Ensaios para validação de inibidores de acetiltransferase histone

Resumo

Inibidores de acetiltransferases de histona (HATs, também conhecidos como acetiltransferases de lisina), como CBP/p300, são potenciais terapêuticos para o tratamento do câncer. No entanto, são necessários métodos rigorosos para validar esses inibidores. Três métodos in vitro para validação incluem ensaios HAT com acetiltransferases recombinantes, imunoblotting para acetilação de histona na cultura celular, e ChIP-qPCR.

Resumo

Acetiltransferases de lysina (KATs) catalisam acetilação de resíduos de lisesina em histones e outras proteínas para regular a dinâmica da cromatina e a expressão genética. Os TRTs, como o CBP/p300, estão sob intensa investigação como alvos terapêuticos devido ao seu papel crítico na tumorgênese de diversos cânceres. O desenvolvimento de novos inibidores de moléculas pequenas visando a função histone acetyltransferase (HAT) dos KATs é desafiador e requer ensaios robustos que podem validar a especificidade e potência dos inibidores potenciais.

Este artigo descreve um pipeline de três métodos que fornecem rigorosa validação in vitro para novos inibidores de HAT (HATi). Estes métodos incluem um ensaio hat do tubo de ensaio, ensaio de inibição de hiperacetilação de Chromatina (ChHAI) e PCR quantitativo de imunoprecipitação de Chromatina (ChIP-qPCR). No ensaio hat, hats recombinantes são incubados com histones em uma reação de tubo de ensaio, permitindo acetilação de resíduos específicos de lisesina nas caudas de histona. Esta reação pode ser bloqueada por um HATi e os níveis relativos de acetilação de histona específica do local podem ser medidos através de imunoblotação. Os inibidores identificados no ensaio hat precisam ser confirmados no ambiente celular.

O ensaio chhai usa imunoblotting para tela para o novo HATi que atenua a robusta hiperacetilação de histones induzidos por um inibidor de histon deacetilase (HDACi). A adição de um HDACi é útil porque os níveis basais de acetilação de histona podem ser difíceis de detectar através da imunoblotação.

Os ensaios HAT e ChHAI medem as mudanças globais na acetilação de histona, mas não fornecem informações sobre acetilação em regiões genômicas específicas. Portanto, o ChIP-qPCR é usado para investigar os efeitos do HATi nos níveis de acetilação de histona em elementos regulatórios genéticos. Isso é realizado através da imunoprecipitação seletiva de complexos histono-DNA e análise do DNA purificado através de qPCR. Juntos, esses três ensaios permitem a validação cuidadosa da especificidade, potência e mecanismo de ação da nova HATi.

Introdução

As acetiltransferases de lysina (KATs) catalisam a acetilação de resíduos de lisesina nas proteínas histona e não histona^1,,2,,3,,4. Pesquisas recentes revelam que os KATs e sua função acetiltransferase podem promover o crescimento sólido do tumor^4,5,6,7,8,9. Por exemplo, a proteína de ligação CREB (CBP)/p300 são dois KATs paralogos que regulam i....

Protocolo

1. Ensaio in vitro HAT

1. Preparação de buffer
   NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter receitas de tampão.
   1. Prepare 5x tampão de ensaio e 6x Sulfato de Dodecyl de Sódio (SDS) e armazene a -20 °C. Aliquot SDS em alíquotas de 1 mL.
   2. Prepare o tampão de corrida de gel SDS 10x e 10x TBST e armazene à temperatura ambiente.
   3. Prepare 1x tampão de transferência e armazene a 4 °C.
      ATENÇÃO: Verifique a ficha técnica de segurança de todos os produtos químicos utilizados neste protocolo. SDS, DTT e azul bromofenol são tóxicos e não devem ser ingeridos, inalados ou expostos à pele ou aos olhos. Consulte a fich....

Resultados

O ensaio in vitro histone acetyltransferase (HAT) pode ser usado para sondar compostos que inibem a atividade p300 HAT em direção a um substrato de histona. A Figura 1A fornece um esquema experimental para o ensaio hat. O ácido anacácárico, um conhecido HATi^3,38, foi utilizado neste ensaio em uma faixa de concentração de 12,5-100 μM. A 100 μM, o ácido anacárico diminui a p300 catalisada acetilação histona em Histone 3, Lysines 9 e 18.......

Discussão

Acetiltransferases de lysina (KATs) acetilamam vários resíduos de lisesina nas caudas de histona e fatores de transcrição para regular a transcrição genética^2,3. O trabalho nas últimas duas décadas revelou que os KATs, como CBP/p300, PCAF e GCN5, interagem com fatores de transcrição oncogênica e ajudam a impulsionar o crescimento do tumor em vários tipos de tumores sólidos^4,5,,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129	Para todos os métodos
Prato de 10 cm	Sarstedt AG & Co.	83.3902	Para cultura de células MCF-7
10 pontas ul	Fisher Scientific	02-707-454	Para todos os métodos
1000 pontas ul	Corning	4846	Para todos os métodos
10X tampão			glicina Para o método 3. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
		de execução 10X	para os métodos 1 e 2. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
10X TBST			para os métodos 1 e 2. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
Placa de 12 poços	Corning	3513	Para o Método 2
Prato de 15 cm	Sarstedt AG & Co.	83.3903	Para o Método 3
Tubo cônico de 15 ml	Santa Cruz Biotechnology	sc-200249	Para os Métodos 2 e 3
1X TBST com 5% de leite e 0,02% de Azida de			Para os Métodos 1 e 2. Pode ser usado para diluir anticorpos primários que serão usados mais de uma vez. Permite o armazenamento de curto prazo de diluições primárias de anticorpos. Não use para diluição de anticorpos secundários. CUIDADO: A azida sódica é tóxica.
1X TBST com 5% de leite			para os métodos 1 e 2. Usado para bloquear a membrana de PVDF e para dilatações de anticorpos. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
200 pontas ul	Corning	4844	Para todos os métodos
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	para preparação de tampão de amostra SDS
4-20% gel de poliacrilamida	Thermo Fisher: Invitrogen	XP04205BOX	Para os métodos 1 e 2
Tampão			Para o método 1. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
5X Buffer			para o Método 2. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
6X Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)			Para os Métodos 1 e 2. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
A-485	MedChemExpress	HY-107455	CBP/p300 Inhbitor para uso nos Métodos 2 e 3. Dissolvido em DMSO.
Anticorpo acetil-CBP (K1535) / p300 (K1499)	Tecnologia de sinalização celular	4771	para o método 1
Acetil-CoA	Sigma-Aldrich	A2056	para uso no método 1
Anticorpo acetil-histona H3 (Lys 27) (H3K27ac)	Tecnologia de sinalização celular	CST 8173	antoibodies para H3K27ac para immunoblots e anticorpo ChIP
Acetil-histona H3 (Lys18) (H3K18ac)	Tecnologia de sinalização celular	CST 9675	antoibodies para H3K18ac para immunoblots e
anticorpo da tubulina alfa	Millipore Sigma	T5168	para o método 2. Diluir 1:20.000
ácido anacárdico	Cayman Chemical	13144	Para o Método 1
anticorpo secundário ligado a IgG HRP	Tecnologia de Sinalização Celular	7076	Para os Métodos 1 e 2. Diluir o
anticorpo secundário IgG anti-coelho	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	para os métodos 1 e 2. Diluir 1:10.000 a 1:20.000
Filme de autorradiografia	MIDSCI	BX810	Para os métodos 1 e 2
Plataforma rotativa da dançarina do ventre	Stovall Life Science Incorporated	não disponível	Para os métodos 1 e 2
Soro de bezerro bovino (BCS)	HyClone	SH30072.03	meio de cultura de células
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	para preparação de tampão
Azul de bromofenol	Sigma-Aldrich	B0126	para preparação de tampão de amostra
SDS CDTA	Spectrum Chemical	125572-95-4	Para raspador de célula de preparação de buffer
	Millipore Sigma	CLS3010	Para o Método 3
Tampão			Para o Método 3. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
		eluição ChIP	para o método 3. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
DMEM completo para células MCF-7 para os			métodos 2 e 3. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
Covaris 130 µ l microTUBE	Covaris	520045	Tubo de sonicação para uso com Covaris S220 no Método 3
Covaris S220 Ultrassonicador focalizado	Covaris	S220	DNA sonicator para uso no Método 3
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	41639	para diluição de drogas e tratamento de controle de veículos
DL-Ditiotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815	para tampão de amostra SDS preparação
DMEM	Corning	10-013-CV	meio de cultura de células
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	para preparação de tampão
Exemplo de tanque de transferência e aparelho de transferência	Bio-rad	1704070	Para os Métodos 1 e 2
EZ-Magna ChIP A/G Kit de Imunoprecipitação de Cromatina	Millipore Sigma	17-10086	Para o Método 3
FK228 ( Romidepsin)	Cayman Chemical	128517-07-7	Inibidor de HDAC para uso no Método 2
Solução de formaldeído	Sigma-Aldrich	F8775	para fixação celular
glicerol	Fisher Scientific	BP229-1	Para preparação de tampão
glicina	Sigma-Aldrich	G7126	para preparação de tampão
HEPES	Sigma-Aldrich	54457	para tampão
de preparação de tampão Tampão			Para o Método 3
IGEPAL (NP-40)	Sigma-Aldrich	I3021	para preparação de tampão
Substrato de HRP Quimioluminescente Immobilon	Millipore Sigma	WBKLS0500	Para Métodos 1 e 2
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	para preparação de tampão
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650	Para preparação do tampão
, tampão			Para o Método 3. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
		de lavagem com baixo teor de sal	Para o Método 3. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
Separador Magnético	Promega	Z5341	Para uso no Método 3
Metanol	Sigma-Aldrich	494437	Para preparação de tampão
Mini tanque de gel	Invitrogen	A25977	Para Métodos 1 e 2
MS-275 (Entinostat)	Cayman Chemical	209783-80-2	Inibidor de HDAC para uso no Método 2. Dissolvido em DMSO.
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	para preparação de tampão
NaOH	Fisher Scientific	S318-100	para preparação de tampão nos Métodos 1 e 2
Normal Rabbit IgG	Bethyl Laboratories	P120-101	Anticorpo de controle de coelho para uso no Método 3
Tampão			Para o Método 3. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
Kit de Limpeza de PCR	Qiagen	28104	Para uso no Método 3
Penicilina/Estreptomicina 100X	Corning	30-002-CI	meio de cultura celular
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Corning	21-040-CV	Para Métodos 2 e 3
PIPES	Sigma-Aldrich	80635	para preparação de tampão
leite em pó	Nestlé Cravo		Para Métodos 1 e 2
Power Pac 200 para transferência de western blot	Bio-rad		Para os Métodos 1 e 2
Power Pac 3000 para gel SDS rodando	Bio-rad		Para os Métodos 1 e 2
Escada de Proteína Prestained	Thermo Fisher	26616	Para Métodos 1 e 2
Coquetel de Inibidor de Protease	Sigma-Aldrich	PI8340	para uso no Método 3
Proteína A Magentic Beads	New England BioLabs	S1425S	Para uso no Método 3
Proteinase K	New England BioLabs	P8107S	Para uso no Método 3
PTC-100 Controlador Térmico Programável	MJ Research Inc.	PTC-100	para Método 1
Membrana de Transferência de PVDF	Millipore Sigma	IEVH00005	para Métodos 1 e 2
Recombinante H3.1	New England BioLabs	M2503S	para uso no Método 1
Recombinante p300	ENZO Life Sciences	BML-SE451-0100	para uso no Método 1
SAHA (Vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Inibidor de HDAC para uso no Método 2
		de lise SDS	Para o Método 3. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
Azida de sódio	Fisher Scientific	26628-22-8	para os métodos 1 e 2. CUIDADO: A azida sódica é tóxica. Consulte SDS para manuseio adequado.
Bicarbonato de sódio	Fisher Scientific	S233-500	para preparação de tampão
Desoxicolato de sódio	Sigma-Aldrich	D6750	para preparação de tampão
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Sigma-Aldrich	71725	para preparação de tampão de amostra
SDS Bloco de calor padrão	VWR Scientific Products	MPN: 949030	Para os métodos 1 e 2
Tampo da mesa centrífuga	Eppendorf	5417R	Para todos os métodos
Tampão			Para o Método 3. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
Buffer			Para os métodos 1 e 2. Consulte a Tabela 1 para obter a receita.
Trichostatin A	Cayman Chemical	58880-19-6	Inibidor de HDAC para uso no Método 2
Tris	Fisher Scientific	BP152-5	para preparação de tampão
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	para preparação de tampão
Tween 20	Sigma-Aldrich	9005-64-5	para preparação de tampão nos Métodos 1 e 2
Processador	de filme de raios-XKonica Minolta Médica & Gráfico, Inc.	SRX-101A	para os métodos 1 e 2

Buffer Sódio de ensaio 5X de lise passiva de ChIP de camundongo 1:10.000 de diluição ChIP Tampão de de lavagem com alto teor de sal de lavagem LiCl Tampão de inchaço de núcleos Tampão TE de transferência