Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

Resumo

Este protocolo visa automatizar as medições de AFM em centenas de células microbianas. Primeiro, micróbios são imobilizados em microestruturas de selo PDMS e, em seguida, as medições de espectroscopia de força são realizadas automaticamente em centenas de células imobilizadas.

Resumo

O método apresentado neste artigo visa automatizar experimentos Bio-AFM e o registro de curvas de força. Usando este método, é possível registrar curvas de forças em 1000 células em 4 horas automaticamente. Para manter um tempo de análise de 4 horas, o número de curvas de força por célula é reduzido para 9 ou 16. O método combina um programa baseado em Jython e uma estratégia para a montagem de células em padrões definidos. O programa, implementado em um Bio-AFM comercial, pode centralizar a ponta na primeira célula da matriz e, em seguida, mover-se, automaticamente, de célula para célula enquanto grava curvas de força em cada célula. Utilizando essa metodologia, é possível acessar os parâmetros biofísicos das células, como sua rigidez, suas propriedades adesivas, etc. Com a automação e o grande número de células analisadas, pode-se acessar o comportamento da população celular. Este é um avanço no campo Bio-AFM onde os dados foram, até agora, registrados em apenas algumas dezenas de células.

Introdução

Este trabalho fornece uma metodologia para realizar medições automáticas de força em centenas de células vivas usando um microscópio de força atômica (AFM). Também fornece um método para imobilizar micróbios em um selo microestruturado PDMS compatível com experimentos AFM realizados em um ambiente líquido.

Bio-AFM é uma tecnologia altamente especializada concebida para aplicações em biologia e, em seguida, usada para estudar células vivas. Requer um engenheiro treinado que possa analisar uma célula no momento. Nessas condições, o número de células diferentes que podem ser analisadas é bastante pequeno, típico de 5 a 10 células em 4-5 horas.....

Protocolo

1. Cultura celular microbiana

1. Reviva células de um estoque de glicerol.
   NOTA: Os albicanos C. são armazenados a -80 °C em estoques de glicerol, em mármores.
   1. Escolha uma bola de gude no caldo -80 °C e esfregue-o no ágar peptone dextrose (YPD) de levedura. Cresça as células por 2 dias a 30 °C, antes do cultivo líquido.
2. Prepare culturas líquidas.
   1. Encha um tubo de cultura com 5 mL de caldo YPD estéril e adicione uma única colônia de células C. albicans, cultivadas na placa de ágar YPD.
   2. Cresça a cultura em condições estáticas a 30 °C por 20 h antes de colher por centrifugação (4000 x g

Resultados

Utilizamos o protocolo descrito para analisar o efeito da caspofungin nas propriedades biofísicas do patógeno humano oportunista C. albicans em sua forma de levedura. Caspofungin é uma última chance de molécula antifúngica usada quando outras drogas são ineficazes devido aos mecanismos de resistência que as células desenvolvem em relação aos antifúngicos. Seu mecanismo de ação baseia-se na inibição da subunidade Fks2 do complexo fks1/Fks2 responsável pela síntese ß glucan. Como os glucas são um componente import.......

Discussão

A principal melhoria proporcionada por essa metodologia é um aumento significativo no número de células medidas em um determinado período de tempo. A contrapartida é a redução do número de pontos medidos por célula. Significa que este método não foi projetado para fornecer uma análise detalhada de uma única célula. O método só se aplica a células que podem caber nos poços do selo PDMS. O selo é bastante versátil, enquanto contém poços de 1,5 x 1,5 μm² até 6 x 6 μm². Ainda assim é impossível imobiliz.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
O modilhão	de Bruker AFM do AFM sondas	MLCT	Os cantilevers usados foram rotulados " C” com freqüência ressonante de 7 a 10 quilohertz e de k: análise
JPK-Bruker	JPK do processamento de dados JPK-Bruker JPK do AFM de 0,01 N/m Mínimo 5,1.8 da versão do processamento de dados		JPK-Bruker Pode ser transferido de um acount do usuário de JPK-Bruker
Placas de Petri	WPI	FluoroDish FD35-100	O calefator foi usado para monitorar as mudanças de temperatura durante o microscópio
AFM)	JPK-Bruker	Nanowizard II ou III	da força atômica do experimentoo AFM deve ser montado em um microscópio ótico invertido com uma fase motorizada
Caspofungin	Sigma-Aldrich	SML0425-5MG	Caspofungin foi usado com uma concentração de 4 MIC (concentração mínima do inibidor) Editor de
código	Microsoft	Visual Studio Versão 1.40.1	do código https://code.visualstudio.com/
Cryobeads	IFU	CB12
Dessecator/Degassing câmara	Fisherbrand	15594635	O equipamento é usado para desgaseificação dos selos PDMS por cerca de 50 minutos, qualquer dessecador acoplado a uma bomba de vácuo servirá.
Aquecedor de placa de Petri	JPK-Bruker	PetriDishHeater	Este é um complemento para o JPK/Bruker AFM. O aquecedor foi usado para monitorar as mudanças de temperatura durante o experimento
Tampão acetato de sódio pH 5,2	Sigma-Aldrich	S7899	A solução contém 18 mM de acetato de sódio, 1 mM de CaCl2 e 1 mM de MnCl2. Ajuste o pH com ácido acético glacial. A solução pode ser conservada a 4 &graus; C por 2 meses
Linguagem de análise estatística	https://www.r-project.org	R versão 3.6.1	R é uma linguagem e ambiente para computação estatística e gráficos. É um projeto GNU semelhante ao software de análise estatística de linguagem e ambiente S
	https://rstudio.com	R studio versão 1.1.463	colaboração entre a R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP e outros. RStudio e Shiny são projetos afiliados da Fundação para Estatísticas de Acesso Aberto
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028	Polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de cura em um conjunto
Levedura Peptona D Caldo	Difco	242820
YPD Ágar	Difco	DF0427-17-6