Apresentado aqui é um protocolo quimicamente definido para a derivação de podocitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas com alta eficiência (>90%) e independente de manipulações genéticas ou seleção de subpopulação. Este protocolo produz o tipo de célula desejada dentro de 26 dias e pode ser útil para testes de nefrocoxicidade e modelagem de doenças.
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Artigo de método
Diferenciação guiada de podocitos renais maduros de células-tronco pluripotentes induzidas humanas sob condições quimicamente definidas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A doença renal afeta mais de 10% da população global e custa bilhões de dólares em gastos federais. As formas mais graves de doença renal e eventual insuficiência renal em estágio terminal são frequentemente causadas pelo dano aos podocitos glomerulares, que são as células epiteliais altamente especializadas que funcionam junto com células endoteliais e a membrana do porão glomerular para formar a barreira de filtragem do rim. Os avanços na medicina renal têm sido dificultados pela limitada disponibilidade de tecidos primários e pela falta de métodos robustos para a derivação de células renais humanas funcionais, como os podocitos. A capacidade de derivar podocitos de fontes renováveis, como células-tronco, poderia ajudar a avançar a compreensão atual dos mecanismos de desenvolvimento renal humano e doenças, bem como fornecer novas ferramentas para a descoberta terapêutica. O objetivo deste protocolo foi desenvolver um método para derivar podocitos maduros e pós-mitóticos de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS) com alta eficiência e especificidade, e sob condições quimicamente definidas. Os podócitos derivados de células hiPS produzidos por este método expressam marcadores específicos de linhagem (incluindo nefrina, podocina e tumor 1 de Wilm) e exibem as características morfológicas especializadas (incluindo processos de pé primário e secundário) associadas a podocitos maduros e funcionais. Curiosamente, essas características especializadas estão notavelmente ausentes na linha celular podocito imortalizada amplamente utilizada no campo, o que sugere que o protocolo descrito aqui produz podocitos renais humanos que têm um fenótipo de desenvolvimento mais maduro do que as linhas celulares podocyte existentes normalmente usadas para estudar biologia renal humana.
Introdução
Os avanços na cultura das células-tronco pluripotentes humanas estão prontos para revolucionar a medicina regenerativa, a modelagem de doenças e o rastreamento de medicamentos, fornecendo aos pesquisadores uma fonte renovável e escalável de material biológico que pode ser projetado para obter quase qualquer tipo de célula dentro do corpo humano1. Essa estratégia é especialmente útil para o derivado de tipos de células especializadas e funcionais que, de outra forma, seriam difíceis de obter. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS)células 2,3,
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Protocolo
1. Preparação de reagentes
- Diluir o suplemento de mídia de cultura celular hiPS (CCM) descontou em meio basal de cultura celular hiPS para obter uma solução 1x de hiPS CCM.
NOTA: O suplemento CCM de 5x congelado requer um processo de descongelamento lento, idealmente em 4 °C durante a noite. As alíquotas do CCM 1x hiPS podem ser armazenadas por até 6 meses a -20 °C. - Preparação da matriz de membrana de porão (BM) placas revestidas de 1 para a cultura celular hiPS: Descongelar matriz BM 1 durante a noite no gelo a 4 °C. Uma vez descongelado, prepare alíquotas com fatores de diluição adequados, conforme sugerido pelo fabricante.
NOTA: Normalment....
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Resultados
O objetivo deste protocolo foi demonstrar que podocitos humanos maduros podem ser derivados de células hiPS em condições quimicamente definidas. Os dados apresentados neste manuscrito foram gerados por meio da linha de células DU11 hiPS17, que foram testadas pela primeira vez, e constataram estar livres de mycoplasma. A análise cromossômica também foi realizada, e as células foram encontradas karyotipicamente normais. Começando com as células hiPS DU11 indiferenciadas, a estratégia de diferenciaçã.......
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Discussão
Neste relatório, descrevemos um protocolo para a geração de podocitos glomerulares renais a partir de células hiPS. Os podocitos derivados de células hiPS apresentam características morfológicas e moleculares associadas ao fenótipo de podocito renal maduro13. Em publicações anteriores, mostramos que os podocitos derivados de células hiPS podem imitar a estrutura e a função de filtragem seletiva do glomerulus renal quando co-cultivado com células endoteliais microvasculares glomerulares em um dispo.......
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Divulgações
S.M. é um autor de uma patente pendente para métodos para a geração de podocitos renais a partir de células-tronco pluripotentes (pedido de patente dos EUA 14/950859). Os demais autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Escola Pratt de Engenharia da Duke University, a Divisão de Nefrologia da Duke Medical School, um Prêmio de Pesquisa de Uma Cadeira do Departamento de Medicina da Duke University, e um Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award to S.M.. M.B foi apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação em Pesquisa da Fundação Nacional de Ciência. Agradecemos ao Laboratório Bursac por nos fornecer generosamente a linha de células-tronco DU11, e o Laboratório Varghese da Universidade duke por compartilhar temporariamente suas instalações de cultura de tecidos com nosso grupo. Esta publicação é dedicada à Profª Laura L. Kies....
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Materiais
Cells
iPS humanas A linha celular iPS DU11 (clone # 11 da Duke University) foi gerada no Duke University iPSC Core Facility e fornecida a nós pelo Bursac Lab da Duke University. Suplemento sem soro B27 da Kit Água destilada estéril Tubo de centrífuga cônico de centrífuga cônico Corning criogênicas Corning de pipeta de barreira de precisão VWR Ponteiras de pipeta de barreira Ponteiras de pipeta de barreira de pipeta de barreira de pipeta de barreira Denville Scientific de pipeta de barreira Denville Scientific Pipeta sorológica sorológica Corning sorológica Corning de Microcentrífuga Estéril Millipore
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células | |||
| DU11 | Esta linha foi testada para micoplasma e foi cariotipada pela última vez em julho de 2019 por nosso laboratório, e considerada cariotipicamente normal. | ||
| Fatores de crescimento e suplementos de mídia | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| 17504044 Thermo | /Life Technologies | ||
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | pode mostrar variação de lote para lote |
| Completo Médio com CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Sistemas de células | Meios de manutenção de podócitos |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 com suplemento GlutaMAX | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 com suplemento de glutamina |
| FBS inativado por calor | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Ativo humano A | PHC9564 | Thermo/Life Tecnologias | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS meio de cultura de células (CCM) |
| Penicilina– estreptomicina, líquido (100 vezes;) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 inibidor de ROCK | 1254 | Tocris | |
| Anticorpos | |||
| Alexa Fluor 488– e Alexa Fluor 594– anticorpos secundários conjugados | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo / Life Technologies | |
| Brachyury (T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R & D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragmento | N-892012 | Iwai North America | Matriz de membrana basal (BM) 2 |
| Matriz qualificada para hESC Matrigel, frasco de 5 mL | 354277 | BD Biociências | Matriz da membrana basal (BM) 1. Pode apresentar variação de lote para lote |
| Enzimas e outros reagentes | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Solução de desprendimento celular |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimetil Sulfóxido (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO é tóxico. Deve ser manuseado com capuz de segurança química |
| Tampão de dissociação celular livre de enzimas, Hank' s sal balanceado | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Solução de etanol, 70% (vol/vol), grau de biotecnologia | 97065-058 | O etanol VWR | é inflamável e tóxico |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldeído (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | O PFA deve ser manuseado em uma capela de exaustão química com equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas, jaleco e óculos de segurança. Evite a inalação e o contato com a pele. |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| 15230162 | Thermo/Life Technologies | ||
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Tripsina-EDTA, 0,05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipamento | |||
| Pipetas de aspiração, embaladas individualmente | 29442-462 | Centrífuga Corning | |
| Avanti J-15R | B99516 | Beckman Coulter | |
| , 15 mL | 352097 | Tubo | |
| , 50 mL | 352098 | Caixas | |
| 3395465 | Thermo/Life Technologies | Para armazenamento congelado alíquotas | |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Microscópio fluorescente utilizado para adquirir imagens de células iPS fixas e coradas e seus derivados |
| Hemocitómetro | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i Incubadora de CO2 | 51030403 | Thermo/Life Technologies | Para a cultura e manutenção de rotina de células iPS e seus derivados |
| Zeiss Axio Observer invertido equipado com câmera AxioCam 503 | 491916-0001-000(microscópio) ; 426558-0000-000(câmera) | Carl Zeiss Microscopy | Usado para adquirir imagens de contraste de fase de células iPS vivas e seus derivados em cada estágio de diferenciação de podócitos |
| Luvas de nitrilo Kimberly-Clark | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, grande | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, pequeno | 21905-026 | Ponteiras | |
| P10 | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 Ponteiras de pipeta de barreira | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 Ponteiras | P1126 | Ponteiras | |
| P200 | P1121 | Ponteiras | |
| P200 | P1122 | Denville Scientific | |
| , 10 mL, embalada individualmente | 356551 | Pipeta | |
| , 25 mL, embalada individualmente | 356525 | Pipeta | |
| , 5 mL, embalada individualmente | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0,22 μ m, PES | SCGP00525 | EMD Tubos | |
| 1138W14 | Thomas Scientific | Para aliquoting fatores de crescimento | |
| Cultura de tecidos– placas tratadas de 12 poços | 353043 | cultura de tecidos Corning | |
| – placas de seis poços tratadas | 353046 | Corning | |
| VWR jaleco branco techuni | 10141-342 | VWR | |
| Elevador de células de bisel largo | 3008 | Corning |
Referências
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L.
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Reimpressões e permissões
