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Artigo de método

Fabricação de uma Nano-Matriz Biomimética com Nanotubos base janus e fibronectina para adesão de células-tronco

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DOI:

10.3791/61317

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10 de maio de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste protocolo é mostrar a montagem de uma nanomatrix biomimética (NM) com nanotubos base janus (JBNTs) e fibronectina (FN). Quando co-cultivados com células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs), os NMs apresentam excelente bioatividade no incentivo à adesão dos HMSCs.

Resumo

Um NM biomimético foi desenvolvido para servir como um andaime biológico de engenharia tecidual, que pode melhorar a ancoragem de células-tronco. O NM biomimético é formado a partir de JBNTs e FN através de auto-montagem em uma solução aquosa. Os JBNTs medem 200-300 μm de comprimento com canais ocos hidrofóbicos internos e superfícies hidrofílicas externas. Os JBNTs são carregados positivamente e as FNs são cobradas negativamente. Portanto, quando injetados em uma solução aquosa neutra, eles são unidos através de laços não covalentes para formar os feixes NM. O processo de automontagem é concluído dentro de alguns segundos sem qualquer iniciador químico, fonte de calor ou luz UV. Quando o pH da solução NM for inferior ao ponto isoelétrico das FNs (pI 5.5-6.0), os feixes de NM serão auto-liberados devido à presença de FN carregado positivamente.

NM é conhecido por imitar a matriz extracelular (ECM) morfologicamente e, portanto, pode ser usado como um andaime injetável, que fornece uma excelente plataforma para melhorar a adesão do HMSC. A análise da densidade celular e os experimentos de imagem de fluorescência indicaram que os NMs aumentaram significativamente a ancoragem de hMSCs em comparação com o controle negativo.

Introdução

As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) têm mostrado o potencial de auto-renovação e auto-diferenciação ao longo de diferentes linhagens mesenquimais, o que ajuda na regeneração e manutenção dos tecidos1. Com base no potencial de diferenciação, os HMSCs são considerados candidatos a lesões de tecido mesenquimal e terapia de transtorno hematopoiético2. hMSCs têm mostrado a capacidade de promover a cicatrização de feridas aumentando a reparação de tecidos, angiogênese e reduzindo a inflamação3. No entanto, sem assistência bioquímica ou biomaterial, a eficiência para que os hMSCs atinjam um tecido alvo e funcionem no local desejado é baixa4. Embora vários andaimes projetados tenham sido utilizados para atrair hMSCs para aderir às lesões, alguns locais como a fratura da placa de crescimento, no meio de um osso longo, não são facilmente acessíveis pelos andaimes convencionais pré-fabricados, que podem não se encaixar perfeitamente em um local lesionado de forma irregular.

Aqui, desenvolvemos um nanomaterial biomimético que pode se auto-montar in situ e ser injetado em uma área alvo de difícil acesso. O bioescato injetável NM é composto por nanotubos base janus (JBNTs) e fibronectina (FN). Os JBNTs, também conhecidos como Nanotubos Rosette (RNTs), são derivados de pares de bases de DNA, especificamente timina e adenina, aqui5,6,7. Como visto na Figura 1,os nanotubos são formados quando seis moléculas da base de DNA derivada se auto-montam através de ligações de hidrogênio para formar um plano6. Seis moléculas são então empilhadas uma sobre a outra em um plano através de uma forte interação pi-empilhamento7, que pode ser de até 200-300 μm de comprimento. Os JBNTs são projetados para imitar morfologicamente fibras de colágeno para que a FN reaja com elas.

FN é uma glicoproteína adesiva de alto peso molecular, que pode ser encontrada na matriz extracelular (ECM)9. Estes podem mediar a fixação de células-tronco a outros componentes do ECM, particularmente o colágeno10. Projetamos JBNTs para imitar morfologicamente fibras de colágeno para que a FN possa reagir com eles para formar NM em poucos segundos através de ligação não covalente. Portanto, nm é um promissor bioescato a ser injetado em um local de fratura óssea que não poderia ser acessível pelos andaimes convencionalmente fabricados. Aqui, o NM injetável apresenta uma excelente capacidade de melhorar a ancoragem hMSC in vitro, exibindo seu potencial para servir como um andaime para regeneração tecidual.

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Protocolo

1. Síntese de JBNTs

NOTA: O monômero JBNT foi preparado conforme publicado anteriormente11.

  1. Síntese do composto A1
    1. Prepare uma solução contendo 8,50 g de ácido 2-cianoacético e 9,80 g de etilcarbama em 25 mL de tolueno e 2,5 mL de N, N-dimetilformamida. Adicione 4,90 mL de cloreto de fósforo dropwise. Em seguida, aqueça a mistura a 70 °C e continue mexendo por 1,5 h.
    2. Esfrie a mistura de reação à temperatura ambiente e despeje 100 g de água gelada. Extrair a camada aquosa com acetato etílico (3 x 250 mL) e lavar com 100 mL de salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtrar e evaporar voláteis sob vácuo para obter um sólido amarelo-pálido.
    3. Sujeito o sólido amarelo à cromatografia da coluna flash de sílica (3% de metanol/diclorometano) para produzir 15,61 g de composto A1 como pó branco.
  2. Síntese do composto A2
    1. Misture 3,12 g de composto A1 e 2,75 g de carbonato de potássio em 50 mL de N, N-dimetilformamida. Mexa em temperatura ambiente por 2h.
    2. Adicione 2,6 mL de dissulfeto de carbono à suspensão de reação. Continue mexendo por 4h.
    3. Adicione etanol absoluto à mistura de reação a 0 °C. Filtre o amarelo precipitado e lave com éter dietil. Seque sob vácuo durante a noite para produzir 6,18 g de composto A2 como sólido amarelo-pálido.
  3. Síntese do composto A3
    1. Adicione 2,7 mL de iodeto de metila em 15 mL de acetonitrilo. Além disso, prepare separadamente uma solução de composto A2 adicionando 6,18 g de A2 a 80 mL de água/acetonitrilo (proporção 7:3). Misture as soluções e mexa à temperatura ambiente por 30 minutos.
    2. Aqueça a mistura de reação a 95 °C e continue mexendo por 3h.
    3. Esfrie a mistura de reação à temperatura ambiente e, em seguida, evaporar os voláteis sob vácuo.
    4. Extrair o resíduo 3x com 100 mL de acetato de etila e lavar com salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para obter um sólido amarelo.
    5. Sujeito o sólido amarelo à cromatografia da coluna flash de gel de sílica (30% de acetato/hexanos etílicos) para produzir 4,52 g do composto A3 como um sólido amarelo-claro.
  4. Síntese do composto A4
    1. Prepare a solução de alilamina adicionando 925 μL de alilamina em 20 mL de etanol. Adicione esta solução dropwise à solução do composto A3, preparado adicionando 3,14 g de A3 em 75 mL de etanol absoluto, mais de 30 min. Em seguida, aqueça a mistura de reação ao refluxo por 16 h.
    2. Esfrie a mistura de reação à temperatura ambiente e evapore os voláteis para dar um sólido amarelo.
    3. Sujeito o sólido amarelo à cromatografia da coluna flash de sílica (50% de acetato/hexanos etílico a 2% de metanol/diclorometano) para produzir 1,80 g de composto A4 como cristal branco.
  5. Síntese do composto A5
    1. Adicione 2,05 g de cloridrato de guanidinium e 7,8 mL de etoóxido de sódio (21 wt% no etanol) em 14 mL de etanol absoluto. Aqueça a mistura a 45 °C por 15 min.
    2. Filtre o material insolúvel e adicione o filtrado diretamente na solução do composto A4, preparado adicionando 2,70 g de A4 em 40 mL de etanol absoluto. Aqueça a mistura de reação ao refluxo por 16 h.
    3. Filtre o precipitado para obter 2,65 g de composto A5 como um sólido off-white.
  6. Síntese do composto A6
    1. Adicione 24,9 mL de trietilamina lentamente à mistura de chorume obtida adicionando 2,11 g de composto A5 e 1,10 g de 4-Dimethylaminopyridina em 120 mL de tetrahidrofurano acima de 1 min. Mexa em temperatura ambiente por 2 minutos.
    2. Adicione 20,7 mL de di-tert-butyl dicarbonato dropwise à mistura de reação e continue mexendo à temperatura ambiente por 40 h.
    3. Adicione 20 mL de água para saciar a reação. Evaporar os voláteis sob vácuo.
    4. Extrair o resíduo viscoso vermelho com 500 mL de acetato de etila. Em seguida, lave-o com 250 mL de água, 75 mL de ácido cítrico 10%, 2x com 200 mL de água, 200 mL de bicarbonato de sódio saturado e 200 mL de salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para dar um sólido vermelho/laranja.
    5. Sujeito o sólido à cromatografia da coluna flash de gel de sílica (0-20% acetato/hexanos) para produzir 3,87 g de composto A6 como espuma branca.
  7. Síntese do composto A7
    1. Adicione N-metilmorpholine N-óxido (50 wt.% em água, 1,64 mL) dropwise à solução do composto A6 (2,93 g) em acetona/água (8:1, 58,5 mL) e mexa à temperatura ambiente por 5 minutos.
    2. Adicione tetraóxido de ósmio (solução aquosa de 4%) à mistura durante um período de 3 minutos e continue mexendo à temperatura ambiente por 24h.
    3. Sacia a reação com sulfito de sódio aquoso de 1,0 M até que a solução fique incolor. Remova os voláteis sob vácuo para resultar em um chorume branco na água. Extrair o resíduo com 350 mL de diclorometano e depois lavar com 150 mL de água seguido de uma lavagem com 150 mL de salmoura.
    4. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para produzir 2,45 g de composto A7 como um sólido branco.
  8. Síntese do composto A8
    1. Adicione 760 g de periodide de sódio à mistura de 1,36 g de composto A7 em 35 mL de diclorometano/água (6:1, 35 mL) e mexa à temperatura ambiente por 42 h.
    2. Filtre o material insolúvel e concentre o filtrado sob vácuo. Extrair o resíduo resultante com 250 mL de diclorometano e, em seguida, lavar com 100 mL de água e 100 mL de salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para dar o produto bruto.
    3. Sujeito o produto bruto à cromatografia da coluna flash de sílica (5-40% acetato/hexanos etílicos, depois 5% metanol/diclorometano) para produzir 1,08 g de composto A8.
  9. Síntese do composto A9
    1. Prepare uma solução de 830 mg de composto A8 em 15 mL de 1,2-dicloroetano. Adicione a solução de dropwise à mistura de 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-hexanoico ácido trimetilsilyl etil ester (649,5 mgs) e N, N-diisopropiltilamina (591 μL) em 24 mL de 1,2-dicloroetano ao longo de 3 min e mexa em temperatura ambiente por 15 minutos.
    2. Adicione 360,3 mg de triacetoxyboroidride de sódio à solução e continue mexendo à temperatura ambiente por 24 h.
    3. Sacie a mistura de reação com 6 mL de água. Extrair a mistura de reação 3x com 200 mL de diclorometano e lavar com 200 mL de ácido cítrico de 10% em água, 2x com 200 mL de água, 200 mL de bicarbonato de sódio saturado e 200 mL de salmoura nessa ordem. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para obter o produto bruto.
    4. Sujeito o produto bruto à cromatografia da coluna flash de gel de sílica (5-30% acetato/hexanos) para produzir 885 mg composto A9.
  10. Síntese do monômero JBNT
    1. Dissolva 0,54 g de composto A9 (0,54 g) em 10 mL de solução de ácido/tioanisola trifluoroacética de 94% e mexa à temperatura ambiente por 72 h.
    2. Adicione éter dietil (80 mL) à mistura de reação e centrífugue o precipitado para baixo. Despeje o ácido trifluoroacético claro contendo supernanato e lave o precipitado branco com éter dietilo e metanol para produzir 168,6 mg de monômero JBNT bruto(Arquivo Suplementar 1).
    3. Purifique o monômero JBNT bruto por uma cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com uma coluna de fase inversa. O programa de isolamento está listado abaixo: Solvente A: 100% água; solvente B: 100% acetonitrilo; solvente C: pH=1 Solução hcl de água; fluxo: 3 mL/min (ver Tabela 1).
    4. Colete o maior pico em cerca de 7,2 min.

2. Fabricação para JBNT/FN

  1. Adicione 80 μL de solução aquosa JBNT de 1 mg/mL a 40 μL de solução aquosa de 1 mg/mL FN e pipeta várias vezes.
  2. Verifique a presença de suspensão branca sólida após a pipetação por cerca de 10 s.
    NOTA: Um vídeo foi filmado para capturar o processo de automontagem do NM (Arquivo Suplementar 2).

3. Observação de espécimes liofilizados

NOTA: Esta etapa é realizada para mostrar a estrutura do andaime de NM feita de JBNTs e FN.

  1. Prepare soluções FN, JBNT e FN/JBNT NM para observação de materiais liofilizados. Diluir 10 μL de 100 μg/mL de FN com 40 μL de água destilada para fazer uma solução de 20 μg/mL de FN.
  2. Prepare a solução de 100 mg/mL de JBNTs diluindo 5 μL de 1 mg/mL JBNTs em 45 μL de água DI.
  3. Misture 10 μL de 100 μg/mL FN e 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs em 35 μL de água DI para formar a solução NM.
  4. Cubra três poços de microplacas de fundo redondos de 96 bem claras com a solução FN, JBNT e solução NM, respectivamente. Cada poço recebe 50 μL da solução.
  5. Realizar a liofilização, como descrito abaixo, para visualizar a estrutura do andaime do NM.
    1. Congele a placa a -80 °C durante a noite.
    2. Ligue o instrumento liofilizado e a bomba de vácuo.
    3. Pressione o botão de desligar para reduzir a temperatura do sistema para -50 °C.
    4. Coloque a placa congelada no instrumento liofilizado e feche todas as aberturas dos instrumentos.
    5. Clique no botão iniciar para reduzir a pressão do sistema para 0,9 mbar.
    6. Depois de 4h, pressione o botão de aerado e abra a válvula para aumentar a pressão do sistema à pressão atmosférica.
    7. Tire a placa do instrumento liofilizado.
    8. Use um microscópio para observar o FN, JBNTs e o NM auto-montado resultante. Tire várias fotos com uma câmera para os materiais.

4. Medição de espectro de absorção

NOTA: Use a alteração de espectro para FN e JBNTs para apresentar o auto-montado JBNT/FN NM12.

  1. Misture 30 μL de 100 μg/mL FN com 15 μL de água destilada e 5 μL de 1 mg/mL JBNTs para preparar a solução JBNT/FN NM. A suspensão sólida branca pode ser vista depois de pipetting a solução várias vezes.
    NOTA: As concentrações finais de JBNTs e FN na solução são de 100 μg/mL e 60 μg/mL, respectivamente. JBNTs e soluções FN na mesma concentração à utilizada na solução NM também foram preparadas como soluções de controle.
  2. Diluir 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs com 45 μL de água destilada para preparar a solução de controle JBNT.
  3. Diluir 30 μL de 100 μg/mL FN com 20 μL de água destilada para preparar a solução de controle FN.
  4. Meça o espectro de absorção UV-vis das soluções FN, JBNT e JBNT/FN NM com o espectotômetro (ver Tabela de Materiais) para caracterizar a montagem de NM.
    1. Clique no botão UV-Vis. Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL de água destilada sobre ele. Meça-o como em branco de 190-850 nm.
    2. Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL de solução FN sobre ele. Meça o espectro de absorção UV-Vis da solução FN de 190 nm a 850 nm.
    3. Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL de solução JBNT sobre ele. Meça o espectro de absorção da solução JBNT de 190 nm a 850 nm.
    4. Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL da solução JBNT/FN NM sobre ele. Meça os espectros de absorção da solução JBNT/FN NM de 190 nm a 850 nm.

5. Preparação do JBNT/FN NM para microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

  1. Limpe várias grades antes da coloração negativa com um limpador de plasma básico (ver Tabela de Materiais).
  2. Realize a coloração negativa para os espécimes seguindo dois processos diferentes.
    1. Solte 3 μL de 1 mg/mL de solução aquosa JBNTs e 3 μL de solução JBNT/FN NM em grades separadas e deixe-a por 2 minutos. Em seguida, enxágüe cada grade com 100 μL de solução de acetato de urânl (UA) de 0,5%. Escorra a solução em excesso com papel filtro e o ar seque as grades.
    2. Misture 9 μL de solução JBNT/FN NM com 3 μL de solução UA de 2,0% e pipeta várias vezes. Pipeta a solução mista nas grades e mantenha-a nas grades por 2 minutos. Use um papel filtro para remover a solução mista das grades e secar as grades à temperatura ambiente.
  3. Por fim, caracterize a amostra para JBNTs, JBNT/FN NM manchada com a etapa 5.2.1, e JBNT/FN NM manchada com a etapa 5.2.2 com o TEM.

6. Ensaio de função biológica in vitro

  1. Adicione 200 μL de controles negativos (NC, PBS), JBNTs, FN e as soluções JBNT/FN NM em um poço de um slide de câmara de 8 poços, respectivamente.
  2. Congele a tampa de 8 poços com o instrumento liofilizado para revestir materiais na parte inferior dos poços. O protocolo de secagem congelante é o mesmo do passo 3.5.
  3. Em seguida, adicione 10.000 células/poços hMSCs (Passagem 3) nos poços e incuba-os por 24h a 37 °C com 5% de CO2.
  4. Após a incubação, pipeta o meio de cultura celular dos poços e enxágue a cultura com solução 1x PBS.
  5. Adicione 100 μL da solução fixativa a cada poço com células e deixe por 5 minutos. Enxágüe as células suavemente com 1x PBS duas vezes.
  6. Diluir 1% Triton-X 100 a 0,1%. Adicione 100 μL de 0,1% Triton-X 100 a cada poço com células e deixe por 10 minutos. Enxágüe as células suavemente com 1x PBS duas vezes.
  7. Diluir a falooidina de Rhodamina para 1,65 μM. Adicione 100 μL de Rhodamine Phalloidin a cada poço com células e incubar o vidro de cobertura de câmara mantendo-se da luz à temperatura ambiente por 30 minutos. Enxágüe as células suavemente com 1x PBS duas vezes.
  8. Capture as imagens celulares com um microscópio fluorescente.
  9. Conte os números de células em imagens fluorescentes para cada grupo. Calcule a densidade de adesão celular por uma média de três áreas aleatórias em cada poço.
  10. Apresentar todos os dados como desvio padrão ± médio (SD). Realizar análises estatísticas utilizando-se um teste t-cauda-de-cauda, seguido da análise de variância (ANOVA) com p<0,05, que é considerado estatisticamente significante.

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Resultados

Nossos estudos descobriram que a formação do NM de JBNTs e FN é rápida, o que aconteceu em 10 segundos. Como mostrado na Figura 2,o flocule branco foi obtido quando a solução JBNT foi misturada com a solução FN e pipetada várias vezes. O processo de formação de NM é completamente biomimético. Não são necessários estímulos externos. O processo de fabricação é muito mais fácil do que o de alguns biomateriais emergentes, que são baseados em luz ultravioleta ou iniciador químico para crosslinkin...

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Discussão

Neste estudo, desenvolvemos um NM biomimético auto-montado, que foi formado com JBNTs inspirados em DNA e FN. Ao preparar a solução JBNT, o pó liofilizado JBNT deve ser dissolvido na água em vez de PBS, pois a PBS causará aglomeração de JBNTs, o que inibe sua montagem. Além disso, o NM também deve ser montado em água se quisermos observar as estruturas nanofibrilas do NM, pois o sal em PBS vai empacotar com fibras NM, o que pode reduzir muito a resolução das imagens.

O NM tem mostrado grande p...

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Divulgações

Dr. Yupeng Chen é um co-fundador da NanoDe Therapeutics, Inc.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado financeiramente pelo NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) e Universidade de Connecticut.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,2-dicloroetanoAlfa Aesar39121
ácido 2-cianoacéticoSigma-AldrichC88505
4-DimetilaminopiridinaTCI AmericaD1450
8 poços Tampa de lamínula com câmaraThermo Fisher155409
placa de 96 poçosCorning353072
etanolabsolutoThermo FisherBP2818500
acetonaSigma-Aldrich179124
acetonitrilaSigma-Aldrich34851
alilaminaSigma-Aldrich145831
Basic Plasma CleanerHarrick PlasmaPDC32G
ácido cítricoSigma-Aldrich251275
concentrado ácido clorídricoSigma-AldrichH1758
Água deionizadaThermo Fisher15230147
diclorometanoSigma-Aldrichéter
Sigma-Aldrich 296082
Dicarbonato de di-terc-butilaSigma-Aldrich361941
acetato de etilaSigma-Aldrich319902
etilcarbamatoSigma-AldrichU2500
FibronectinaThermo FisherSolução Fixadora PHE0023
(4% de formaldeído preparado em PBS)Thermo FisherR37814
cloridrato de guanidínioAlfa AesarA13543
hexanosSigma-Aldrich227064
Humano células-tronco mesenquimaisLonzaPT-2501
metanolSigma-Aldrich34860
iodeto de metilaSigma-Aldrich289566
N,N-DiisopropiletilaminaAlfa AesarA17114
N,N-dimetilformamidaSigma-Aldrich227056
N-metilmorfolina N-óxido AlfaAesarA19802
Tetraóxido de ósmioAlfa Aesar45385
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher15140163
Solução tampão fosfatoThermo Fisher20012050
cloreto de fosforilSigma-Aldrich201170
carbonato de potássioSigma-Aldrich347825
coluna de fase reversaThermo Fisher25305-154630
Rodamina FaloidinaThermo FisherR415
gel de sílicaTCI AmericaS0821
bicarbonato de sódioSigma-AldrichS6014
etóxido de sódioAlfa AesarL13083
periodeto de sódioSigma-Aldrich71859
sulfato de sódioSigma-Aldrich239313
sulfito de sódioSigma-AldrichS0505
triacetoxiborohidreto de sódioAlfa AesarB22060
espectrofotômetro(NanoDrop One/Onec UV-Vis)Thermo FisherND-ONE-W
Meio de Crescimento de Células-Tronco BulletKitLonzaPT-3001
tetrahidrofuranoSigma-Aldrich401757
tioanisolSigma-AldrichT28002
toluenoSigma-Aldrich179418
trietilaminaAlfa AesarA12646
ácido trifluoroacéticoAlfa AesarA12198
Triton X-100Thermo FisherHFH10
Solução de tripsina-EDTAThermo Fisher25200056
dietílico 270997

Referências

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