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Artigo de método

Um ensaio automatizado de coloração nuclear diferencial para determinação precisa da citotoxicidade mitocana

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DOI:

10.3791/61295

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12 de maio de 2020

 ,  , 
1Department of BioSciences, Rice University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo descreve um ensaio rápido, de alto rendimento, confiável, barato e imparcial para determinar eficientemente a viabilidade celular. Este ensaio é particularmente útil quando as mitocôndrias das células foram danificadas, o que interfere com outros ensaios. O ensaio utiliza a contagem automatizada de células manchadas com dois corantes nucleares – Hoechst 33342 e iodeto de propidium.

Resumo

A contribuição das mitocôndrias para a transformação oncogênica é um assunto de amplo interesse e estudo ativo. À medida que o campo do metabolismo do câncer se torna mais complexo, o objetivo de atingir mitocôndrias usando vários compostos que infligem danos mitocondriais (os chamados mitocanos) está se tornando bastante popular. Infelizmente, muitos ensaios de citotoxicidade existentes, como aqueles baseados em sais de tetrazolium ou resazurina, requerem enzimas mitocondriais funcionais para seu desempenho. O dano infligido por compostos que atingem mitocôndrias muitas vezes compromete a precisão desses ensaios. Aqui, descrevemos um protocolo modificado baseado em coloração diferencial com dois corantes fluorescentes, um deles é permeante celular (Hoechst 33342) e o outro não é (iodeto de propidium). A diferença na coloração permite que células vivas e mortas sejam discriminadas. O ensaio é amenável à microscopia automatizada e à análise de imagens, o que aumenta o throughput e reduz o viés. Isso também permite que o ensaio seja usado de forma de alta produtividade usando placas de 96 poços, tornando-se uma opção viável para os esforços de descoberta de drogas, particularmente quando as drogas em questão têm algum nível de mitotoxicidade. É importante ressaltar que os resultados obtidos pelo ensaio de coloração de Hoechst/PI mostram maior consistência, tanto com resultados de exclusão azul trypan quanto entre réplicas biológicas quando o ensaio é comparado a outros métodos.

Introdução

O primeiro passo para identificar tratamentos eficazes contra o câncer é a seleção de um robusto e imparcial ensaio de citotoxicidade que pode ser usado para examinar o efeito do tratamento. Uma escolha comum para experimentos de baixo rendimento é a exclusão do corante azul trypan das células vivas. Este método é favorecido porque permite um método relativamente imparcial para quantificar a sobrevivência celular. trypan azul passivamente difunde em células cujas membranas estão comprometidas, mas é efetivamente impedido de entrar em células saudáveis1. O quociente das células vivas e do total das células representa a viabilidade percentual, o que indica a eficácia do tratamento. A desvantagem mais significativa do ensaio azul trypan é que ele é mal adequado para metodologias de alta produtividade. Tem uma relação sinal-ruído relativamente baixa e a coloração prolongada pode resultar em artefatos devido à coloração de células viáveis. Consequentemente, a exclusão azul trypan é tipicamente, mas nem sempre2, relegada à contagem manual. Isso o torna muito lento e introduz a forte possibilidade de viés devido ao julgamento subjetivo do pesquisador (a menos que sejam utilizadas contagens cegas ou independentes, o que reduz ainda mais o rendimento laboratorial). Em geral, o rendimento deste ensaio é insuficiente para a descoberta moderna de drogas.

Os ensaios de viabilidade, que geralmente têm um rendimento muito maior, permitem que os pesquisadores contornem essa limitação, mas vêm com ressalvas significativas (ver Tabela 1). Esses métodos geralmente se enquadram em dois grupos. Um grupo é composto por ensaios colorimétricos que são baseados na função das enzimas de redox celular. Substratos incolores ou não fluorescentes são convertidos em produtos vibrantes que podem ser quantificados usando um espectrofotômetro. Exemplos clássicos incluem sais de tetrazolium (MTT, WST-1, XTT, etc.) e resazurina. Esta categoria também inclui ensaios luminescentes que utilizam luciferina para avaliar o nível ATP. Ensaios deste tipo têm a limitação subjacente de que eles estão medindo o metabolismo celular, que não é a viabilidade celular em si. É bastante comum que as células se tornem quiescentes em condições adversas, mas ainda mantêm a capacidade de dividir3,4,5. Por exemplo, as células-tronco cancerígenas são muitas vezes relativamente metabolicamente quiescentes6,7,8,9, e são susceptíveis de ser difíceis de avaliar usando essas técnicas. A eficácia de tratamentos que prejudicam a função mitocondrial, como a maioria dos mitocanos, também é provável que seja significativamente superestimada.

Uma metodologia alternativa aproveita as propriedades químicas de várias substâncias que lhes permitem atravessar ou não membranas biológicas. Um exemplo são manchas nucleares como SYTOX ou propidium iodide (PI). Esta categoria também inclui ensaios semelhantes no conceito, mas diferentes em função, como o ensaio lactato desidrogenase (LDH), que mede a liberação de LDH no meio extracelular como um indicador de necrose celular(Figura 1,Tabela 1). Estes ensaios são mais capazes de distinguir entre células metabolicamente inativas e mortas.

Ensaio/coranteTipos(s) de morte celular detectadaEquipamento necessárioPrincipais características
MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurin)Apoptose/NecroseEspectrofotômetroBarato, rápido; ensaio de ponto final; dependente da atividade das enzimas (exclusivamente mitocondrial no caso de MTT) e não discrimina entre modos de morte celular1,10
Lançamento do LDHNecroseEspectrofotômetroRápido, independente da atividade das enzimas mitocondriais; caro para testes de alto rendimento; detecta células necróticas com membrana plasmática compromizada11,12
Trypan Blue (TB)Apoptose/NecroseMicroscópioCélula-impermeável; não discrimina entre modos de morte celular; laborous e não é adequado para triagem de alto rendimento; mais difícil de usar com células aderentes; propenso a julgamento subjetivo do usuário, mas é considerado o método padrão de medição de viabilidade celular13
Laranja acridina (AO)Apoptose/Necrose/Microscópio de fluorescênciaUm corante de ácido nucleico com propriedades espectrais únicas, pode distinguir entre apoptose e necrose/necroptose14
Necroptose
Hoechst 33342, DAPIApoptoseMicroscópio de fluorescência ou citômetro de fluxoCélula permeável; inapropriado por si só para monitorar a morte celular; útil para a co-coloração; podem ser utilizados para avaliar a condensação da cromatina e a fragmentação dos núcleos na apoptose precoce; pode ser emparelhado com iodeto propidium para distinguir apoptose da necrose15,16
Iodeto de propidium (PI)Apoptose tardia/NecroseMicroscópio de fluorescência ou citômetro de fluxoIntercalador de células impermeável; detecta os modos de apoptose tardia e necrose da mortecelular 17. Tóxico e permeável após longos tempos de incubação18

Mesa 1. Lista de ensaios de citotoxicidade. Ensaios de citotoxicidade, alguns dos quais foram utilizados neste estudo, listados juntamente com a breve descrição de suas principais características.

Estudos recentes demonstraram que o metabolismo mitocondrial é alterado em alguns cânceres19,20,21,22,23,24,25. Por exemplo, leucemias mielóides agudas (LMA) têm sido mostradas para aumentar sua massa mitocondrial, conteúdo mtDNA e respiração mitocondrial para atender às suas demandas energéticas19,26,27. Por outro lado, alguns tumores sólidos são caracterizados por disfunção mitocondrial, ou melhor, "reprogramação metabólica", como a redução da regulação de proteínas mitocondriais envolvidas no OXPHOS ou diminuição do teor de MTDNA, que tem sido associada à invasão tumoral, potencial metastático e resistência a medicamentos indutores de apoptose28,29. Além disso, recentemente, houve um aumento do interesse em usar compostos mecanicamente diversos que afetam a função mitocondrial (geralmente chamadas mitocans30), como terapias potenciais para determinados cânceres. Essas drogas têm como alvo a síntese ATP, DNA mitocondrial, OXPHOS e produção ros, bem como proteínas pró-apoptóticas e anti-apoptóticas associadas às mitocôndrias30,31. Vários estudos têm demonstrado que essa abordagem tem uma promessa significativa19,32,33,34. No entanto, esses desvios metabólicos na biologia celular do câncer ou tratamentos direcionados a mitocôndrias podem afetar significativamente ensaios de viabilidade convencional que são baseados na funcionalidade mitocondrial.

Aqui, é descrito um protocolo otimizado para um ensaio diferenciado de coloração nuclear. O protocolo permite uma determinação rápida e precisa da citotoxicidade das mitocanas ou suas combinações com outros compostos. Hoechst 33342 é um corante nuclear permeante celular que prontamente cruza as membranas celulares para manchar o DNA, permitindo que a contagem total de células seja obtida. Ao co-coloração com PI, que só entra nos núcleos de células mortas, a proporção de células vivas (somente hoechst) e mortas (manchadas com ambas) podem ser determinadas com precisão. Este protocolo refina o ensaio publicado35 adicionando um passo para a otimização da concentração de corante (cruzando resultados com método azul de trippan ortogonal) e centrifugação da placa antes da imagem. Como muitas linhas celulares são semi-aderentes ou suspensas, a centrifugação aumenta a proporção de células que são imagens e melhora fortemente a precisão. O ensaio tem várias vantagens, incluindo que a coloração não requer remoção de mídia ou lavagem. A mistura de corante também é barata, fácil de preparar e compatível com sistemas multicanais/robóticos de tubulação.

Depois que as células foram manchadas, elas são imagens com um microscópio automatizado. Isso tem a vantagem adicional de criar um registro permanente das imagens que podem ser re-analisadas posteriormente e os efeitos de determinados compostos podem ser reavaliados por inspeção visual de imagens capturadas. Uma vez obtidas imagens, as células podem ser contadas manualmente ou usando qualquer um dos vários pacotes de software, incluindo tanto gratuitos (por exemplo, ImageJ, CellProfiler, etc) quanto software comercial (por exemplo, Metamorfo, Gen5, etc). A contagem automatizada de células é geralmente preferível, uma vez que os pipelines automatizados de contagem de células desenvolvidos adequadamente são mais precisos e menos tendenciosos do que as contagens manuais. Eles também desconsideram mais efetivamente detritos celulares ou complexos insolúveis. O desenvolvimento desses gasodutos é geralmente simples e é simplificado pela eficiência das manchas utilizadas. A saída é quantitativa, uma vez que o número real de células mortas é calculado automaticamente em relação ao número total da célula, e diferentes limiares podem ser aplicados para aumentar ou diminuir a stringency da detecção35. Para conveniência, parâmetros otimizados para contar células usando o software Gen5 v. 3.00 compatível com software Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader estão incluídos.

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Protocolo

1. Ensaio de Citotoxicidade: Configuração

  1. Preparar soluções de compostos de interesse em concentrações desejadas nos meios de comunicação apropriados (sem soro ou 1, 2,5 ou 5% FBS RPMI-1640).
    1. Para medir a citotoxicidade de um único composto (por exemplo, para determinar doses eficazes), prepare os compostos em 2x concentração final.
    2. Para medir a citotoxicidade das combinações compostas, prepare os compostos em 4x concentração final.
    3. Prepare controles somente de solventes misturando a mesma quantidade de solvente com o meio apropriado. Por exemplo, se os compostos de teste dissolvidos em DMSO e metanol, faça um controle somente de solvente para cada solvente.
  2. Coletar células de prato de cultura ou frasco em um tubo cônico de 15 mL.
  3. Transfira 10 μL de suspensão celular para um tubo de microcentrifutura e colora com 10 μL 0,4% azul trypan. Use um hemótmetro para contar células viáveis e inviáveis para cada fonte celular.
  4. Células de pelotas a 200 g por 5 min. Aspirado ou decantante.
  5. Pelota de célula resuspenda em mídia apropriada para ensaios (sem soro ou 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) a uma densidade celular de 3*105 células/mL.
    NOTA 1: A densidade celular de 3*105 células/mL fornece uma densidade de semeadura de 15.000 células/bem. A densidade de semeadura é um parâmetro importante e, idealmente, deve ser pré-definida antes do experimento. A densidade de semeadura deve levar em conta o tamanho das células 1 – geralmente as células maiores são semeadas a uma densidade menor; 2) duração do tratamento – as células são tipicamente semeadas em menor densidade para experimentos que durarão mais; e 3) taxa de divisão celular – as células com maior taxa de divisão são semeadas a uma densidade menor. Exemplos específicos de densidades otimizadas de semeadura: células K562, maiores, 24h de duração – 10.000 células/poço; Células MOLM-13, tamanho moderado, tratamento de 24h – 15.000/bem; Células MOLM-13, tratamento de 48h – 8.000/poço; pequenas células mononucleares periféricas saudáveis (PBMCs), tratamento de 24h – 50.000/bem; células LMA primárias, tratamento de 24 h – 15.000-20.000/bem.
    NOTA 2: A presença de FBS na mídia pode afetar a atividade dos compostos. Reduzir a concentração de FBS pode tornar os resultados de ensaio mais simples de interpretar, mas também reduz a precisão fisiológica.
  6. Semente 50 μL de suspensão celular a partir da etapa 1.5 em cada poço de uma placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal.
  7. Adicione compostos da seguinte forma:
    1. Para ensaios compostos únicos, adicione 50 μL de solução composta de 2x em cada poço. Para poços de controle de solventes, adicione 50 μL de mídia de teste contendo o solvente na concentração de 2x.
    2. Para ensaios de combinação, adicione 25 μL de cada um dos compostos (soluções 4x) em cada poço. Para poços de controle composto único, adicione 25 μL de solução composta 4x e 25 μL de meio de teste. Para poços de controle de solventes, adicione 50 μL de meio de teste ou meio de teste contendo o solvente.
      NOTA 1: A concentração final do DMSO não deve exceder 0,5%.
      NOTA 2: Recomenda-se adicionar a mídia que contém os compostos com a pipeta tocando a parede de cada poço devido ao baixo volume.
  8. Bata suavemente na placa para garantir a mistura do conteúdo dos poços.
  9. Incubar placas a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 por um tempo adequado, por exemplo, 24 h.

2. Ensaio de Citotoxicidade: coloração com Hoechst 33342 e iodeto de propidium

  1. Prepare a solução de coloração 10x. Esta solução precisa ser preparada fresca antes de cada experimento, não pode ser armazenada. As concentrações finais de corante devem ser determinadas antes do experimento.
    1. Para linhas celulares de leucemia e células primárias de leucemia, 1 mL de tampão de coloração de 10x contém 10 μL de 20 mM Hoechst 33342 e 50 μL de 1 mg/mL propidium iodida em PBS estéril (concentrações finais: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).
    2. Para PBMCs saudáveis, 1 mL de tampão de coloração de 10x contém 10 μL de 20 mM Hoechst 33342 e 10 μL de 1 mg/mL de iodeto de propidium em PBS estéril (concentrações finais: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL).
      NOTA: A concentração final de iodeto de propídio deve ser determinada antes dos experimentos. As células devem ser testadas usando uma gama de concentrações de PI (1, 2,5, 5 μg/mL), e então a viabilidade calculada por Hoechst/PI deve ser comparada com a viabilidade medida via azul trypan. As concentrações de PI listadas acima foram escolhidas com base na viabilidade celular-alvo em poços de controle de mídia (acima de ~90% para linhas celulares de leucemia, acima de ~70% para PBMCs saudáveis).
      ATENÇÃO: Hoechst 33342 e iodeto de propidium são potenciais cancerígenos. Use equipamentos de proteção individual adequados ao manuseá-los.
  2. Após a incubação, use uma pipeta multicanal para adicionar 10 μL de tampão de coloração de 10x a cada poço.
    NOTA: Para evitar contaminação cruzada, certifique-se de que as pontas da pipeta não toquem na mídia.
  3. Bata suavemente na placa para misturar e limpar bolhas. Mancha a 37 °C por 15 min.
  4. Centrifugar a placa a 200 g por 4 minutos para trazer todas as células para o fundo da placa. Limpe cuidadosamente a parte inferior da placa com um kimwipe úmido para remover fibras e/ou detritos que interferirão com a imagem.
    NOTA 1: A centrifugação da placa garante as maiores chances de todas as células serem capturadas na imagem. Muitas vezes as células mortas se desprendem e flutuam, fornecendo valores enganosos de citotoxicidade. A centrifugação atenua esse efeito.
    NOTA 2: A placa deve ser imageda o mais rápido possível após a centrifugação, idealmente, dentro de 15 minutos. A centrifugação pode reduzir a seletividade da coloração de PI e pode permitir que as células acumulem lentamente iodeto de propídio. A melhora na precisão obtida pela visualização das células mortas supera o ligeiro aumento na coloração de PI. Recomenda-se terminar a imagem dentro de 1 h de centrifugação.

3. Ensaio de Citotoxicidade: aquisição de dados

  1. Defina o software para o microscópio/imager automatizado de placas para detectar fluorescência tanto para Hoechst 33342 (máximo de excitação de 350 nm, emissão máxima de 461 nm) quanto PI (máximo de excitação de 493 nm, emissão máxima de 636 nm). Adquira imagens para cada poço em ambos os canais.
  2. Usando o software (como o CellProfiler, um estúdio gratuito de análise de imagens baseado em matlab http://cellprofiler.org/, ImageJ ou software proprietário, como o Gen5) conta as células em cada poço em cada canal.
    NOTA: Como todas as células devem ser manchadas com Hoechst 33342, e as células mortas devem ser manchadas com PI, a proporção de mortos para todos representa a fração de células que estão mortas. Por exemplo, se a contagem automatizada em amostras não tratadas mostrar 467 células manchadas com PI (células mortas) e 2335 células manchadas com Hoechst 33342 (células totais), a fração morta é de 0,2 ou 20%. Este valor é então comparado a uma amostra manipulada de forma idêntica onde o tratamento foi utilizado.
  3. Descrição detalhada da aquisição de dados da Hoechst/PI usando o cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader e o software Gen5 v. 3.00:
    1. Defina o leitor/imager de placa multimoda Cytation5 para células de imagem em fundo plano, placas de plástico preto genérica de 96 poços.
    2. Defina um protocolo de imagem para utilizar os conjuntos de filtros DAPI e Texas Red padrão. Faça imagens no centro do poço usando um objetivo de ampliação 4x. Não use compensação (X/Y ou Z). Use as seguintes configurações de imagem: DAPI – LED - 10, tempo de integração - 99, ganho – 0; Texas Red – LED - 8, tempo de integração - 950, ganho - 18. Realizar o foco automático usando o sinal DAPI; não deve haver compensação no foco entre os canais.
    3. Realize a análise de imagens usando o software Gen5 v 3.00. Nas configurações do software, defina as células como formas entre 5 e 25 μm em seu tamanho. Exclua objetos de borda primária e divida objetos tocando, ligando a opção especial "Divida objetos de toque".  Em seguida, processe a imagem para remover o fundo (subtração de fundo escuro), aplique uma máscara nuclear (valor limiar DAPI >= 6000 UA) e conte objetos. Realize uma análise de subpopulação baseada na coloração de PI (valor limiar Texas Red >= 5000 UA) e conte objetos. A viabilidade celular % é definida como (1 - figure-protocol-1 .

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Resultados

O protocolo supracitado foi desenvolvido utilizando células OCI-AML2, que foram tomadas como uma linha celular representativa de leucemia mielóide aguda. A LMA é caracterizada pela proliferação anormal de células hematopoiéticas indiferenciadas e não funcionais na medula óssea26. Apesar dos recentes desenvolvimentos na terapia-alvo da LMA, o padrão de cuidado permaneceu inalterado por várias décadas, e consiste em terapia de indução (tipicamente composta por três dias de antreracyclina, por exempl...

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Discussão

Embora o protocolo para o ensaio de citotoxicidade Hoechst/PI seja robusto e exija relativamente pouco tempo prático, existem vários detalhes experimentais que são muito importantes para garantir resultados precisos. Em primeiro lugar, é essencial garantir que a concentração de DMSO permaneça abaixo de 0,5% (v/v). É geralmente acordado que a exposição a doses até baixas de DMSO pode alterar substancialmente a morfologia e a fixação das células e retardar significativamente a progressão do ciclo celular3...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

A NVK, uma estudiosa da CPRIT em Pesquisa do Câncer, agradece ao Instituto de Prevenção e Pesquisa do Câncer do Texas (CPRIT) por seu generoso apoio, a CPRIT concede RR150044. Este trabalho também foi apoiado pelo Welch Foundation Research Grant C-1930, e pelos Institutos Nacionais de Saúde R35 GM129294 concedidos à NVK. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-Deoxy-D-glicose/2-DGChem-Impex50-519-067
3-bromo-piruvatoAlfa Aesar1113-59-3
Placas de 96 poçosGreiner Bio-One655090Placas de 96 poços pretas ou transparentes de fundo plano
Reagente de viabilidade de células HS azul Alamar (100mL) Thermo FisherA50101
Countess II contador de células automatizadoThermo Fisher
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode ReaderBioTek
Hoechst 33342Thermo Fisher62249Solução de 20 mM; concentração final 1:1,000
HyClone fetal bovinoserum GE Healthcare#25-514
m-clorofenilhidrazona/CCCPSigma AldrichC2759
PBS comprimidosThermo FisherBP29441001 comprimido + 200 mL de água estéril = 1x solução PBS
Penicilina-estreptomicina-glutamina (100X)Gibco10378016
Pierce LDH kit de ensaioThermo Fisher50-103-5952
Iodeto de propídioThermo Fisher50-596-072Pó seco; estoque 1 mg/mL em PBS; concentração final 5 µ g/mL (células de leucemia), 1 µ g/mL (PBMCs normais)
RotenonaArk PharmAK115691
RPMI-1640 Medium
Com L-glutamina e bicarbonato de sódio, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura celular		Sigma AldrichR8758-500ML
Brometo de tetrazólio azul de tiazolilaACROS OrganicsAC158990010
Mancha azul de tripano (0,4%)Gibco15250-061
Linhagens celulares
K562ATCCCCL-243Linha celular CML
MOLM-13Linha celular ATCCAML
MOLT-4ATCCCRL-1582ALL linha celular
OCI-AML2Linha celular ATCCAML

Referências

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