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Artigo de método

Caracterização das Propriedades de Transporte Intra-Cartilagem dos Transportadores de Peptídeos Cationic

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DOI:

10.3791/61340

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10 de agosto de 2020

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Department of Mechanical & Industrial Engineering, Northeastern University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo determina a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão de não-equilíbrio para portadores de peptídeos cationicos na cartilagem. A caracterização das propriedades de transporte é fundamental para garantir uma resposta biológica eficaz. Esses métodos podem ser aplicados para projetar um portador de drogas com carga ideal para direcionar tecidos carregados negativamente.

Resumo

Vários tecidos carregados negativamente no corpo, como a cartilagem, apresentam uma barreira para o fornecimento de medicamentos direcionados devido à sua alta densidade de aggrecans carregados negativamente e, portanto, requerem métodos de mira melhorados para aumentar sua resposta terapêutica. Como a cartilagem tem uma alta densidade de carga fixa negativa, as drogas podem ser modificadas com portadores de drogas positivamente carregados para tirar proveito das interações eletrostáticas, permitindo um maior transporte de drogas intra-cartilagem. Estudar o transporte de transportadores de drogas é, portanto, crucial para prever a eficácia dos medicamentos na indução de uma resposta biológica. Mostramos o desenho de três experimentos que podem quantificar a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão não-equilíbrio de portadores de peptídeos cationicos em explantas de cartilagem. Os experimentos de absorção de equilíbrio fornecem uma medida da concentração de soluto dentro da cartilagem em comparação com seu banho circundante, o que é útil para prever o potencial de um portador de drogas no aumento da concentração terapêutica de drogas na cartilagem. Estudos de profundidade de penetração utilizando microscopia confocal permitem a representação visual da difusão soluto 1D da zona superficial para profunda da cartilagem, o que é importante para avaliar se os solutos atingem seus locais de destino matriz e celular. Estudos de taxa de difusão não-equilíbrio utilizando uma câmara de transporte personalizada permitem medir a força das interações de ligação com a matriz tecidual caracterizando as taxas de difusão de solutos fluorescentes rotulados através do tecido; isso é benéfico para projetar portadores de força de ligação ideal com cartilagem. Juntos, os resultados obtidos a partir dos três experimentos de transporte fornecem uma diretriz para projetar portadores de medicamentos com carga ideal que se aproveitam de interações de carga fracas e reversíveis para aplicações de entrega de medicamentos. Estes métodos experimentais também podem ser aplicados para avaliar o transporte de drogas e conjugados portadores de drogas. Além disso, esses métodos podem ser adaptados para uso na segmentação de outros tecidos carregados negativamente, como menisco, córnea e humor vítreo.

Introdução

A entrega de drogas para tecidos carregados negativamente no corpo continua sendo um desafio devido à incapacidade de as drogas penetrarem profundamente no tecido para alcançar os locais-alvo das células e matrizes1. Vários desses tecidos são compostos por aggrecans densamente embalados e carregados negativamente que criam uma alta densidade de carga fixa negativa (FCD)2 dentro do tecido e agem como uma barreira para a entrega da maioria das macromoléculas3,,4. No entanto, com a ajuda de portadores de medicamentos carregados positivamente, essa barreira tecidual carregada negativamente pode ser convertida em um depósito de drogas através de interações de carga eletrostática para entrega sustentada de medicamentos1,,5,,6,7(Figura 1).

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Figura 1: Entrega intra cartilagem baseada em carga de CPCs. Injeção intra-articular de CPCs no espaço articular do joelho. Interações eletrostáticas entre CPCs carregados positivamente e grupos aggrecanos carregados negativamente permitem penetração rápida e completa de profundidade através da cartilagem. Este número foi modificado de Vedadghavami et al4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Recentemente, os portadores de peptídeos cáticos de curto comprimento (CPCs) foram projetados com o objetivo de criar pequenos domínios cônicos capazes de realizar terapêuticas de tamanho maior para entrega à cartilagem4carregada negativamente . Para o fornecimento eficaz de medicamentos à cartilagem para o tratamento de doenças prevalentes8,,9 e degenerativas como a osteoartrite (OA)10, é fundamental que as concentrações terapêuticas de drogas penetrem profundamente dentro do tecido, onde a maioria das células de cartilagem (condrócitos)residem 11. Embora existam vários medicamentos potenciais modificados por doenças disponíveis, nenhum deles obteve a aprovação da FDA porque estes são incapazes de atingir efetivamente a cartilagem12,13. Portanto, a avaliação das propriedades de transporte dos transportadores de drogas é necessária para prever a eficácia dos medicamentos na indução de uma resposta terapêutica. Aqui, projetamos três experimentos separados que podem ser utilizados para avaliar a captação de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão não-equilíbrio dos CPCs4.

Para garantir que haja uma concentração suficiente de medicamentos dentro da cartilagem que possa fornecer uma resposta terapêutica ideal, os experimentos de absorção foram projetados para quantificar a concentração de CPC de equilíbrio na cartilagem4. Neste desenho, seguindo um equilíbrio entre a cartilagem e seu banho circundante, a quantidade total de soluto dentro da cartilagem (vinculada à matriz ou livre) pode ser determinada usando uma razão de absorção. Essa razão é calculada pela normalização da concentração de solutos dentro da cartilagem ao do banho de equilíbrio. Em princípio, solutos neutros, cuja difusão através da cartilagem não é assistida por interações de carga, teriam uma razão de absorção inferior a 1. Por outro lado, solutos cáticos, cujo transporte é aprimorado através de interações eletrostáticas, mostram uma razão de absorção maior que 1. No entanto, como mostrado com os CPCs, o uso de uma carga positiva ideal pode resultar em taxas de absorção muito maiores (superiores a 300)4.

Embora a alta concentração de medicamentos dentro da cartilagem seja importante para alcançar o benefício terapêutico, também é fundamental que as drogas difundam através da espessura total da cartilagem. Portanto, estudos mostrando a profundidade da penetração são necessários para garantir que os medicamentos cheguem fundo dentro da cartilagem para que os locais de matriz e destino celular possam ser alcançados, proporcionando assim uma terapia mais eficaz. Este experimento foi projetado para avaliar a difusão unidirecional de solutos através da cartilagem, simulando a difusão de drogas em cartilagem após injeção intra-articular in vivo. A imagem de fluorescência usando microscopia confocal permite a avaliação da profundidade de penetração na cartilagem. A carga de partículas líquidas desempenha um papel fundamental na moderação de como drogas profundas podem difundir através da matriz. Uma carga líquida ideal baseada em um tecido FCD é necessária para permitir interações de ligação fraca-reversíveis entre partículas cônicas e a matriz tecidual. Isso implica que qualquer interação é fraca o suficiente para que as partículas possam se desassociar da matriz, mas reversível na natureza para que possa se ligar a outro local de ligação de matriz mais profunda dentro do tecido4. Por outro lado, a carga líquida positiva excessiva de uma partícula pode ser prejudicial para a difusão, uma vez que a ligação matricial muito forte impede o descolamento de partículas do local de ligação inicial na zona superficial da cartilagem. Isso resultaria em uma resposta biológica insuficiente, pois a maioria dos locais alvos está profundamente dentro do tecido11.

Para quantificar ainda mais a força das interações de ligação, a análise das taxas de difusão de medicamentos através da cartilagem é vantajosa. Estudos de difusão de não equilíbrio permitem a comparação das taxas de difusão em tempo real entre diferentes solutos. À medida que as drogas se difundem através das zonas superficiais, médias e profundas da cartilagem, a presença de interações de ligação pode alterar muito as taxas de difusão. Quando as interações de ligação estão presentes entre as drogas e a matriz da cartilagem, ela é definida como a difusividade efetiva(D EFF). Neste caso, uma vez ocupados todos os locais vinculantes, a taxa de difusão de medicamentos é regida pela difusão de estado estável(SS). A comparação entre oEFF D de solute diferente determina a força relativa de ligação dos solutos com a matriz. Para um determinado soluto, se o DEFF e dSS estão dentro da mesma ordem de magnitude, implica que há uma ligação mínima presente entre a droga e a matriz durante a difusão. No entanto, seo D EFF for maior que o DSS,existe uma ligação substancial de partículas à matriz.

Os experimentos projetados individualmente permitem a caracterização do transporte soluto através da cartilagem, no entanto, uma análise holística inclusiva de todos os resultados é necessária para projetar um portador de medicamentos com carga ideal. A natureza fraca e reversível das interações de carga controla a taxa de difusão de partículas e permite uma alta absorção de equilíbrio e rápida penetração de profundidade total através da cartilagem. Através de experimentos de captação de equilíbrio, devemos procurar portadores que apresentem alta absorção como resultado de interações de carga que podem ser verificadas por meio de estudos de taxa de difusão de não equilíbrio. No entanto, essas interações de ligação devem ser fracas e reversíveis na natureza para permitir a penetração da espessura total do soluto através da cartilagem. Um portador de drogas ideal possui uma carga ideal que permite uma ligação forte o suficiente para absorção e altas concentrações de drogas intra-cartilagem, mas não muito forte a ponto de impedir a difusão de espessura total4. Os experimentos apresentados auxiliarão nas características de design para os portadores de medicamentos baseados em carga. Esses protocolos foram utilizados para caracterizar o transporte de CPC através da cartilagem4,porém, estes também podem ser aplicados a uma variedade de medicamentos e portadores de drogas através de cartilagem e outros tecidos carregados negativamente.

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Protocolo

Foram obtidas aprovações universitárias para a realização dos experimentos com tecidos mortos. As juntas bovinas foram obtidas comercialmente a partir de um matadouro.

1. Extração de explante de cartilagem

  1. Utilizando um bisturi (#10 lâmina), corte e remova gordura, músculos, ligamentos, tendões e todos os outros tecidos conjuntivos para expor a cartilagem do sulco femoropatelar das articulações do joelho bovino.
  2. Usando socos dérmicos de 3 mm e 6 mm, faça socos perpendiculares na cartilagem para extrair plugues cilíndricos. Coloque imediatamente os plugues em poços individuais de uma placa de 48 poços contendo 500 μL de 1x de salina tamponada de fosfato (PBS) suplementada com 1% v/v antibiótico-antimíctico.
  3. Coloque o lado superficial de um plugue de cartilagem voltado para baixo em um poço na luminária de corte(Figura 2). Usando uma lâmina de barbear, corte o plugue ao longo da superfície do aparelho de corte para obter uma explanta de cartilagem de 1 mm de espessura que é inclusiva da zona superficial. Repita para cada tampão de cartilagem.
  4. Armazene explanagens de cartilagem individualmente em tubos de polipropileno contendo 500 μL de 1x PBS complementados com inibidores de protease (PBS-PI, 1 pi mini-tablet por 50 mL 1x PBS) a -20 °C.
  5. Antes de realizar cada um dos seguintes experimentos de transporte, descongele os frascos contendo explant por 30 minutos em um banho de água de 37 °C.

figure-protocol-1
Figura 2: Luminária de corte projetada sob medida. Parâmetros de projeto de luminária de corte de aço inoxidável utilizada para cortar explanações de cartilagem de 3 e 6 mm de diâmetro. Inserções plásticas de espessura variada foram colocadas dentro de poços para ajustar a espessura das explantas fatiadas. Pino cilíndrico de aço inoxidável de <1 mm de diâmetro foi usado para empurrar a explanta para fora da fixação. Todos os valores numéricos são apresentados em mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Captação de equilíbrio de CPCs na cartilagem

  1. Explantas de cartilagem suavemente dab (3 mm dia. X 1 mm de espessura.) com uma delicada limpeza de tarefa para remover o excesso de 1x PBS da superfície da explant. Usando um equilíbrio, registe rapidamente o peso úmido de cada explanta e, em seguida, coloque imediatamente em um banho pbs 1x para evitar a desidratação.
  2. Prepare 30 soluções μM (300 μL por explant) de CPCs rotulados fluorescentemente em 1x PBS-PI. Use tubos de polipropileno sem RNase para reconstituição.
  3. Em uma placa de 96 poços, pipeta 300 μL de cada solução CPC de 30 μM em poços separados. Evite usar poços perto da borda da placa para evitar a evaporação. Usando uma espátula, transfira cada explanta para a solução que contém poços.
  4. Encha os poços circundantes com 300 μL de 1x PBS e cubra a placa do poço com tampa. Sele as bordas da placa com filme flexível para minimizar a evaporação.
  5. Dentro de uma incubadora de 37 °C, coloque a placa em um agitador de placas para limitar a sedimentação da partícula. Incubar por 24 horas sob rotação suave (50 rpm com órbita de 15 mm) para permitir a absorção de equilíbrio de CPCs na cartilagem(Figura 3).
  6. Gerar uma curva padrão para correlação de fluorescência à concentração de CPC
    1. Prepare diluições seriais de soluções CPC a partir de 30 μM – 0 μM (diluições de 10 vezes) em 1x PBS-PI em tubos de polipropileno. Certifique-se de que pelo menos 500 μL de cada diluição esteja presente.
    2. Adicione 200 μL de cada diluição a poços consecutivos em uma placa preta de 96 poços. Duplicar em outra linha para aumentar o tamanho da amostra.
    3. Obtenha leituras de fluorescência de cada amostra usando um leitor de placas nos comprimentos de onda de excitação e emissão do rótulo fluorescente usando um leitor de placas.
    4. Plote a leitura da fluorescência vs. concentração de CPC e deriva uma equação para a porção linear da curva.
      NOTA: Para limitar a variabilidade nas leituras de fluorescência, incubar a solução de estoque CPC nas mesmas condições da placa de amostra antes da geração da curva padrão.
  7. Após 24 h de incubação, colete o banho de equilíbrio de cada poço em tubos separados de polipropileno.
  8. Transfira 200 μL de cada solução em poços separados de uma placa preta de 96 poços. Obtenha leituras de fluorescência de cada amostra sob as mesmas configurações fluorescentes da curva padrão. Se necessário, dilui a amostra em 1x PBS-PI para garantir que as leituras fiquem dentro da porção linear da curva padrão.

figure-protocol-2
Figura 3: Esquema de experimentos de captação de equilíbrio. Explantas de cartilagem (3 mm dia. x 1 mm de espessura) foram colocadas em poços individuais em uma placa de 96 poços contendo solução CPC marcada fluorescentemente. Após 24h, os CPCs foram tomados pela cartilagem, reduzindo assim a fluorescência do banho circundante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Profundidade de penetração de CPCs na cartilagem

  1. Prepare 30 soluções μM (300 μL por explant) de CPCs rotulados fluorescentemente em 1x PBS-PI. Use tubos de polipropileno sem RNase para reconstituição.
  2. Usando um bisturi, corte explants de cartilagem (6 mm de diâmetro x 1 mm de espessura) ao meio para fazer meio discos. Mantenha a explanta hidratada com uma camada de 1x PBS-PI durante o corte.
  3. Cole uma explanta de meio disco no meio de um poço da câmara de transporte 1-dimensional projetada sob medida usando um epóxi(Figura 4, Figura 5). Certifique-se de que o epóxi seja aplicado no lado circunferencial (curvo) da explant. Remova o excesso de cola do poço para evitar o contato com a superfície de difusão da cartilagem e anote o lado superficial da explanta.
  4. Adicione 80 μL de 1x PBS-PI aos dois lados da explanta. Pipetar o líquido para cima e para baixo de um lado da explanta para verificar se há vazamento para o outro lado. Se ocorrer vazamento, reajuste e aplique epóxi conforme necessário.
  5. Substitua o PBS-PI 1x do lado voltado para a superfície superficial da cartilagem (upstream) por 80 μL de solução CPC de 30 μM. Mantenha 80 μL de 1x PBS-PI na lateral voltada para a zona profunda da cartilagem (rio abaixo).
  6. Coloque cuidadosamente a câmara de transporte em um recipiente de cobertura. Cubra a base do recipiente com uma camada 1x PBS para evitar a evaporação de soluções. Certifique-se de que não há contato direto entre soluções de câmaras a montante e rio abaixo.
  7. Coloque o recipiente coberto em um agitador de placas para limitar a sedimentação de partículas. Incubar por 4 ou 24 horas em temperatura ambiente sob rotação suave (50 rpm com uma órbita de 15 mm).
  8. Após a incubação, remova a explanta da câmara e corte ~100 μm fatia do centro da explanta.
    NOTA: Esta seção transversal é inclusiva das zonas superficiais, médias e profundas da cartilagem.
  9. Coloque a fatia entre um escorregador de vidro e uma mancha de cobertura. Hidrate a fatia com uma camada de 1x PBS-PI.
  10. Em 10x de ampliação, imagem através da espessura total da fatia para obter z-stack de imagens fluorescentes usando um microscópio confocal.
  11. Usando ImageJ projete a intensidade média das imagens dentro da pilha z para determinar a profundidade de penetração dos CPCs na cartilagem.
    1. Abra a pilha de imagens clicando em Arquivo | Aberto.
    2. Clique em 'Imagem' na barra de tarefas e clique em Imagem | Pilhas | Projeto Z do menu suspenso.
    3. Números de fatia de entrada de 1 para a fatia final. Selecione'Intensidade média' em tipo de projeção. Clique em 'OK.'

figure-protocol-3
Figura 4: Câmara de transporte 1D projetada sob medida. Parâmetros de projeto da câmara de transporte PMMA 1D com 6 poços individuais. Todos os valores numéricos são apresentados em mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-4
Figura 5: Esquema de profundidade de estudos de penetração. As explantas de cartilagem (6 mm de diâmetro x 1 mm de espessura) foram cortadas ao meio e fixadas ao centro de poços de transporte difusivos 1D. A solução CPC com etiqueta fluorescente foi adicionada ao lado do poço em contato com a zona superficial (SZ) da cartilagem. 1x PBS-PI foi adicionado ao lado do poço em contato com a zona profunda (DZ) da cartilagem. Após a difusão, uma seção transversal da cartilagem (3 mm x 1 mm) foi imageda por meio de microscopia confocal. Este valor foi modificado de Vedadghavami et al.4 e Bajpayee et al.3Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Taxa de difusão não-equilíbrio de CPCs na cartilagem

  1. Reúna as duas metades da câmara de transporte personalizada(Figura 6)para montar e fechar a câmara. Use arruelas, porcas e parafusos para fechar firmemente a câmara com uma chave inglesa.
    NOTA: A câmara de transporte deve ser translúcida para não interferir com leituras fluorescentes. As câmaras de transporte utilizadas neste protocolo são feitas de polimetilmetato (PMMA).
  2. Cubra o espaço interno da câmara com solução de leite bovino não gordo de 0,5% em 1x PBS (2 mL para cada câmara) por 15 min para evitar a vinculação não específica de CPCs às paredes da câmara. Em seguida, enxágue a câmara com 1x PBS (2 mL para cada câmara).
  3. Usando a luminária de corte personalizada(Figura 2) e uma lâmina de barbear, corte uma explanta de cartilagem de 6 mm de diâmetro (plano transversal) até uma espessura de 500-800 μm, incluindo a zona superficial. Mantenha a explant hidratada com 1x PBS.
  4. Usando socos dérmicos e perfurados dérmicos, crie juntas a partir de folhas de borracha, como mostrado na Figura 7.
  5. Monte cada meia câmara de transporte para incluir 1 junta de borracha grande, 1 inserção PMMA e 1 pequena junta de borracha cada. Coloque a explanta nos poços da pastilha plástica, com a zona superficial voltada para a câmara rio acima. Sanduíche as duas metades juntas para completar o conjunto e parafuso firmemente usando uma chave inglesa(Figura 7).
  6. Encha a câmara upstream com 2 mL de 1x PBS-PI e observe a câmara a jusante para vazamento de fluido da câmara a montante. Se houver vazamento, remonte a câmara, ajustando a posição da junta e o aperto dos parafusos. Se não houver vazamento, encha a câmara a jusante com 2 mL 1x PBS-PI também.
  7. Adicione uma mini-barra de mexida em câmaras para cima e para baixo e coloque a câmara em uma placa de agitação. Alinhe a câmara para que o laser do espectotômetro esteja focado no centro da câmara a jusante. Coloque a porção do receptor de sinal do espectrofotômetro atrás da câmara a jusante(Figura 8).
    NOTA: O laser e o receptor do espectotômetro devem ser equipados com os filtros apropriados para excitar, emitir e transmitir sinais da proteína fluorescentemente rotulada. Proteja a câmara de transporte da luz usando uma caixa preta durante a experimentação para evitar interferências no sinal de fluorescência. É melhor a prática selar as aberturas em cima da câmara com filme flexível para evitar a evaporação.
  8. Colete leituras de emissão de fluorescência a jusante em tempo real e garanta um sinal estável por pelo menos 5 minutos.
    NOTA: As alíquotas da câmara a jusante podem ser obtidas e avaliadas para fluorescência usando um leitor de placas se um espectrômetro personalizado ou câmara de transporte translúcida não estiver disponível.
  9. Pipeta um volume pré-calculado de solução de estoque de CPCs fluorescentes marcados na câmara upstream para garantir uma concentração final de 3 μM dentro da câmara upstream. Observe o sinal de fluorescência a jusante e permita que o transporte soluto atinja um aumento constante na inclinação.
    NOTA: Uma explanta de cartilagem mais espessa exigirá mais tempo para atingir o estado estável.
  10. Uma vez alcançado o estado estável, pegue 20 μL da câmara upstream e adicione à câmara a jusante ("teste de espigão").
    NOTA: Será observado um pico na fluorescência a jusante. Isso permitirá correlação entre leituras de fluorescência e concentração de CPC.
  11. Coletar leituras de fluorescência a jusante em tempo real.

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Figura 6: Câmara de transporte de difusão não-equilíbrio projetada sob medida. Parâmetros de projeto da câmara de transporte de difusão de não equilíbrio PMMA. A câmara deve ser translúcida para não interferir nas leituras de fluorescência. A câmara de transporte completa consistia de duas metades idênticas da luminária mostrada. Dois pinos cilíndricos de aço inoxidável (~2,94 mm de diâmetro, ~18 mm de comprimento) foram necessários para garantir o alinhamento e o fechamento completo das metades da câmara. Quatro ranhuras idênticas para parafusos de rosca de 6-32 foram feitas em cada canto da câmara para montagem apertada do parafuso. Todos os valores numéricos são apresentados em milímetros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Montagem da câmara de transporte de difusão de não equilíbrio. Parâmetros de design de (A) pastilhas PMMA pretas e(B) juntas de borracha grandes e pequenas. A espessura das juntas de borracha foi ajustada para garantir o fechamento apertado da câmara. Todos os valores numéricos são apresentados em mm. (C) Esquema mostrando a ordem de montagem para duas metades da câmara de transporte com explanta de cartilagem colocada no centro. SZ indica zona superficial de cartilagem que estava voltada para a câmara rio acima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Esquema de experimentos de difusão de não-equilíbrio. Explantas de cartilagem (6 mm de diâmetro x 1 mm de espessura) foram colocadas no centro da câmara de transporte com a superfície superficial voltada para a câmara a montante. Os lados para cima e para baixo da câmara foram preenchidos com 1x PBS-PI e misturados usando uma mini barra de mex. Com um laser apontado para a câmara a jusante para coletar leituras fluorescentes, a solução CPC marcada fluorescentemente foi adicionada à câmara upstream. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Após a absorção de equilíbrio de CPCs por cartilagem, a fluorescência do banho diminui quando o soluto é tomado pelo tecido. No entanto, se o valor da fluorescência do banho final permanecer semelhante ao inicial, indica que não há absorção soluto mínima/mínima. Outra confirmação da absorção de soluto é se o tecido mudou visivelmente de cor para a cor do corante fluorescente. A absorção quantitativa de solutos na cartilagem foi determinada utilizando-se a razão de absorção (RU) após os valores de fluorescência...

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Discussão

Os métodos e protocolos descritos aqui são significativos para o campo da entrega de medicamentos direcionados para tecidos carregados negativamente. Devido à alta densidade de aggrecans carregados negativamente presentes nesses tecidos, cria-se uma barreira, impedindo assim que as drogas atinjam seus locais de destino celular que estão no fundo da matriz. Para enfrentar este desafio pendente, os medicamentos podem ser modificados para incorporar portadores de medicamentos carregados positivamente que podem aumentar a ta...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa dos Estados Unidos através dos Programas de Pesquisa Médica Dirigidos pelo Congresso (CDMRP) sob o contrato W81XWH-17-1-0085, e o Instituto Nacional de Saúde R03 EB025903-1. A AV foi financiada pela Faculdade de Engenharia da Universidade do Nordeste.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Arruela SAE de Aço Inoxidável 316McMaster-Carr91950A044Para tamanho de parafuso número 5, 0.14" ID, 0.312" OD
Placa de Poliestireno de 96 PoçosFisherbrand12566620
Calibre Grosso PolímeroReynoldsN/APara difusão não equilibrada e câmara de transporte de difusão 1-D
Antibiótico-AntimicóticoGibco15240062100x
de Cartilagem Bovina87N/A2-3 semanas de idade, sulco femoropatelar
Albumina de soro bovinoFisher BioReagentsBP671-1
CPC+14LifeTeinLT1524Peptídeo personalizado
CPC+20LifeTeinLT1525Peptídeo personalizado
CPC+8LifeTeinLT1523personalizado Limpador de Tarefas
DelicadasKimberly-Clark Professional34155
Dermal PunchMedBladesMB5-13, 4 e 6 mm
Lâminas de Microscópio de Vidro Econômico de Vidro PlanoFisherbrand12550A3
Placas de Cultura de Células de Fundo PlanoCorning Costar3595Transparente, 96 bem
Filme de Embalagem FlexívelBemis Parafilm M Laboratório1337412
Gold Seal Vidro de CoberturaMicroscopia Eletrônica Ciências6378701# 1.5, 18x18 mm
Perfurador de Furo Acionado por MarteloMcMaster-Carr3427A15de 1/2" de Diâmetro
McMaster-Carr3427A19Laser de 3/4" de Diâmetro
Chroma TechnologyAT480/30mEspectrofotômetro Laser
Porca sextavada de aço leve de baixa resistênciaMcMaster-Carr90480A0076-32 Tamanho da rosca
LSM 700 Microscópio ConfocalZeissLSM 700
Barras de agitação micromagnéticasBel-Art SpinbarF37119-0007 Folha de7x2 mm
McMaster-Carr1370N121/32" de espessura
Leite bovino seco sem gorduraPlaca de Petri Sigma AldrichM7409
Chemglass Life SciencesCGN1802145150 mm
de diâmetro Phosphate-Buffered SalineCorning21-040-CMR1x
Agitador de PlacasVWR89032-088
Lâminas deThermo ScientificA32953
Fisherbrand12640
Folha de calibre fino de acrílico R-CastReynolds PolymerN/AInserções de câmara de transporte preta
RTV SiliconeLoctite234323Epóxi, Não corrosivo,
bisturiTedPella549-3#10, #11 lâminas
Receptor de sinalChroma TechnologyET515lpEspectrofotômetro Receptor de sinal a laser
Microcentrífuga Snap-Cap TubosEppendorf223632041,5 mL
TedPella13508
Synergy H1 Leitor de MicroplacasBiotekH1M
Parafuso de cabeça cilíndrica de aço de liga zincadoMcMaster-Carr90128A1536-32 Tamanho da rosca, 1" de comprimento
Folha de Acrílico Preto dePesquisa Perfurador de Furo Acionado por Martelo borracha de neoprene multiuso Barbear transparente Espátula de

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