Caracterização das Propriedades de Transporte Intra-Cartilagem dos Transportadores de Peptídeos Cationic

Resumo

Este protocolo determina a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão de não-equilíbrio para portadores de peptídeos cationicos na cartilagem. A caracterização das propriedades de transporte é fundamental para garantir uma resposta biológica eficaz. Esses métodos podem ser aplicados para projetar um portador de drogas com carga ideal para direcionar tecidos carregados negativamente.

Resumo

Vários tecidos carregados negativamente no corpo, como a cartilagem, apresentam uma barreira para o fornecimento de medicamentos direcionados devido à sua alta densidade de aggrecans carregados negativamente e, portanto, requerem métodos de mira melhorados para aumentar sua resposta terapêutica. Como a cartilagem tem uma alta densidade de carga fixa negativa, as drogas podem ser modificadas com portadores de drogas positivamente carregados para tirar proveito das interações eletrostáticas, permitindo um maior transporte de drogas intra-cartilagem. Estudar o transporte de transportadores de drogas é, portanto, crucial para prever a eficácia dos medicamentos na indução de uma resposta biológica. Mostramos o desenho de três experimentos que podem quantificar a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão não-equilíbrio de portadores de peptídeos cationicos em explantas de cartilagem. Os experimentos de absorção de equilíbrio fornecem uma medida da concentração de soluto dentro da cartilagem em comparação com seu banho circundante, o que é útil para prever o potencial de um portador de drogas no aumento da concentração terapêutica de drogas na cartilagem. Estudos de profundidade de penetração utilizando microscopia confocal permitem a representação visual da difusão soluto 1D da zona superficial para profunda da cartilagem, o que é importante para avaliar se os solutos atingem seus locais de destino matriz e celular. Estudos de taxa de difusão não-equilíbrio utilizando uma câmara de transporte personalizada permitem medir a força das interações de ligação com a matriz tecidual caracterizando as taxas de difusão de solutos fluorescentes rotulados através do tecido; isso é benéfico para projetar portadores de força de ligação ideal com cartilagem. Juntos, os resultados obtidos a partir dos três experimentos de transporte fornecem uma diretriz para projetar portadores de medicamentos com carga ideal que se aproveitam de interações de carga fracas e reversíveis para aplicações de entrega de medicamentos. Estes métodos experimentais também podem ser aplicados para avaliar o transporte de drogas e conjugados portadores de drogas. Além disso, esses métodos podem ser adaptados para uso na segmentação de outros tecidos carregados negativamente, como menisco, córnea e humor vítreo.

Introdução

A entrega de drogas para tecidos carregados negativamente no corpo continua sendo um desafio devido à incapacidade de as drogas penetrarem profundamente no tecido para alcançar os locais-alvo das células e matrizes¹. Vários desses tecidos são compostos por aggrecans densamente embalados e carregados negativamente que criam uma alta densidade de carga fixa negativa (FCD)² dentro do tecido e agem como uma barreira para a entrega da maioria das macromoléculas^3,,4. No entanto, com a ajuda de portadores de medicamentos carregados positivamente, essa barreira tecidual ....

Protocolo

Foram obtidas aprovações universitárias para a realização dos experimentos com tecidos mortos. As juntas bovinas foram obtidas comercialmente a partir de um matadouro.

1. Extração de explante de cartilagem

1. Utilizando um bisturi (#10 lâmina), corte e remova gordura, músculos, ligamentos, tendões e todos os outros tecidos conjuntivos para expor a cartilagem do sulco femoropatelar das articulações do joelho bovino.
2. Usando socos dérmicos de 3 mm e 6 mm, faça socos perpendiculares na cartilagem para extrair plugues cilíndricos. Coloque imediatamente os plugues em poços individuais de uma placa de 48 poços contendo 500 μL de 1....

Resultados

Após a absorção de equilíbrio de CPCs por cartilagem, a fluorescência do banho diminui quando o soluto é tomado pelo tecido. No entanto, se o valor da fluorescência do banho final permanecer semelhante ao inicial, indica que não há absorção soluto mínima/mínima. Outra confirmação da absorção de soluto é se o tecido mudou visivelmente de cor para a cor do corante fluorescente. A absorção quantitativa de solutos na cartilagem foi determinada utilizando-se a razão de absorção (R_U) após os valores de fluorescência.......

Discussão

Os métodos e protocolos descritos aqui são significativos para o campo da entrega de medicamentos direcionados para tecidos carregados negativamente. Devido à alta densidade de aggrecans carregados negativamente presentes nesses tecidos, cria-se uma barreira, impedindo assim que as drogas atinjam seus locais de destino celular que estão no fundo da matriz. Para enfrentar este desafio pendente, os medicamentos podem ser modificados para incorporar portadores de medicamentos carregados positivamente que podem aumentar a ta.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Arruela SAE de Aço Inoxidável 316	McMaster-Carr	91950A044	Para tamanho de parafuso número 5, 0.14" ID, 0.312" OD
Placa de Poliestireno de 96 Poços	Fisherbrand	12566620
Calibre Grosso Polímero	Reynolds	N/A	Para difusão não equilibrada e câmara de transporte de difusão 1-D
Antibiótico-Antimicótico	Gibco	15240062	100x
de Cartilagem Bovina	87	N/A	2-3 semanas de idade, sulco femoropatelar
Albumina de soro bovino	Fisher BioReagents	BP671-1
CPC+14	LifeTein	LT1524	Peptídeo personalizado
CPC+20	LifeTein	LT1525	Peptídeo personalizado
CPC+8	LifeTein	LT1523	personalizado Limpador de Tarefas
Delicadas	Kimberly-Clark Professional	34155
Dermal Punch	MedBlades	MB5-1	3, 4 e 6 mm
Lâminas de Microscópio de Vidro Econômico de Vidro Plano	Fisherbrand	12550A3
Placas de Cultura de Células de Fundo Plano	Corning Costar	3595	Transparente, 96 bem
Filme de Embalagem Flexível	Bemis Parafilm M Laboratório	1337412
Gold Seal Vidro de Cobertura	Microscopia Eletrônica Ciências	6378701	# 1.5, 18x18 mm
Perfurador de Furo Acionado por Martelo	McMaster-Carr	3427A15	de 1/2" de Diâmetro
	McMaster-Carr	3427A19	Laser de 3/4" de Diâmetro
	Chroma Technology	AT480/30m	Espectrofotômetro Laser
Porca sextavada de aço leve de baixa resistência	McMaster-Carr	90480A007	6-32 Tamanho da rosca
LSM 700 Microscópio Confocal	Zeiss	LSM 700
Barras de agitação micromagnéticas	Bel-Art Spinbar	F37119-0007 Folha de	7x2 mm
	McMaster-Carr	1370N12	1/32" de espessura
Leite bovino seco sem gordura	Placa de Petri Sigma Aldrich	M7409
	Chemglass Life Sciences	CGN1802145	150 mm
de diâmetro Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CMR	1x
Agitador de Placas	VWR	89032-088
Lâminas de	Thermo Scientific	A32953
Fisherbrand		12640
Folha de calibre fino de acrílico R-Cast	Reynolds Polymer	N/A	Inserções de câmara de transporte preta
RTV Silicone	Loctite	234323	Epóxi, Não corrosivo,
bisturi	TedPella	549-3	#10, #11 lâminas
Receptor de sinal	Chroma Technology	ET515lp	Espectrofotômetro Receptor de sinal a laser
Microcentrífuga Snap-Cap Tubos	Eppendorf	22363204	1,5 mL
TedPella	13508
Synergy H1 Leitor de Microplacas	Biotek	H1M
Parafuso de cabeça cilíndrica de aço de liga zincado	McMaster-Carr	90128A153	6-32 Tamanho da rosca, 1" de comprimento

Folha de Acrílico Preto dePesquisa Perfurador de Furo Acionado por Martelo borracha de neoprene multiuso Barbear transparente Espátula de