Artigo de método

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

DOI:

10.3791/61298

⸱

16 de julho de 2020

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1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

Neste artigo

Resumo

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Apresentado aqui é um protocolo para a determinação do estado oligomerico de proteínas de membrana que utiliza um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa em conjunto com microscopia eletrônica.

Resumo

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As interações proteína-proteína nos sistemas de membrana celular desempenham papéis cruciais em uma ampla gama de processos biológicos, desde interações célula-célula até transdução de sinais; desde a detecção de sinais ambientais até a resposta biológica; da regulação metabólica ao controle do desenvolvimento. Informações estruturais precisas das interações proteína-proteína são cruciais para a compreensão dos mecanismos moleculares dos complexos proteicos de membrana e para o desenho de moléculas altamente específicas para modular essas proteínas. Muitas abordagens in vivo e in vitro foram desenvolvidas para a detecção e análise de interações proteína-proteína. Entre eles, a abordagem da biologia estrutural é única na prática de fornecer informações estruturais diretas de interações proteína-proteína no nível atômico. No entanto, a biologia estrutural da proteína da membrana atual ainda está em grande parte limitada a métodos à base de detergente. A principal desvantagem dos métodos à base de detergente é que eles frequentemente dissociam ou desnaturam complexos proteicos de membrana de desnatura uma vez que seu ambiente de bicamadas lipídicas nativas é removido por moléculas de detergente. Estamos desenvolvendo um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para biologia estrutural de proteína de membrana. Aqui, demonstramos o uso desse sistema na análise de interações proteína-proteína na membrana celular com estudo de caso do estado oligomerico da AcrB.

Introdução

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As interações proteína-proteína (PPI) desempenham papéis fundamentais ao longo da biologia, desde a manutenção da estrutura e função das proteínas até a regulação de sistemas inteiros. Os PPIs vêm de muitas formas diferentes e podem ser categorizados com base em que tipos de interações formam. Uma dessas categorizações é homooligomerica ou heterooligomerica, baseada em se as interações são entre subunidades idênticas ou proteínas diferentes agindo como subunidades. Outra categorização baseia-se na força da interação se as interações levarem à formação de complexos estáveis ou estados complexos transitórios. Informações estruturais sobre os PPIs entre proteínas são cru....

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Protocolo

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1. Expressão proteica

  1. Inocular 15 mL de mídia de caldo fantástico (TB) com antibióticos específicos para plasmídeos com células pLysS BL21(DE3) contendo o AcrB expressando plasmídeos em tubos de 50 mL durante a noite a 37 °C com agitação a 250 rpm.
  2. Verifique a densidade óptica da cultura overnight em 600 nm (OD600) e certifique-se de que ela tenha mais de 2,0.
  3. Diluir 5 mL de cultura celular em 1 L de mídia de TB contendo antibióticos específicos para plasmídeos e incubar a 37 °C com agitação até OD600=0,8 e, em seguida, induzir com IPTG que tem uma concentração final de 1 mM.
  4. Realizar indução a 20 °C com ag....

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Resultados

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Utilizando os procedimentos aqui apresentados, foram purificadas amostras do tipo selvagem E. coli AcrB e E. coli mutante AcrB-P223G. As amostras foram então adsorvidas a redes de microscopia eletrônica de manchas negativas de carbono e manchadas usando acetato de urano com o método de mancha lateral22. Imagens de manchas negativas foram coletadas por meio de microscopia eletrônica de transmissão. A imagem de mancha negativa para a amostra do tipo selvagem AcrB purificada com DDM.......

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Discussão

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As interações proteína-proteína são importantes para a integridade da estrutura e função das proteínas da membrana. Muitas abordagens foram desenvolvidas para investigar interações proteína-proteína. Quando comparadas com proteínas solúveis, as proteínas de membrana e seus PPIs são mais difíceis de estudar devido às propriedades intrínsecas únicas das proteínas da membrana. Essa dificuldade vem principalmente da exigência de proteínas de membrana para serem incorporadas em um ambiente nativo de bicamadas lipídicas para e.......

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Divulgações

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Y.G é listado como inventor do polímero ativo de membrana NCMNP5-2 e sistema NCMN.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo de startups VCU (para Y.G.) e pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R01GM132329 (para Y.G.) O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Agradecemos a Montserrat Samso e Kevin McRoberts pelo generoso apoio à gravação de vídeo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produtos Químicos
30% Acrilamida/BIS SOL (37.5:1)Bio-Rad161-0158
4x Tampão de Amostra Laemmli (Tampão de Carregamento)Bio-Rad1610747
Ácido Acético GlacialThermoFisher ScientificA38S-212
Persulfato de Amônio (APS)Bio-Rad161-0700
CloranfenicolGoldbioC-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 proteína mancha em póBio-Rad161-0400
DTT (Ditiotreitol) (> 99% puro) Livre de proteaseGoldbioDTT10
GlicerolThermoFisher ScientificG33-4
HEPESThermoFisher ScientificBP310-1
ImidazolAffymetrix17525 1 KG
IPTGGoldbioI2481C100
CanamicinaGoldbioK-120-25
Cloreto de magnésio hexahidratadoThermoFisher ScientificAA3622636
MetanolThermoFisher ScientificA412-4
N,N-dimetiletilenodiamina (EDTA)Merck8.03779.0100
NCMNS-P5-2Ainda não disponível comercialmenteEnviar solicitação de obtenção ao autor
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
SDS (Dodecil Sulfato de Sódio)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray ValleyEnviar solicitação de obtenção ao autor
Cloreto de sódioThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Ótimo caldo MeioAffymetrix75856 1 KG
Tris BaseBio-Rad161-0719
Acetato de UranilaAmbinterAmb22348393
Equipment
Avanti J-26S XPIBeckman CoulterB14538
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Grades de Microscópio Eletrônico de Carbono (10 nm)HomogeneizadorSciences CF300--TH
EberbachE7265
Mini Microcentrífuga Corning LSEThermoFisher Scientific07-203-954
AvestinaEmulsiFlex-C3
F9-RGE Healthcare Life Sciences29003875
Mini-PROTEAN Tetra Célula de Eletroforese VerticalBio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 EspectrofotômetroThermoFisher ScientificND-2000
Ultracentrífuga Optima L-90KBeckman CoulterPN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Sistema de Limpeza de Descarga de BrilhoTed Pella91000S-230
Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue GrinderBásica PowerPac Wheaton358013
164-5050
Razel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences28990944
Tecnai F20 200kVFEI
Tipo 70 Ti Rotor de ângulo fixoBeckman Coulter
General Materials
1.5 ml Tubos de microcentrífugaThermoFisher Scientific05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDaMillipore SigmaUFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLCGE Healthcare Life Sciences29018225
BL21(DE3)pLysS CellsThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 ml Tubo de Centrífuga CônicoThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 Coluna de mlGE Healthcare Life Sciences17524802
pET-24aEMD Biosciences69749-3
correspondente correspondente de Tecido Con-Torque Coletor de Frações de Fonte de Alimentação Bomba de Seringa de Velocidade Variável Razel R99-E Bio-Rad

Referências

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  1. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).<....

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