O objetivo deste protocolo é injetar actina globular conjugada por Rhodamine em embriões Drosophila e montagem de haste de actina intranuclear de imagem após estresse térmico.
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Artigo de método
Imagens Intranuclear Actin Rods em Embriões de Drosophila estressados de calor vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo deste protocolo é visualizar hastes de actina intranucleares que se reúnem em embriões de melanogaster Drosophila vivos após estresse térmico. As hastes actina são uma marca registrada de uma Resposta ao Estresse Actin (ASR) conservada e indutível que acompanha patologias humanas, incluindo doenças neurodegenerativas. Anteriormente, mostramos que o ASR contribui para falhas de morfogênese e viabilidade reduzida do desenvolvimento de embriões. Este protocolo permite o estudo contínuo dos mecanismos subjacentes à montagem da haste actin e do ASR em um sistema modelo altamente favorável à imagem, genética e bioquímica. Os embriões são coletados e montados em uma tampa para prepará-los para injeção. A actina globular conjugada por rhodamina(G-actin Red) é diluída e carregada em uma microacela. Uma única injeção é feita no centro de cada embrião. Após a injeção, os embriões são incubados a temperatura elevada e as hastes de actina intranuclear são então visualizadas por microscopia confocal. A recuperação da fluorescência após experimentos de fotobleaching (FRAP) pode ser realizada nas hastes de actin; e outras estruturas ricas em actina no citoplasma também podem ser imagens. Descobrimos que o G-actinRed polimeriza como g-actina endógeno e não interfere, por si só, no desenvolvimento normal de embriões. Uma limitação deste protocolo é que deve-se tomar cuidado durante a injeção para evitar ferimentos graves no embrião. No entanto, com a prática, injetar G-actinRed em embriões de Drosophila é uma maneira rápida e confiável de visualizar hastes de actina e pode ser facilmente usada com moscas de qualquer genótipo ou com a introdução de outros estresses celulares, incluindo hipóxia e estresse oxidativo.
Introdução
Este protocolo descreve como injetar G-actinRed para visualizar a montagem de hastes de actina intranuclear em embriões estressados pelo calor que estão passando por uma Resposta de Estresse Actina indutível (ASR)1. Desenvolvemos este protocolo para auxiliar estudos do ASR, que em embriões leva à morfogênese interrompida e à viabilidade reduzida, e em tipos de células humanas adultas está associado a patologias incluindo insuficiência renal2,miopatias musculares3,e Alzheimer e Doença de Huntington4,5,
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Protocolo
1. Prepare copos de coleta de embriões e pratos de ágar de suco de maçã
- Cinco dias antes do experimento de injeção, construa28 ou obtenha pelo menos dois pequenos copos de coleta de embriões. Faça pratos frescos de 60 mm de suco de maçã para serem usados com pequenos copos de coleta28. Armazene placas em caixas plásticas cobertas com toalhas de papel úmidas a 4 °C.
NOTA: Pequenos copos de coleta de embriões, preenchidos com números de moscas descritos na etapa 1.3, fornecerão números suficientes de embriões por experimento, ao mesmo tempo em que garantem que o manuseio e a injeção de embriões possam ser feit....
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Resultados
Um fluxo de trabalho esquemático de manuseio de embriões é retratado na Figura 1, e um cronograma para um experimento típico é apresentado na Tabela 1. Uma estimativa para um bom resultado experimental é que para cada 10 embriões injetados, pelo menos metade dos embriões vistos estará no estágio correto de desenvolvimento, não danificado, e exibirá um ASR robusto com estresse térmico a 32 °C. Este ASR será evidenciado pela montagem de hastes de actina intranuclear, como mos.......
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Discussão
A importância deste método é que utiliza o protocolo bem estabelecido de microinjeção em embriões Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 para viabilizar novas pesquisas sobre o ASR e a montagem da haste actin. Uma grande vantagem de injetar G-actinRed em embriões vivos é que o A.......
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Divulgações
Nenhum conflito de interesses declarado.
Agradecimentos
Os autores reconhecem com gratidão o trabalho de Liuliu Zheng e Zenghui Xue, que ajudaram a pioneira nesta técnica no laboratório Sokac, bem como Hasan Seede, que ajudou na análise. O trabalho deste estudo é financiado por uma bolsa do NIH (R01 GM115111).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Trifosfato de adenosina (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Componente do tampão G Suco de |
| maçã, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Componente de pratos de suco de maçã |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Componente de pratos de suco de maçã |
| Alvejante, PureBright Germicida, hipoclorito de sódio a 6,0% | KIK International | 059647210020 | Para embriões descorionantes |
| Cloreto de cálcio | Millipore-Sigma | C1016500G | Componente do tampão G |
| Filtro de células, 70 μ m | Falcon | 352350 | Para a recolha de embriões descorionados |
| Microscópio confocal, LSM 880 34 canais com Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | Para a imagem de imagens de hastes de actina intranucleares |
| Dessecante | Drierite | 24001 | Para dessecar embriões |
| Microscópio de dissecação, Stemi 508 Estereoscópio com zoom 8:1 | Zeiss | 4350649000000 | Para organizar embriões em cunha de ágar |
| Agulha de dissecação, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | Para organizar embriões em cunha de ágar |
| Ditiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Componente do tampão G |
| Fita Dupla Face, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | Para fazer cola de embriões |
| Gaiola de coleta de embriões | Genessee Scientific | 59100 | Para abrigar moscas adultas e coletar embriões Pinças |
| ponta fina, Pinça Dumont, Estilo 5 | Ciências de Microscopia Eletrônica | 72701D | Para organizar embriões em cunha de ágar |
| Capilares de vidro, vidro borosílico, fino 1 mm x 0,75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | Para microagulhas |
| Óleo de halocarbono 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | Para hidratação de embriões |
| Incubadora de estágio aquecido | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | Para imagens confocais |
| Limpadores de tecidos de laboratório, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Limpadores de tecidos de laboratório |
| Microscópio de luz, Invertoskop 40C Contraste de fase invertida microscópio, recondicionado | Zeiss | Microscópio de injeção | descontinuado |
| Metil-4-hidroxibenzoato | Millipore-Sigma | H36471KG | Componente de placas de suco de maçã |
| Microinjetor, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjetor |
| Micro pontas de carregador, epT.I.P.S. 20 μ L | Eppendorf | 5242956003 | Para carregar microagulhas |
| Micromanipulador e estágio de injeção com mostradores x,y,z para ajuste da agulha | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Personalizado | Para realizar microinjeções |
| Extrator de micropipeta, Modelo P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | Para puxar tubos capilares para fazer microagulhas |
| Vidro de cobertura do microscópio 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | Para montagem de embriões |
| Lâminas de microscópio, Lilás Colorfrost, Pré-limpo, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | Para montagem de embriões para injeção |
| n-Heptano | Fisher Scientific | H3601 | Componente de cola de embrião |
| Objetiva, 10x | Zeiss | Descontinuado | 10x objetiva para microscópio |
| de injeçãoObjetiva, C-apocromático 40x/1,2 W Korr. Objetiva de água FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x para objetiva confocal |
| , LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 para imersão em óleo, água, óleo de silicone ou glicerina (D=0-0,17 mm) (WD=0,57 mm em D=0,17 mm) | Objetiva de imersão mista Zeiss | 4208529871000 | 25x para objetiva confocal |
| , Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Óleo DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | objetiva de óleo 63x para objetiva confocal |
| Pincel, Robert Simmons Expression E85 Pontiagudo Redondo tamanho 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | Para transferência de embriões |
| Toalhas de papel, toalhas de papel Kleenex C-fold, branco | Kimberly-Clark | 884266344845 | Para filtro de células de borrão |
| Pipeta Pasteur, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | Para cobrir embriões com óleo |
| Placa de Petri, vidro, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | Para câmara de incubação húmida |
| Placa de Petri, plástico, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | Para placas de sumo de maçã |
| Pipeta, Eppendorf Referência 0.5-10 μ L | Eppendorf | 2231000604 | Para carregar a ponta da pipeta de microagulhas |
| , xTIP4 250 μ L | Biotix | 63300006 | Para adicionar cola de embrião à lamínula |
| Lâmina de barbear | VWR | 55411050 | Para cortar cunha de ágar-ágar, fita, pontas de pipeta |
| Actina globular conjugada com rodamina, plaquetas humanas (não músculo; 4x10 μ g) | Citoesqueleto, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Borosillicate de vidro com revestimento de polietileno e tampas de ureia | Fisher Scientific | 033377 | Para fazer cola de embriões |
| Frasco com tampa de rosca, 16 oz | Nalgene 000194414195 | Para dessecar embriões | |
| Microscopia eletrônica de estágio Microscopia Eletrônica Sciences | 602104PG | Para calibrar o volume de injeção de G-actina | |
| Sacarose | Millipore-Sigma | 840971KG | Componente de pratos de suco de maçã |
| Base Trizma | Millipore-Sigma | T15031KG | Componente de G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Componente de pasta de levedura |
Referências
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytos....
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Reimpressões e permissões
