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Artigo de método

Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

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DOI:

10.3791/61288

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13 de maio de 2020

 ,  ,  , 
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology, Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Neste artigo

Resumo

Este protocolo foi desenvolvido para estudar a transição dimer-dodecamer de TmPep1050, uma aminopeptidase M42, no nível estrutural. É um pipeline simples desde a purificação de proteínas até o processamento de dados de raios-X. A cristalogênese, a indexação do conjunto de dados e a substituição molecular foram enfatizadas através de um caso de estudo, a variante TmPep1050H60A H307A.

Resumo

As aminopeptidases M42 formam complexos funcionalmente ativos feitos de 12 subunidades. Seu processo de montagem parece ser regulado por seus cofatores de íons metálicos desencadeando uma transição dimer-dodecamer. Após a ligação de íon metálico, várias modificações estruturais ocorrem no local ativo e na interface de interação, moldando dimers para promover a auto-montagem. Para observar tais modificações, os oligômeros estáveis devem ser isolados antes do estudo estrutural. Relatado aqui é um método que permite a purificação de dodecamers estáveis e dimers de TmPep1050, um M42 aminopeptidase de T. maritima, e sua determinação estrutural por cristalografia de raios-X. Dimers foram preparados de dodecamers removendo íons metálicos com um agente quelaante. Sem seu cofator, os dodecamers tornaram-se menos estáveis e foram totalmente dissociados após o aquecimento. As estruturas oligomeméricas foram resolvidas pela abordagem de substituição molecular direta. Para ilustrar a metodologia, a estrutura de uma variante TmPep1050, totalmente prejudicada na ligação de íons metálicos, é apresentada sem mais quebra de dimers aos monômeros.

Introdução

A oligomerização é um processo predominante que dita as funções biológicas de muitas proteínas. Em Escherichia coli,estima-se que apenas 35% das proteínas são monoméricas1. Algumas proteínas, chamadas morfinas, podem até adotar vários estados oligomericos com subunidades com estrutura distinta em cada estado oligomerico2. A transição entre seus estados oligomericos é frequentemente uma média para regular a atividade proteica, pois cada estado oligomerico pode ter uma atividade ou função específica diferente. Vários exemplos de morfinas foram bem documentados na literatura, notavelmente o porfobilinogen synthase3, HPr kinase/fosphatase4, Lon protease5, lactato desidrogenase6, glicealdeído-3-fosfato desidrogenase7, pyruato kinase8, citrato synthase9, e ribonuclease A10. Recentemente, descrevemos o M42 aminopeptidase TmPep1050, outro exemplo de enzima com comportamento semelhante à morfina, cuja atividade depende de seus estados oligoméricos11. A transição entre seus estados oligoméricos é mediada por seus cofatores metálicos que induzem várias modificações estruturais das subunidades.

A família Aminopeptidase M42 pertence ao clã MH12,13, e é amplamente distribuída entre bactérias e Archaea14. As aminopeptidases M42 são enzimas dinucleares genuínas que degradam peptídeos até 35 resíduos de aminoácidos no comprimento15. Eles adotam uma estrutura peculiar em forma de tetraedro feita de 12 subunidades com seus locais ativos orientados para uma cavidade interna. Tal arranjo é frequentemente descrito como uma nano-compartimentação da atividade para evitar a proteólise descontrolada. A função fisiológica das aminopeptidases M42 pode estar associada aos peptídeos protealôs e hidrolise resultantes da degradação proteica16,17. Pyrococcus horikoshii possui quatro aminopeptidases M42, cada uma apresentando especificidades distintas, mas complementares18,19,20,21. Singularmente, heterocomplexos feitos de dois tipos diferentes de subunidades foram descritos em P. horikoshii, sugerindo a existência de complexos peptidasome22,23.

Várias estruturas de aminopeptidases M42 foram descritas na literatura11,16,18,19,20,24,25,26. A subunidade é composta de dois domínios distintos, um domínio catalítico e um domínio de dimerização. O domínio catalítico adota uma dobra de α/β comum conservada em todo o clã MH, sendo o domínio catalítico arquetípico o Aminopeptidase Ap1 do Vibrio proteolyticus27. O domínio de dimerização adota uma dobra16 semelhante a PDZ e pode ter, além de seu papel na oligomerização, um papel no controle do acesso substrato e vinculação na cavidade interna11. Como o bloco de construção básico é um dimer, o dodecamer é frequentemente descrito como a associação de seis dimers, cada escurecer sendo posicionado em cada borda do tetraedro16. A oligomerização das aminopeptidases M42 depende da disponibilidade de seus cofatores metálicos. Íons metálicos divalentos, muitas vezes Zn2+ e Co2+, estão catalíticos envolvidos na ligação de peptídeos e hidrólise. Eles são encontrados em dois locais de ligação distintos, ou seja, locais M1 e M2. Os dois íons metálicos também dirigem e ajustam finamente a oligomerização como demonstrado para PhTET2, PhTET3, PfTET3 e TmPep105011,24,28,29. Quando os cofatores metálicos estão esgotados, o dodecamer desmonta em dimers, como em PhTET2, PhTET3 e TmPep105011,16,28, ou mesmo monômeros, como em PhTET2 e PfTET324,29.

Apresentado aqui é um protocolo utilizado para estudar as estruturas de oligômeros TmPep1050. Este protocolo é um conjunto de métodos comuns, incluindo purificação de proteínas, triagem de atividade proteolítica, cristalização, difração de raios-X e substituição molecular. São enfatizadas sutilezas inerentes ao enfrentamento das metalloenzymias, oligomerização de proteínas, cristalização de proteínas e substituição molecular. Um caso de estudo também é apresentado para mostrar se os dodecamers TmPep1050 podem se dissociar ainda mais em monômeros ou não. Para abordar essa questão, uma variante TmPep1050, TmPep1050H60A H307A,foi estudada cujos locais de ligação metálica são prejudicados pela mutação de Seu-60 (local M2) e Seu-307 (local M1) para resíduos de Ala. Este protocolo pode ser acomodado para estudar outras aminopeptidases M42 ou quaisquer metalloenzymes com comportamento semelhante à morfina.

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Protocolo

1. Produção e purificação de recombinante TmPep1050

NOTA: A partir de agora são descritos o procedimento de clonagem e purificação do TmPep1050 do tipo selvagem adaptado de um estudo anterior11. Alternativamente, a clonagem pode ser feita usando um gene sintético. Para gerar variantes TmPep1050, a mutagênese direcionada ao site pode ser realizada seguindo, por exemplo, as reações de primer único no método de protocolo paralelo (SPRINP)30. O protocolo de purificação pode ser usado para variantes TmPep1050. O uso de Sua tag deve ser evitado, pois interfere na ligação de íon metálico.

  1. Design vetorial de expressão
    1. Adquirir DNA genômico de Thermotoga maritima MSB8 (ATCC 43589) ou TmCD00089984 (Joint Center for Structural Genomics).
    2. Amplie TM_1050 quadro de leitura aberto (ORF) usando DNA genômico ou plasmídeo de modelo, uma polimerase de DNA de alta fidelidade, e os seguintes primers: ocej419 (5'- TTTAACTTTAAGAAGGAGAGATATACATACCCATGAGAGAGAGAGAAGAAAGAGAGCTG) e ocej420 (5'- ATCCGCCAAAACAGCCAGAGAGGAGACCGTTTACCCCCCACCGATACCGATGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAGGAGAGAGAAGGAGAAGAGGAGAAGGAAGGAGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAAGGAGAAGGAAGGAAAGGAAGGAAAGGAAGGAAGGAAAGGAAGGAAAGGAGAAGAGGAAAGGAAGGAAGGAAAGGAGAAGAGGAAGGAAGGAAG Execute a triagem de reação em cadeia de polimerase (PCR) de acordo com o seguinte esquema: 5 min a 95 °C, 30 ciclos de 3 passos (30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C, 90 s a 72 °C) e 10 min a 72 °C como etapa final.
    3. Clone o fragmento pcr em um vetor de expressão adequado (Tabela de Materiais) por recombinação homologous (Figura 1) em E. coli de acordo com o protocolo SLiCE31. A 50 ng de vetor linearizado, adicione fragmento de PCR em uma relação molar de 10:1 de fragmento para vetor, 1 μL de extrato de cepa PPY, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP e 10 mM dithiothreitol (DTT) para um volume de reação de 10 μL. Incubar por 1 h a 37 °C.
    4. Transforme a cepa azul E. coli XL1 quimicamente competente (ou qualquer recA- cepa adequada) com 1 μL de reação de recombinação. Emplaque as células em meio LB contendo 100 μg/mL ampicillin. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
    5. Escolha colônias em placas LB frescas com 100 μg/mL ampicillin. Incubar as placas a 37 °C por pelo menos 8 h.
    6. Tela para candidatos positivos por colônia PCR usando par de primer adequado (5'- ATGCCATAGCATTTTTATCC e 5'- ATTTAATCTGTATCAGGC se usar o vetor recomendado listado na Tabela de Materiais). Com uma extremidade de micropéta, arranhe uma colônia colhida e transfira as células para 20 μL de mistura de reação contendo 0,5 μM de cada primer e 10 μL de uma mistura comercial de polimerase de DNA Taq.
    7. Execute a triagem pcr de acordo com o seguinte esquema: 5 min a 95 °C como etapa de desinaturação, 30 ciclos de 3 passos (30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C, 90 s a 72 °C) e 10 min a 72 °C como etapa final.
      NOTA: As reações do PCR podem ser armazenadas durante a noite na máquina PCR a 12 °C.
    8. Carregar 10 μL de cada reação pcr em um gel de 0,8% de agarose preparado no buffer Tris-acetato-EDTA (TAE). Execute a eletroforese por 25 min a 100 V.
      NOTA: É esperado um amplicon de 1,1 kbp.
    9. Extrair plasmídeos dos candidatos usando um kit comercial (Tabela de Materiais) e sequenciá-los usando o mesmo par de primer usado na etapa 1.1.6.
  2. Cultura celular
    NOTA: Quando um candidato adequado foi identificado por sequenciamento, o clone pode ser usado diretamente como expressão se usar o vetor recomendado (Tabela de Materiais). Nesse caso, a expressão é controlada pelo promotor PBAD 32.
    1. Inocular 10 mL de meio LB contendo 100 μg/mL ampicillin com o candidato e incubar a pré-cultura durante a noite a 37 °C sob agitação orbital. Adicione 5 mL da pré-cultura a 1 L de meio LB com ampicillina de 100 μg/mL. Lembre-se de respeitar uma relação ar/líquido de 3.
    2. Deixe as células crescerem a 37 °C sob agitação orbital. Monitore a densidade óptica a 660 nm (OD660).
    3. Quando o OD660 atingir 0,5-0,6, esfrie rapidamente a cultura por 5 minutos no gelo e transfira-a para uma incubadora a 18 °C.
    4. Adicione 0,2 g/L arabinose para induzir expressão genética e incubar por 12-18 h a 18 °C.
    5. Células de colheita centrifugando a cultura a 6.000 x g por 30 min a 4 °C. Descarte as células supernascidas e lave com 100 mL de 0,9% (c/v) NaCl.
    6. Centrifugar novamente a 6.000 x g por 15 min a 4 °C e descartar o supernaspe.
      NOTA: As pelotas celulares podem ser usadas diretamente para extração de proteínas ou armazenadas a -80 °C.
  3. Purificação de proteínas
    1. Resuspense as pelotas de células em 40 mL de 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2. Adicione 1 μL de 25 Endonuclease de DNA/RNA U/μL e um comprimido de coquetel inibidor de protease que não contém EDTA. Sonicar a suspensão no modo de pulso sob resfriamento por 30 minutos.
    2. Centrifugar o extrato bruto a 20.000 x g por 30 min a 4 °C. Colete o supernasciente e aqueça-o em um banho de água a 70 °C por 10 minutos.
    3. Centrifugar o extrato celular desnaturado a 20.000 x g por 30 min a 4 °C e coletar o sobrenante para purificação.
    4. Use resina de troca de ânion adequada(Tabela de Materiais)embalada em uma coluna de ~15 mL de volume. Consulte as recomendações do fabricante para a taxa de fluxo de trabalho e o limite de pressão da coluna. Equilibre a resina com MOPS de 50 mM, 1 mM CoCl2, pH 7.2.
    5. Carregue o supernante coletado da etapa 1.3.3 para a coluna. Monitore a absorvância do eluato a 280 nm. Quando chegar à linha de base, prossiga para a eluição.
    6. Aplique um gradiente de 0 a 0,5 M NaCl em MOPS de 50 mM, 1 mM CoCl2, pH 7.2 para 5 volumes de coluna (CV). Aguarde até que a condutividade seja estabilizada e a absorvância tenha atingido a linha de base.
    7. Aplique um gradiente final de 0,5 a 1 M NaCl em MOPS de 50 mM, 1 mM CoCl2, pH 7.2 para 1 CV.
    8. Analise algumas frações (ver Figura 2A para orientação) por eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de sódio (SDS-PAGE).
      NOTA: TmPep1050 aparece como uma banda de 36 kDa após a coloração de Coomassie. Alternativamente, a presença de TmPep1050 pode ser confirmada por ensaio de atividade (ver seção 2.1). Nesta etapa, as frações podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite.
    9. Junte as frações contendo TmPep1050 e adicione finamente pó moído de (NH4)2SO4 para obter uma concentração de 1,5 M (NH4)2SO4. Misture suavemente invertendo o tubo de cabeça para baixo até a dissolução completa.
    10. Use resina de interação hidrofóbica(Tabela de Materiais)embalada em uma coluna de ~30 mL de volume. Consulte as recomendações do fabricante para a taxa de fluxo de trabalho e o limite de pressão da coluna. Equilibre a resina com 50 mM MOPS, 1,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2, pH 7.2.
    11. Coloque a amostra na coluna e monitore a absorvência do elunato a 280 nm. Quando a absorvância atingiu a linha de base, as proteínas ligadas ao elto aplicando um gradiente de 1,5 M a 0 M (NH4)2SO4 em 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2 para 5 CV.
    12. Analise algumas frações (ver Figura 2B para orientação) por SDS-PAGE.
      NOTA: TmPep1050 aparece como uma banda de 36 kDa após a coloração de Coomassie. Alternativamente, a presença de TmPep1050 pode ser confirmada por ensaio de atividade (ver seção 2.1). Nesta etapa, as frações podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite.
    13. Acumule as frações contendo TmPep1050 e concentre-se em 2 mL utilizando unidades de ultrafiltração com corte de 30 kDa(Tabela de Materiais). Prossiga para a seção 1.4 para determinar o peso molecular.
  4. Cromatografia de exclusão de tamanho
    1. Use resina de exclusão de tamanho(Tabela de Materiais)embalada em uma coluna de ~120 mL de volume. Consulte as recomendações do fabricante para a taxa de fluxo de trabalho e o limite de pressão da coluna. Equilibre a resina com 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2, pH 7.2.
    2. Coloque a amostra na coluna e monitore a absorvência do elunato a 280 nm. Fracionar do volume morto da coluna (~0,33 CV) até o final da elução (1 CV).
    3. Meça o volume de elução para cada pico observado.
      NOTA: Para orientação, tmPep1050 dodecameric elutes a ~82 mL(Figura 3A) em condições experimentais atuais, enquanto dimeric TmPep1050, como a variante TmPep1050H60A H307A, elutes a ~95 mL(Figura 3B). Alguns TmPep1050 podem adotar ambas as formas oligomericas, como TmPep1050H60A (Figura 3C).
    4. Analise frações correspondentes às máximas e caudas dos picos observados usando SDS-PAGE.
      NOTA: TmPep1050 aparece como uma banda de 36 kDa após a coloração de Coomassie.
    5. Acumule as frações de cada pico e concentre-se utilizando unidades de ultrafiltração com corte de 30 kDa(Tabela de Materiais) para obter uma concentração de ~300 μM.
    6. Meça a absorvância a 280 nm em um espectotômetro de nano volume e calcule a concentração usando o coeficiente de extinção molecular de 18.910 M-1 cm-1.
    7. Armazene a proteína purificada a -18 °C.
    8. Para determinar o peso molecular, calibrar a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) utilizando padrões de peso molecular(Tabela de Materiais). Analise as normas utilizando MOPS de 50 mM, 0,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2 pH 7.2 como tampão em execução.

2. Ensaio de atividade e preparação de enzimas apo

NOTA: Originalmente, a apo-enzima foi preparada diluindo 1 volume de TmPep1050 em 10 volumes de 2,1 M de ácido málico pH 7.0 e concentrando-se em 1 volume antes da diálise11. Abaixo é apresentado um procedimento alternativo utilizando 1,10-phenanthroline, um ion chelator metálico. Este procedimento reduz a perda de proteínas e dá os mesmos resultados do método publicado anteriormente.

  1. Ensaio de atividade
    1. Prepare uma solução de estoque de 100mM L-Leucine-p-nitroanilide(Tabela de Materiais) em metanol.
    2. Adicione 25 μL de 100 mM L-Leucine-p-nitroanilide em 965 μL de 50 mM MOPS, 250 μM CoCl2, pH 7.2, 10% metanol. Pré-insinuque a mistura de reação a 75 °C em um banho seco.
    3. Diluir a enzima em 50 mM MOPS pH 7.2 a uma concentração de 1 μM. Adicione 10 μL à mistura de reação, vórtice e incubar a 75 °C, até que tenha se tornado amarelado ou por 1h.
    4. Pare a reação adicionando 1 mL de ácido acético de 20%. Vórtice bem e deixá-lo esfriar até a temperatura ambiente.
    5. Transfira a mistura de reação em uma célula espectrômetro. Leia a absorvência em 410 nm contra um controle negativo (mistura de reação incubada sem enzima).
  2. Preparação apo-enzima
    1. Prepare uma solução de estoque de 1 M 1,10-phenanthroline em etanol. Adicione 10 μL de solução de estoque de 1,10-phenanthroline a 890 μL de 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7.2. Adicione 100 μL de TmPep1050 purificado (concentração de 300 μM-1 mM).
    2. Verifique a perda de atividade usando o ensaio de atividade descrito na seção 2.1 sem adicionar CoCl2 na mistura de reação.
    3. Transfira a amostra em um tubo de diálise. Dialyze contra 200 mL de 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7.2 a 4 °C. Troque três vezes o dialise com tampão fresco durante a diálise de 48 horas.
    4. Colete a amostra do tubo de diálise e concentre-se de volta a 100 μL utilizando unidades de ultrafiltração com corte de 30 kDa(Tabela de Materiais). Verifique a concentração lendo a absorvância em 280 nm usando um espectrômetro de nano volume.
  3. Preparação de dimer
    1. Diluir a apo-enzima a uma concentração de 1 μM em MOPS de 50 mM, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7.2. Incubar por 2h a 75 °C em um banho seco e deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente.
    2. Concentre a amostra em uma concentração enzimática de pelo menos 50 μM. Verifique o peso molecular por SEC (ver seção 1.4). O pico de elução deve mudar de ~82 mL para ~95 mL (em condições experimentais atuais).

3. Cristalização TmPep1050

NOTA: A cristalização da proteína continua sendo uma ciência empírica, pois é um fenômeno multifatorial33. Enquanto alguns parâmetros podem ser identificados e controlados (como temperatura, pH, concentração de agentes de precipitação), outros podem influenciar de forma esquiva a cristalização (como proteína e pureza química, proteólise, histórico amostral). Atualmente, a cristalização proteica é enfrentada de forma racional e sistemática graças a um monte de condições de triagem de cristalização comercial e automação. A otimização de uma condição de cristalização, no entanto, depende principalmente de uma abordagem de tentativa e erro. A partir de agora são descritos um projeto para cristalizar proteínas e várias dicas para otimizar as condições de cristalização.

  1. Triagem de cristalização
    NOTA: Utilizando kits de cristalização comercial, foram obtidos cristais de TmPep1050 dodecamericos TmPep1050 e 0,18 M de citrato de triménico, 20% de polietileno glicol (PEG) 3350. Cristais de TmPep1050 dimérico foram obtidos em 0,1 M de citrato de sódio pH 5,6, 0,2 M de acetato de amônio, 30% PEG4000. Cristais de dodecamers aparecem dentro de uma semana e atingem seu tamanho total em um mês. Cristais de dimers geralmente aparecem dentro de 24 horas e crescem em tamanho real em uma semana.
    1. Adquira vários kits de cristalização comercial (ver Tabela de Materiais, por exemplo).
    2. Configure placas de cristalização(Tabela de Materiais)para o método de queda de suspensão. Encha os poços com 500 μL de cada solução de um kit de triagem de cristalização.
    3. Para cada poço, configure um suporte de cristalização. No suporte, deposite uma gota de 1 μL de proteína purificada (geralmente ~10 mg/mL).
    4. Imediatamente pipet 1 μL de solução de cristalização do poço. Adicione-o cuidadosamente à gota de proteína e misture suavemente por pipetar de cabeça para baixo três vezes. A queda deve permanecer semiesférica sem bolhas.
    5. Enrosque o suporte em cima do poço correspondente. Repita a operação para todo o kit.
    6. Após a configuração das placas, observe cada gota com um binóculo. Consulte o guia do usuário do kit de cristalização para interpretação (queda clara, separação de fase, precipitado, agulhas, etc.).
    7. Incubar as placas a 20 °C. Verifique as placas uma vez por dia durante a primeira semana e uma vez por semana depois.
    8. Marque cada poço usando a folha de pontuação e o guia do usuário fornecido com os kits de cristalização.
  2. Otimização de cristalização
    NOTA: As condições iniciais de cristalização do dodecameric TmPep1050 foram otimizadas para 2,1 M DL-malic ácido pH 6.75 e 0,18 M tri-amônio citrato pH 7.5, 40% (c/v) PEG3350 enquanto a condição de cristalização do dimeric TmPep1050 foi deslocada para 0,1 M de citrato de sódio pH 6.0, 10% (w/v) PEG3350. Um ciclo de semeadura tem sido necessário para melhorar a cristalina. A partir de agora é descrita como a cristalização da variante TmPep1050H60A H307A foi otimizada.
    1. Prepare soluções de estoque de 0,5 M de tampão citrato de sódio em diferentes pH (4,5, 5,2 e 6,0), e 50% (w/v) solução PEG3350.
    2. Configure uma placa de cristalização como matriz de pH vs. agente de precipitação (ver Figura 4A).
    3. Incubar a placa a 20 °C. Observe cada poço com um binóculo uma vez por dia durante uma semana.
    4. Marque cada um bem de acordo com o tamanho e a forma do cristal. Selecione uma condição que dê cristais de pelo menos 50 μm. Prossiga para microseeding.
  3. Microseeding
    NOTA: A microseada é um método poderoso para melhorar a forma, o tamanho e a cristalina dos cristais proteicos34. Uma abordagem mais rápida de semeadura é a semeadura de listras usando um bigode de gato. Veja a Figura 4 como exemplo de como a otimização da cristalização e a microseedização melhoraram a forma e o tamanho do cristal para TmPep1050H60A H307A.
    1. Prepare as sementes utilizando o poço selecionado na etapa 3.2.4.
    2. Aumente o volume de uma gota contendo cristais para 10 μL adicionando solução de cristalização do poço. Encobriu a gota e adicione 90 μL de solução de cristalização do poço. Vórtice completamente e mantenha as sementes no gelo.
    3. Prepare várias diluições das sementes: 1x, 10x, 25x e 100x. Vórtice bem as sementes antes de pipetar. Mantenha as diluições no gelo.
    4. Para cada diluição de sementes, configure uma placa de cristalização como matriz de pH vs. agente de precipitação (ver Figura 4B). Use as soluções de estoque preparadas na etapa 3.2.1.
    5. Ao fazer a queda, adicione 0,2 μL de sementes para uma queda de 2 μL. Incubar a placa a 20 °C. Observe cada poço com um binóculo uma vez por dia durante uma semana.
      NOTA: A distribuição e a forma do tamanho do cristal devem ser melhoradas, veja a Figura 4C como exemplo para TmPep1050H60A H307A. Para usos posteriores, as sementes podem ser armazenadas a -20 °C.

4. Difração de raios-X

  1. Colheita de cristal
    NOTA: A preparação da amostra depende da instalação de origem de raios-X (home facility vs. synchrotron). Use dispositivos de armazenamento (frascos e cesta de porta-frascos) em conformidade. A adição de crioprotetor (como glicerol) pode ser necessária dependendo da concentração de agente de sal/precipitação. Para cristais TmPep1050, um crioprotetor não é necessário, pois a concentração de PEG ou tampão é alta o suficiente para evitar cristais de água.
    1. Prepare um banho cheio de nitrogênio líquido, mergulhe quaisquer frascos ou cesta utilizada para manuseio de amostras.
    2. Configure loops de coleta de amostras de diferentes tamanhos: 100, 150 e 200 μm(Tabela de Materiais). Escolha os tamanhos de acordo com o tamanho do cristal.
    3. Usando um binóculo, verifique a gota contendo cristais e localiza cristais isolados (os mais fáceis de escolher). Com um loop, escolha suavemente um cristal da parte inferior. Mergulhe imediatamente o laço em nitrogênio líquido e coloque o laço em um frasco adequado.
  2. Coleta de dados
    NOTA: A coleta de dados pode variar muito dependendo da fonte de raios-X (home facility vs. síncrotron) e sensibilidade do detector. A estratégia de coleta também pode diferir muito de uma amostra para outra, dependendo da resolução, intensidade do ponto, grupo espacial, etc. O tema foi amplamente analisado pelo Dauter35.
    1. Monte o laço carregando o cristal na cabeça do goniômetro do diractómetro.
    2. Sintonize a cabeça do goniômetro ao longo dos eixos XYZ para alinhar o cristal com o caminho do feixe de raios-X.
    3. Defina o comprimento de onda para 0,98 Å e mova o detector para obter 2 Å de resolução.
    4. Inicie uma pequena coleta de dados adquirindo imagens em pelo menos duas orientações de cristal diferentes. Tire 10 imagens (1 imagem por 0,1°) a 0° e 90°.
    5. Verifique as imagens coletadas com software adequado (por exemplo, ADXV, XDS-Viewer ou Albula Viewer). Determine a intensidade do ponto e a maior resolução onde as manchas são vistas. Verifique também a monocristanidade e separação do local.
    6. Eventualmente, repita as etapas 4.2.3-4.2.5 alterando a posição do detector para maior ou menor resolução e o tempo de exposição de acordo com a observação.
    7. Inicie a coleta de dados em torno de 360° com 1 imagem tirada por 0,1°. Lembre-se de definir a posição do detector e o tempo de exposição de forma ideal.

5. Indexação, substituição molecular e construção de modelos

  1. Indexação
    NOTA: A indexação é um método para medir a intensidade dos pontos de difração, dando as amplitudes dos fatores estruturais36. Quatro pacotes de software são comumente usados para o processamento de imagens coletadas: Mosflm37,HKL200038,DIALS39e XDS40. Este último tem sido usado para indexar os conjuntos de dados obtidos a partir de difração de cristal TmPep1050.
    1. Instale o pacote XDS e o XDSME41. Se processar arquivos HDF5, instale o plugin XDS Neggia (disponível no site da Dectris). Para obter mais informações, visite xds wiki página web https://strucbio.biologie.uni-konstanz.de/xdswiki/index.php/Main_Page e página web XDSME https://github.com/legrandp/xdsme.
    2. Antes de processar dados, crie uma pasta de onde o XDS será executado. Localize o caminho para as imagens.
    3. Para executar xdsME, digite xdsme /path_to_images/image.extension em uma janela terminal.
    4. Depois que o XDS terminar o trabalho, verifique o CORRETO. Arquivo LP. Observe a probabilidade da determinação do grupo espacial, completude de dados, a maior resolução, mosaico cristalino e qualidade dos dados. Verifique também XDS_pointless.log para obter a probabilidade de grupos espaciais.
      NOTA: Veja a Figura 5 como um exemplo de saída.
    5. Reexeia o XDSME com diferentes soluções de grupo espacial propostas pelo XDS em pasta separada para evitar a substituição do processo anterior. Digite xdsme -s space_group_name -c "unit_cell_parameters" /path_to_images/image.extension (por exemplo, xdsme -s P21 -c "43.295 137.812 61.118 90.000 110.716 90.000).
    6. Verifique o CORRETO. Arquivos LP e escolha a melhor solução com base em estatísticas de dados.
    7. Execute XSCALE digitando xscale.py XDS_ASCII. HKL. Execute XDSCONV digitando xdsconv.py XSCALE. HKL ccp4.
      NOTA: Em alguns casos, o XDSME não identifica o grupo espacial ou não consegue cortar adequadamente o intervalo de resolução ou gera estatísticas de dados estranhas. Se tal problema for encontrado, vale a pena executar XDS nativamente. Vários parâmetros devem ser introduzidos no XDS. Arquivo de iniciação INP (ver página wiki XDS). Ao usar xds, a probabilidade de possíveis grupos espaciais pode ser verificada usando pointless, parte do pacote CCP442. Para cortar a resolução do conjunto de dados, Rmeas < 60% e I/σ ~2 são comumente aceitos para determinar a resolução mais alta43. O refinamento molecular e o refinamento do modelo, no entanto, podem ser melhorados estendendo a resolução para I/σ ~0,5−1,5 e CC1/2 para 0,2−0,444.
  2. Substituição molecular
    NOTA: Os dados experimentais dão acesso à amplitude dos fatores estruturais, mas, sem conhecer a fase, são inúteis. A fase pode ser determinada experimentalmente por diferentes métodos que dependem de um sinal anômroo (de um átomo pesado, por exemplo)45. A substituição molecular é outro método para determinar a fase sem um átomo de dispersão anômeo46,47. Este método usa as coordenadas de uma molécula relacionada para encontrar e melhorar a fase iterativamente. Usamos phaser48 em Phenix GUI49 para substituição molecular.
    1. Prepare o modelo de partida para substituição molecular usando coordenadas 4P6Y. A partir do arquivo pdb, extraia o monômero A e truncar seus aminoácidos em alanina usando o editor de arquivos PDB em Phenix (sob a guia ferramentas Model).
    2. Execute Xtriage em Phenix (sob a guia de análise de dados) com o arquivo de reflexão gerado por XDSCONV (5.1.9) e a sequência como entradas.
    3. Verifique o arquivo de registro de Xtriage. Note a completude, o número de subunidades na unidade assimétrica, a anisotropia, a presença de anéis de gelo e a ocorrência de twinning.
    4. Execute Phaser-MR em Phenix (sob a guia de substituição molecular) para substituição molecular usando o arquivo de reflexão, a sequência e o modelo 4P6Y inicial truncado em poli alanina (etapa 5.2.1).
    5. Após a conclusão, verifique se um modelo foi encontrado e a pontuação da substituição molecular. Um fator de tradução Z-score (TFZ) de pelo menos 8 indica que a solução está definitivamente correta.
  3. Construção de modelo
    NOTA: Após determinar a fase por substituição molecular, o modelo deve ser construído e refinado. Este protocolo usa o Phenix GUI49 para construção automática e refinamentos iterativos, e Coot50 para construção e refinamento de estruturas manuais.
    1. Após substituição molecular usando Phase-MR em Phenix, selecione Executar Autobuild. Todos os arquivos necessários serão adicionados automaticamente. Basta pressionar Executar para iniciar a autoconsilhada.
    2. Após a conclusão, verifique o modelo em Coot. Construa e refine o modelo manualmente de acordo com o mapa de densidade eletrônica em Coot.
    3. Refine o modelo com curadoria manual em Phenix (na guia Refinamento) usando o modelo, a sequência e os dados de difração como entradas. Consulte a ajuda da Phenix para escolher a estratégia certa.
    4. Após o refinamento, verifique os resultados: Otrabalho livre de R e R deve diminuir, os indicadores Molprobity51 devem ser respeitados, e os outliers com baixa correlação de espaço real devem ser limitados.
    5. Repetir as etapas 5.3.2-5.3.4 até que o melhor modelo refinado seja gerado.
    6. Execute Molprobity no servidor: http://molprobity.biochem.duke.edu/. Confira todos os outliers identificados por Molprobity.
    7. Eventualmente, repita as etapas 5.3.2-5.3.6 até que o melhor modelo refinado seja obtido.

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Resultados

Para estudar uma possível dissociação dodecamer em monômeros em TmPep1050, os códons His-60 e His-307 foram substituídos por codons alanino usando um gene sintético. Este gene foi então clonado no vetor pBAD para expressão e purificação da variante TmPep1050 correspondente posteriormente chamada TmPep1050H60A H307A. A cromatografia de exclusão de tamanho(Figura 3B)mostrou que a proteína purificada tinha um peso molecular aparente de 56 kDa (peso molecular do monômero sendo 36,0 kD...

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Discussão

O protocolo aqui descrito permite compreender a transição dimer-dodecamer de TmPep1050 no nível estrutural. A metodologia foi experimentada anteriormente para determinar a estrutura de ambos os oligômeros TmPep105011. O passo mais desafiador foi encontrar condições que promovessem a dissociação dos dodecamers em escurecimentos estáveis. Tais condições tinham que ser leves o suficiente para permitir a reassociação de dimers em dodecamers quando o cofator de íons metálicos foi adicionado. A separaçã...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Martine Roovers por revisar este artigo e fazer comentários construtivos. O acesso à linha de feixe Proxima 2 (síncrotron SOLEIL) estava dentro dos Grupos de Alocação de Blocos 20151139.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,10-fenantrolinaSigma-Aldrich13, 137-7
Amicon Ultra 0,5 ml Filtros Centrífugos Ultracel 30KMerck MilliporeUFC503096
Amicon Ultra 15 Filtros Centrífugos Ultracel 30KMerck MilliporeUFC903024
Benzonase NucleaseMerck Millipore70664-3
CCP4N/Avisite http://www.ccp4.ac.uk/
Roche5056489001Coot
N/Acompleto visite https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Tela de cristal IHampton ResearchHR2-110
Tela de cristal IIHampton ResearchHR2-112
DreamTaq Green PCR Master MixThermoFisher Ferramenta ScientificK1082
EasyXtal de 15 poçosNeXtal132007
Escherichia coli PPY cepaN/Aver referência 31
Escherichia coli XL1 cepa azulKitem Gel Agilent 200249
HMWGE Healthcare Life Sciences28-4038-42
Kit de Calibração de Filtração em Gel LMWGE Ciências da Vida em Saúde28-4038-41
Padrão de Filtração em GelBiorad1511901
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermoFisher ScientificK0503
ÍndiceHampton ResearchHR2-144
LitholoopsDimensões Moleculares
L-leucina-p-nitroanilidaBachem AG
Natrix 1Hampton ResearchHR2-116
Natrix 2Hampton ResearchHR2-117
Plug-in NeggiaDectrisN/Avisite https://www.dectris.com/
Tubos NeXtal JCSG Core Suite INeXtal130724
Tubos NeXtal JCSG Core Suite IINeXtal130725
Tubos NeXtal JCSG Core Suite IIITubos NeXtal130726
NeXtal JCSG Core Suite IVNeXtal130727
pBAD-TOPOThermoFisher ScientificK430001
PhenixN/Avisita https://www.phenix-online.org/
Phusion DNA polimerase de alta fidelidadeThermoFisher ScientificF-530L
Sal RX 1Hampton ResearchHR2-107
Sal RX 2Hampton ResearchHR2-109
Tubo de Diálise SnakeSkin, 3.5KMWCO ThermoFisher Scientific88242
Fonte 15PheGE Healthcare Life Sciences17014702
Fonte 15QGE Healthcare Life Sciences17094705
Superdex 200 grau de preparaçãoGE Healthcare Life Sciences17104301
Thermotoga maritima MSB8 cepaAmerican Type Culture CollectionATCC 43589
TmCD00089984DNASU Plasmid RepositoryN/A
XDSN/Avisita http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsmeN/Avisita https://github.com/legrandp/xdsme
sem EDTA de Calibração de Filtração 40010720025

Referências

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