze	sc-8404	200 µ g/mL
anti-BclxL (H-5)	Santa cruze	sc-8392	200 µ g/mL
anti-PARP 1 (C2-10)	Santa cruze	sc-53643	50 µ l ascite
anti-β-actina (C4)	Santa cruze	sc-47778	200 µ g / mL
BD FACSVerse	BD Biosciences		San Diego, CA, EUA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader		BioT S1LFA
Incubadora de CO2	Thermo fisher	HERAcell 150i
Tubo cônico 15 ml	SPL	50015
Tubo cônico 50 ml	SPL	50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Placa de Poços Múltiplos	Sigma-Aldrich	CLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Placa de Poços Múltiplos	Sigma-Aldrich	CLS3471
Costar 50 mL, 5/Saco, Estéril	Costar	4870
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermofisher	C10228
Countess II FL Contador de Células Automatizado	invitrogen
Leitor Multimodo EnSpire	Perkin Elmer		Enspire 2300
Eppendorf Research Plus Pipeta Multicanal,	Eppendorf	3122000051
	TreeStar		Ashland, OR, EUA
IgG Anti-Rato de Cabra (H+L)	Jackson immunoresearch	115-035-062	1.5 mL
IgG Anti-Coelho de Cabra (H+L)	Jackson immunoresearch	111-035-144	2.0 mL
GraphPad Prism 5	GraphPad Software		Inc., San Diego, CA, EUA
ImageJ	NIH
ImageQuant LAS 4000 mini	Fujifilm		Tóquio, Japão
Agitador incubado	Companheiro de laboratório	SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,	Fujifilm		Tóquio, Japão
Densidade óptica (OD)LAMBDA UV/Vis Espectrofotômetros	Perkin Elmer		Waltham, MA, EUA
Microscópio de contraste de fase	Olympus		Tóquio, Japão
Tubo de microcentrífuga SPL 1.5mL	SPL	60015
SPL Reservatórios multicanal, 12 canais, PS, estéril	SPL	21012
StepOnePlus Sistema	de PCR em tempo realThermo Fisher Scientific		Waltham, MA, EUA
Processadores de líquidos ultrassônicos Vibra-Cell	SONICS-vibra cell	VC 505	Processador ultrassônico de 500 Watts
Câmara anaeróbica de vinil	COY LAB PRODUCTS