Fabricação de uma Nano-Matriz Biomimética com Nanotubos base janus e fibronectina para adesão de células-tronco

Resumo

O objetivo deste protocolo é mostrar a montagem de uma nanomatrix biomimética (NM) com nanotubos base janus (JBNTs) e fibronectina (FN). Quando co-cultivados com células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs), os NMs apresentam excelente bioatividade no incentivo à adesão dos HMSCs.

Resumo

Um NM biomimético foi desenvolvido para servir como um andaime biológico de engenharia tecidual, que pode melhorar a ancoragem de células-tronco. O NM biomimético é formado a partir de JBNTs e FN através de auto-montagem em uma solução aquosa. Os JBNTs medem 200-300 μm de comprimento com canais ocos hidrofóbicos internos e superfícies hidrofílicas externas. Os JBNTs são carregados positivamente e as FNs são cobradas negativamente. Portanto, quando injetados em uma solução aquosa neutra, eles são unidos através de laços não covalentes para formar os feixes NM. O processo de automontagem é concluído dentro de alguns segundos sem qualquer iniciador químico, fonte de calor ou luz UV. Quando o pH da solução NM for inferior ao ponto isoelétrico das FNs (pI 5.5-6.0), os feixes de NM serão auto-liberados devido à presença de FN carregado positivamente.

NM é conhecido por imitar a matriz extracelular (ECM) morfologicamente e, portanto, pode ser usado como um andaime injetável, que fornece uma excelente plataforma para melhorar a adesão do HMSC. A análise da densidade celular e os experimentos de imagem de fluorescência indicaram que os NMs aumentaram significativamente a ancoragem de hMSCs em comparação com o controle negativo.

Introdução

As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) têm mostrado o potencial de auto-renovação e auto-diferenciação ao longo de diferentes linhagens mesenquimais, o que ajuda na regeneração e manutenção dos tecidos¹. Com base no potencial de diferenciação, os HMSCs são considerados candidatos a lesões de tecido mesenquimal e terapia de transtorno hematopoiético². hMSCs têm mostrado a capacidade de promover a cicatrização de feridas aumentando a reparação de tecidos, angiogênese e reduzindo a inflamação³. No entanto, sem assistência bioquímica ou biomaterial, a eficiência para que os hMSCs atinjam um te....

Protocolo

1. Síntese de JBNTs

NOTA: O monômero JBNT foi preparado conforme publicado anteriormente¹¹.

1. Síntese do composto A1
   1. Prepare uma solução contendo 8,50 g de ácido 2-cianoacético e 9,80 g de etilcarbama em 25 mL de tolueno e 2,5 mL de N, N-dimetilformamida. Adicione 4,90 mL de cloreto de fósforo dropwise. Em seguida, aqueça a mistura a 70 °C e continue mexendo por 1,5 h.
   2. Esfrie a mistura de reação à temperatura ambiente e despeje 100 g de água gelada. Extrair a camada aquosa com acetato etílico (3 x 250 mL) e lavar com 100 mL de salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro,....

Resultados

Nossos estudos descobriram que a formação do NM de JBNTs e FN é rápida, o que aconteceu em 10 segundos. Como mostrado na Figura 2,o flocule branco foi obtido quando a solução JBNT foi misturada com a solução FN e pipetada várias vezes. O processo de formação de NM é completamente biomimético. Não são necessários estímulos externos. O processo de fabricação é muito mais fácil do que o de alguns biomateriais emergentes, que são baseados em luz ultravioleta ou iniciador químico para crosslinkin.......

Discussão

Neste estudo, desenvolvemos um NM biomimético auto-montado, que foi formado com JBNTs inspirados em DNA e FN. Ao preparar a solução JBNT, o pó liofilizado JBNT deve ser dissolvido na água em vez de PBS, pois a PBS causará aglomeração de JBNTs, o que inibe sua montagem. Além disso, o NM também deve ser montado em água se quisermos observar as estruturas nanofibrilas do NM, pois o sal em PBS vai empacotar com fibras NM, o que pode reduzir muito a resolução das imagens.

O NM tem mostrado grande p.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,2-dicloroetano	Alfa Aesar	39121
ácido 2-cianoacético	Sigma-Aldrich	C88505
4-Dimetilaminopiridina	TCI America	D1450
8 poços Tampa de lamínula com câmara	Thermo Fisher	155409
placa de 96 poços	Corning	353072
etanol	absolutoThermo Fisher	BP2818500
acetona	Sigma-Aldrich	179124
acetonitrila	Sigma-Aldrich	34851
alilamina	Sigma-Aldrich	145831
Basic Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC32G
ácido cítrico	Sigma-Aldrich	251275
concentrado ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	H1758
Água deionizada	Thermo Fisher	15230147
diclorometano	Sigma-Aldrich	éter
	Sigma-Aldrich 296082
Dicarbonato de di-terc-butila	Sigma-Aldrich	361941
acetato de etila	Sigma-Aldrich	319902
etilcarbamato	Sigma-Aldrich	U2500
Fibronectina	Thermo Fisher	Solução Fixadora PHE0023
(4% de formaldeído preparado em PBS)	Thermo Fisher	R37814
cloridrato de guanidínio	Alfa Aesar	A13543
hexanos	Sigma-Aldrich	227064
Humano células-tronco mesenquimais	Lonza	PT-2501
metanol	Sigma-Aldrich	34860
iodeto de metila	Sigma-Aldrich	289566
N,N-Diisopropiletilamina	Alfa Aesar	A17114
N,N-dimetilformamida	Sigma-Aldrich	227056
N-metilmorfolina N-óxido Alfa	Aesar	A19802
Tetraóxido de ósmio	Alfa Aesar	45385
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher	15140163
Solução tampão fosfato	Thermo Fisher	20012050
cloreto de fosforil	Sigma-Aldrich	201170
carbonato de potássio	Sigma-Aldrich	347825
coluna de fase reversa	Thermo Fisher	25305-154630
Rodamina Faloidina	Thermo Fisher	R415
gel de sílica	TCI America	S0821
bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S6014
etóxido de sódio	Alfa Aesar	L13083
periodeto de sódio	Sigma-Aldrich	71859
sulfato de sódio	Sigma-Aldrich	239313
sulfito de sódio	Sigma-Aldrich	S0505
triacetoxiborohidreto de sódio	Alfa Aesar	B22060
espectrofotômetro(NanoDrop One/Onec UV-Vis)	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Meio de Crescimento de Células-Tronco BulletKit	Lonza	PT-3001
tetrahidrofurano	Sigma-Aldrich	401757
tioanisol	Sigma-Aldrich	T28002
tolueno	Sigma-Aldrich	179418
trietilamina	Alfa Aesar	A12646
ácido trifluoroacético	Alfa Aesar	A12198
Triton X-100	Thermo Fisher	HFH10
Solução de tripsina-EDTA	Thermo Fisher	25200056

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