Digestão de olhos inteiros de rato para análise citométrica de fluxo multi-parameter de fagocitos mononucleares

Resumo

Este protocolo fornece um método para digerir olhos inteiros em uma única suspensão celular com o propósito de análise citométrica de fluxo de vários parâmetros, a fim de identificar populações fagocíticas mononucleares específicas, incluindo monócitos, microglia, macrófagos e células dendríticas.

Resumo

O sistema imunológico inato desempenha papéis importantes na fisiopatologia ocular, incluindo uveíte, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. As células imunes inatas, especificamente os faócitos mononucleares, expressam marcadores de superfície celular sobrepostos, o que torna a identificação dessas populações um desafio. A citometria de fluxo de vários parâmetros permite a análise quantitativa simultânea de marcadores de superfície de múltiplas células, a fim de diferenciar monócitos, macrófagos, microglia e células dendríticas nos olhos do rato. Este protocolo descreve a enucleação de olhos inteiros do rato, dissecção ocular, digestão em uma única suspensão celular e coloração da suspensão de célula única para marcadores de células mielóides. Além disso, explicamos os métodos adequados para determinar tensões usando controles de cor única e para delinear portões positivos usando fluorescência menos um controles. A maior limitação da citometria de fluxo de vários parâmetros é a ausência de arquitetura tecidual. Essa limitação pode ser superada pela citometria de fluxo de vários parâmetros de compartimentos oculares individuais ou coloração de imunofluorescência complementar. No entanto, a imunofluorescência é limitada pela sua falta de análise quantitativa e pelo número reduzido de fluoroforos na maioria dos microscópios. Descrevemos o uso de citometria de fluxo multiparamétrico para fornecer análises altamente quantitativas de fagocitos mononucleares na neovascularização choroidal induzida por laser. Além disso, a citometria de fluxo de vários parâmetros pode ser usada para a identificação de subconjuntos de macrófagos, mapeamento de destinos e classificação celular para estudos transcriômicos ou proteômicos.

Introdução

O sistema imunológico inato inclui múltiplos tipos de células que estimulam a ativação e inflamação complementares. As células imunes inatas incluem células assassinas naturais (NK), células de mastro, basófilos, eosinófilos, neutrófilos e fagocitos mononucleares. Os fagocitos mononucleares, compostos por monócitos, macrófagos e células dendríticas, foram implicados na fisiopatologia de múltiplas condições oftálmicas, incluindo uveíte, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade (AMD)¹. Neste protocolo, focaremos na identificação de faócitos mononucleares utilizando análises citométricas de fluxo de vários parâmetros em um modelo de mouse de AMD neovascular². Este protocolo é adaptável para modelos de camundongos de retinopatia diabética e/ou uveíte, mas a dissecção ocular mais extensa é recomendada devido à natureza sistêmica dessas doenças.

Os fagocitos mononucleares expressam marcadores de superfície de células sobrepostos. Os macrófagos residentes de tecido de longa duração e a microglia são originários do progenitor de células eritrolóides derivados da gema^3,enquanto a reciclagem de macrófagos e células dendríticas se diferenciam do progenitor de células dendríticas derivados da medula óssea⁴. Os marcadores de superfície de células do rato comuns a monócitos, macrófagos e células dendríticas incluem CD45, CD11b⁵, F4/80^6,Cx3cr1⁷e o marcador intracelular Iba1⁸. Para superar esse desafio, a análise transcriômica de macrófagos, monócitos e células dendríticas de múltiplos tecidos define CD64 como um marcador de superfície celular específico para macrófago⁶. Macrófagos foram descritos na íris, corpo ciliar, ciliar e nervo óptico em olhos saudáveis³. Alternativamente, a identificação de células dendríticas é mais difícil; o método mais específico de identificação celular dendrítica requer mapeamento do destino usando o mouse repórter Zbtb46-GFP⁹. Independente desta linha de repórteres, a expressão de CD11c e MHCII em conjunto com a ausência de CD64 pode identificar potenciais células dendríticas^6,10. Células dendríticas foram identificadas em córnea, conjuntiva, íris e coroide em olhos normais¹¹. Microglia são macrófagos especializados localizados na retina, protegidos pela barreira hemrateira-retina, e derivados de células progenitoras do sac gema¹². Como resultado, a microglia da retina pode ser diferenciada dos macrófagos derivados de monócitos por seus níveis fracos de expressão CD45¹³ e altos níveis de Tmem119, que está disponível como anticorpo citometria de fluxo¹⁴. Após a ativação da microglia, no entanto, o CD45 pode ser regulado¹⁵ e O Tmem119 pode ser regulado³, demonstrando a complexidade da biologia da microglia e isso é provavelmente relevante tanto na AMD quanto em seu modelo de mouse. Finalmente, os monócitos podem ser divididos em pelo menos dois subtipos, incluindo clássico e não clássico. Monócitos clássicos exibem ccr2⁺Ly6C^altabaixa expressão CX3CR1, e monócitos não clássicos demonstram CCR2^-Ly6C^baixoCX3CR1^{marcadores altos 5}.

Devido à necessidade da análise quantitativa da expressão marcadora, ou seja, níveis altos versus baixos/fracos, a citometria de fluxo de vários parâmetros é o método ideal para a discriminação entre monócitos, macrófagos, microglia e células dendríticas no olho e outros tecidos. Outras vantagens incluem a identificação de sub populações, a capacidade de usar a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) para classificar populações celulares para análise transcriômica ou proteômica e mapeamento do destino. A maior desvantagem da citometria de fluxo de vários parâmetros é a falta de arquitetura tecidual. Isso pode ser superado pela dissecção oftálmica nos diversos subcoentamentos oculares: córnea, conjuntiva, íris, lente, retina e complexo coroide-esclera. Além disso, a imagem confirmatória de imunofluorescência pode ser realizada, mas é limitada pelo número de marcadores e falta de quantitação robusta.

Estudos de associação de genomas associaram múltiplos genes complementares com a AMD¹⁶. A ativação complementar leva à produção de anafilatoxinas, recrutamento de leucócitos e inflamação resultante. Em camundongos deficientes receptores complementares, a lesão a laser reduz o recrutamento de fagocitos mononucleares e a área de neovascularização choroidal induzida por laser (CNV)¹⁷. Da mesma forma, o camundongo c-c 2 (CCR2), que é deficiente no recrutamento de monócitos para o tecido, demonstra tanto a diminuição do recrutamento de faócitos mononucleares quanto a área cnv induzida por laser¹⁸. Esses dados ligam complementos e fagocitos mononucleares com CNV experimental e possivelmente AMD neovascular. Em apoio a esta associação, os receptores complementares são desregulados em monócitos sanguíneos periféricos em pacientes com AMD neovascular^19,20. Esses dados demonstram forte associação entre os faócitos AMD e mononucleares.

Neste manuscrito, usaremos o modelo experimental de CNV induzido a laser para caracterizar as populações de fagocites mononucleares no olho do rato usando citometria de fluxo de vários parâmetros. CnV induzida a laser é o modelo padrão do mouse da AMD neovascular, que demonstrou a eficácia da terapia de AMD neovascular de primeira linha atual²¹. Este protocolo descreverá a enucleação dos olhos do rato, dissecção ocular, digestão em uma única suspensão celular, coloração de anticorpos, determinação de tensões a laser usando controles de cor única e estratégia de gating usando controles de fluorescência menos um (FMO). Para obter uma descrição detalhada do modelo CNV induzido por laser, consulte uma publicação anterior²². Usando este protocolo, definiremos microglias, monócitos, células dendríticas e populações de macrófagos. Além disso, usaremos MHCII e CD11c para definir ainda mais subconjuntos de macrófago dentro do modelo CNV induzido a laser.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade northwestern. Os camundongos C57BL/6 foram alojados em uma instalação de barreira no Centro de Medicina Comparada da Universidade northwestern (Chicago, IL). Todos os animais foram alojados em ciclo claro/escuro de 12/12 h com livre acesso a alimentos e água.

1. Coleta de tecido ocular

1. Sacrificar ratos C57BL/6J de 10-12 semanas de idade de ambos os sexos usando administração regulamentada de dióxido de carbono até que o rato não responda e não inale mais. Realize deslocamento cervical ou outro método secundário aprovado para garantir a eutanásia.
   NOTA: A perfusão transcárvia pode ser realizada para remover leucócitos circulantes que não estão nos tecidos oculares. Neste experimento, a perfusão sistêmica não reduz o número de microglias, monócitos, macrófagos ou células dendríticas detectadas em olhos inteiros tratados sem tratamento ou laser. Portanto, a maioria desses tipos de células estão localizados nos tecidos oftálmicos e esta etapa é opcional.
2. Para enuclear os olhos, empurre para baixo perto da órbita ocular enquanto coloca um par de fórceps curvados suavemente sob o olho enquanto ele se destaca fora da tomada. Pinças fechadas sob o olho sem apertar o olho real. Desalojar o olho da conjuntiva circundante (veja a publicação anterior)²³.
3. Puxe o olho lateralmente até que o nervo óptico seja a única conexão restante para desacopcular o olho. O nervo óptico muitas vezes rompe com a tensão, mas uma pequena tesoura às vezes é necessária para cortar o nervo óptico. Coloque o olho no frio 1x Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) com cálcio e magnésio em tubo de microcentrifuge de 1,7 mL.

2. Digestão do tecido ocular

1. Prepare o tampão de digestão contendo enzima de digestão de 0,1 mg/mL e 0,2 mg/mL DNase em HBSS frio. Reconstituir enzima de digestão de 5 mg em 2 mL de água estéril inicialmente. Prepare uma diluição inicial de 10 mg/mL DNase no HBSS. Para cada 10 mL do tampão de digestão (suficiente para 3 animais) misture 9,4 mL de HBSS frio com 0,4 mL de enzima de digestão reconstituída e 0,2 mL de DNase I diluída.
   NOTA: Essas concentrações foram empiricamente determinadas em vários experimentos para fornecer níveis ideais de coloração de anticorpos de células únicas, ao mesmo tempo em que reduziram a morte celular. A colagenase D foi testada como alternativa à enzima de digestão com viabilidade celular reduzida e diminuição das células CD45⁺ Consulte Discussão para obter mais detalhes sobre o processo iterativo para otimizar a digestão.
2. Sob um microscópio dissecando a 10x de ampliação total, remova o nervo conjuntivo e óptico restante usando fórceps finos e tesouras de mola em HBSS frio.
3. Mova os olhos limpos para um prato de dissecação seca ou pequeno barco de pesagem. Injete 0,15-0,20 mL/olho de tampão de digestão através de seringa equipada com agulha de 30 G na cavidade vítrea após duas feridas perfurantes serem feitas no olho através do eixo visual e 90° de distância desta primeira ferida para saída de tampão de digestão.
4. Pique os olhos inteiros usando tesouras de mola e fórceps finos com todas as peças menores que 0,5 mm x 0,5 mm. Dissociar tecido de lente com interrupção mecânica contundente através de fórceps para evitar entupir pontas de pipeta nas etapas subsequentes. Para cada amostra, enxágue fórceps e tesouras cada uma com 0,75 mL de tampão de digestão em prato pequeno. Use um novo prato para cada amostra.
5. Transfira o conteúdo do prato para um tubo de dissociação no gelo usando pipeta P1000 tomando cuidado para não perder nenhum material na transferência de pipeta. Enxágüe o prato com 1,5 mL adicional de tampão de digestão, elevando o volume total no tubo de dissociação para 3,25-3,50 mL.
6. Coloque o tubo de dissociação invertido em dissociador eletrônico e execute o ciclo "m_brain_03_01", consistindo de rotação unidirecional de 1 min a 200 rpm à temperatura ambiente, que é um programa pré-carregado. Certifique-se de que todo o tecido está na parte inferior do tubo de dissociação em contato com o tampão de digestão e o rotor para este e todos os passos restantes.
7. Coloque o tubo de dissociação na incubadora de agitação por 30 min a 200 rpm a 37 °C.
8. Repita as etapas 2.6 e 2.7 uma vez adicional. Após a segunda incubação de 30 min realizar uma digestão mecânica final usando dissociador eletrônico como na etapa 2.6.
9. Pare a reação adicionando 10 mL de tampão de fluxo frio e coloque tubos no gelo.

3. Preparação da suspensão celular

1. Para criar suspensão unicelular, despeje a reação de digestão ocular parada através de um filtro de 40 μm colocado na parte superior de um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Usando o êmbolo de uma seringa de 2,5 mL, empurre todos os pedaços restantes de tecido ocular não digerido através do filtro.
2. Lave o tubo de dissociação com 10 mL de tampão de fluxo e enxágue o filtro antes de usar o mesmo êmbolo para passar novamente pedaços de tecido ocular não digerido através do filtro.
3. Repita o passo 3.2 usando 5 mL de buffer Flow.
4. Lave o tubo de dissociação e o filtro com um tampão final de 10 mL de flow.
   NOTA: O volume total de digestão e tampão de fluxo é de cerca de 38-40 mL para cada amostra.
5. Centrifugar o tubo cônico a 400 x g por 10 min a 4 °C. Decante o supernatante sem perturbar a pelota celular.
6. Prepare a solução 1x lysing adicionando solução de 10x de lise à água estéril. Quebre a pelota movendo o tubo contra outro tubo. Para lise os glóbulos vermelhos, adicione 1 mL de solução de 1x lysing para 30 s com redemoinhos à temperatura ambiente (RT).
7. Pare a reação com 20 mL de buffer Flow.
8. Centrifugar o tubo cônico a 400 x g por 10 min a 4 °C. Decante o supernatante sem perturbar a pelota celular.
9. Dissociar a pelota movendo o tubo contra outro tubo. Adicione 5 mL de HBSS frio 1x por tubo.
10. Tubos centrífugas a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspirante supernante.

4. Coloração de suspensão celular para fagocitos mononucleares

1. Prepare 0,5 mL de mancha viva/morta por amostra diluindo o corante Live/Dead 1:5.000 em HBSS frio.
2. Adicione a mancha Viva/Morta a cada amostra usando uma pipeta P1000 certificando-se de dissociar completamente a pelota. Transfira amostras para tubos micro titer de 1,2 mL.
3. Tome uma pequena alíquota (10 μL) para contar células usando um hemócitometro ou contador automático de células (ver 4.4). Incubar amostras com mancha viva/morta por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
4. Conte células usando azul Trypan para determinar o número de células vivas por amostra.
   NOTA: Normalmente, 2 olhos de um mouse C57BL/6J de 10-12 semanas de idade contêm menos de 2 x 10⁶ células vivas.
5. Lave as amostras adicionando 400 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.
6. Células resuspendas completamente em 500 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.
7. Bloqueie até 5 x 10⁶ células vivas em 50 μL de bloco F_c (diluição de 1:50 em tampão de fluxo frio do camundongo purificado CD16/CD32). Se mais de 5 x 10⁶ células vivas, aumente os volumes adequadamente.
8. Adicione o bloco F_c à pelota, certificando-se de dissociar completamente a amostra. Incubar por 20 min a 4 °C.
9. Adicione 50 μL de solução de coloração de anticorpos (ver Tabela 1 para escolha e quantidade de cada anticorpo que está incluído na solução) por 5 x 10 6 células vivas^diretamente às células no bloco F_c e misture completamente. Incubar por 30 min a 4 °C.
   NOTA: As quantidades de anticorpos dependem da configuração do citómetro de fluxo e devem ser tituladas independentemente para cada laboratório e instrumento. Consulte a Tabela 2 para a configuração do instrumento de filtros e espelhos. Para titular anticorpos, comece com a recomendação do fabricante e calcule o índice de coloração. Realize um teste de diferentes concentrações de anticorpos (acima e abaixo da recomendação do fabricante) e escolha a menor concentração de anticorpos onde o índice de coloração é mantido. Além disso, certifique-se de que a coloração positiva seja menos brilhante do que o controle de cor única. Use células não manchadas para garantir que as células manchadas negativamente estejam em escala e tenham um pico inferior ou inferior a 1 x 10². Use uma fluorescência menos um controle para definir as células manchadas positivamente.
10. Lave as amostras adicionando 700 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota celular.
11. Opcionalmente, após a coloração do anticorpo, as amostras podem ser fixadas com 500 μL de 2% de paraformaldeído no buffer Flow. Conserte amostras por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, realize uma lavagem como descrito em 4.10. Armazene amostras fixas a 4 °C. As contas de contagem devem ser adicionadas no dia da coleta de dados de citometria de fluxo. As amostras fixas devem ser executadas no citômetro de fluxo em 1-2 dias.
    ATENÇÃO: O paraformaldeído é um risco corrosivo e para a saúde.
12. Lave novamente as amostras usando 500 μL de tampão de fluxo frio. Tubos centrífugas em um rack de tubo micro titer a 400 x g por 10 min a 4 °C. Aspirar metade do supernante sem perturbar a pelota celular.
13. Resuspend pelotas e transferir para um poço 96 bem, placa de ensaio u-bottom. Placa centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Para decantar o supernasce, vire a placa e em um forte shake desaloja o líquido em uma bacia de pia, sem perturbar a pelota.
14. Em um novo tubo de 1,2 mL micro titer, coloque 50 μL de contas de contagem bem vórtices.
15. Resuspend pelotas em 96 placas de poço em 200 μL de tampão de fluxo frio. Adicione a mistura celular na parte superior das contas da etapa anterior. Execute no citómetro de fluxo em volume total de 250 μL / micro tubo de titulação.

5. Coleta de dados de citometria de fluxo

1. Ligue e prepare o citômetro de fluxo. As instruções aqui listadas são para um cicímetro laser modificado(Tabela 2).
2. Execute uma amostra de teste, que inclui uma pequena alíquota de cada amostra, para garantir que todas as células estejam em escala para cada detector. Ajuste as tensões para que todas as células estejam em escala.
3. Execute controles de cor única (CCS) para cada fluoróforo usado no coquetel de coloração(Tabela 3). Coloque o tubo de micro titer em um tubo de poliestireno maior de 5 mL para colocação no estágio do citômetro de fluxo.
   NOTA: Fluoroforos radiculares como BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) e Alexa700 não requerem o mesmo anticorpo que o coquetel (ou seja, CD19 PE para CD64 PE). No entanto, fluoroforos tandem como PE-CF594, PE-Cy7 ou APC-Cy7 requerem o mesmo anticorpo para CCS como coquetel devido à possível dissociação dos fluoroforos conjugados.
   1. Crie o CCS para BV421 adicionando 2 gotas de contas de compensação a um tubo de titer de 1,2 mL, juntamente com 1 μL de hamster anti-mouse CD11c BV421. As contas de compensação são usadas porque o CD11c BV421 é um subtipo de lambda IgG em vez de kappa, conforme descrito em 5.3.3. Incubar por 15 minutos a 4 °C. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.
   2. Crie o SCC para o corante Live/Dead adicionando uma gota de contas de coloração positiva (tampa verde) das contas reativas de amina, seguida por 1 μL de corante Vivo/Morto. Incubar por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Adicione uma gota das contas negativas (tampa branca) das contas reativas de amina. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.
   3. Crie os CCs restantes adicionando uma gota de contas de coloração positiva (tampa verde) do conjunto de contas anti-rato e anti-hamster Ig kappa, seguido pela quantidade de anticorpos listada(Tabela 3) em um tubo de titer de 1,2 mL. Incubar por 15 min a 4 °C. Adicione uma gota das contas negativas (tampa branca) do conjunto de contas anti-rato e anti-hamster Ig kappa. Adicione 0,2 mL de tampão de fluxo.
   4. Vórtice todas as misturas de contas completamente. Armazenar SCCs a 4 °C por até 3 dias.
      NOTA: O CCS para ratos repórteres fluorescentes são células não manchadas.
   5. Ao executar SCCs, defina tensões de tal forma que a amostra de CCS tenha um pico maior do que qualquer fluorescência para uma amostra de células no mesmo canal do detector. Além disso, as tensões devem ser definidas para que qualquer CCS tenha pelo menos uma diferença de log de 0,5 entre o pico do histograma no canal de interesse versus qualquer outro canal(Figura 1).
4. Execute amostras em eventos de manutenção "Baixa"/segundo abaixo de 4000. Se a taxa de fluxo não puder ser reduzida adequadamente, diluir amostras com buffer de fluxo frio adicional. Registo o volume adicionado, pois isso será necessário para o cálculo da contagem (veja os resultados representativos).
5. Coletar pelo menos 3 x 10⁶ eventos por amostra. Isso pode ser maior do que o número de células devido a grânulos de pigmento e detritos contando como eventos em seu cítmetro.
6. Registo uma Fluorescência Menos Um (FMO) para cada fluoróforo que não seja Live/Dead para a estratégia adequada de gating na seção 6.4. Um FMO é uma amostra que foi manchada com todos os fluoroforos, exceto um.
7. Limpe e desligue o citômetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante ou da instalação.

6. Anotação dos dados de citometria de fluxo

1. Abra uma nova planilha usando software de análise. Importar arquivos FCS de citômetro para todas as amostras e controles de cor única.
2. Use SCCs para criar uma matriz de compensação.
3. Aplique a matriz de compensação às suas amostras manchadas e FMOs.
4. Use as FMOs para determinar a coloração positiva para desenhar portões.

Resultados

A Figura 1 mostrou histogramas de frequência não compensados para os SCCs e células para o laser vermelho: Alexa647, Alexa700 e APC-Cy7. Na Figura 1A,a linha magenta retratou o pico do CCS para Alexa647, enquanto a linha ciano mostrou a diferença de log pretendida de 0,5. Observe que o pico em Alexa700 e APC-Cy7 foi à esquerda (menos brilhante) da linha ciano. Note também que as células estavam todas à esquerda da linha magenta. As células à direita do pico do C...

Discussão

A citometria de fluxo de vários parâmetros permite a análise quantitativa de múltiplos tipos de células em um tecido complexo. Neste relatório, descrevemos a detecção citométrica de fluxo de populações de fagocitos mononucleares, incluindo monócitos, células dendríticas e subconjuntos de macrófagos, após lesão a laser no olho do rato. Liyanage et al relataram recentemente uma estratégia semelhante de gating para detectar neutrófilos, eosinófilos, linfócitos, DCs, macrófagos, macrófagos infiltrados e monócitos

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 0,6 ml	Fisher Scientific	05-408-120
Tubos de microcentrífuga de 1,7 ml	Costar	3620
Pipetas de 10 ml	Fisher Scientific	431031
cônicos de 15 ml	ThermoFisher	339650
1x HBSS, 500 ml	Gibco	14025-092
Seringa de 2,5 ml	Henke Sass Wolf	7886-1
solução de paraformaldeído a 20%	Microscopia Eletrônica Sciences	15713-S
Pipetas de 25 ml	Fisher Scientific	431032
agulha de 30 G	Seringa de	26437
3ml	Fisher Scientific	14955457
41 x 41 x 8 mm prato de pesagem de poliestireno	Fisher Scientific	08-732-112
Cônicos de 50 ml	Falcon	352070
96 poços, placa de ensaio com fundo em U sem tampa	Falcon	353910
Grânulos reativos de amina	ThermoFisher	A10628
Software de análise	FlowJo	v 10
Conjunto de grânulos Ig kappa anti-rato e anti-hamster	BD Biosciences	552845
Camundongos C57BL/6J	Jackson Laboratory	664
Contador	Invitrogen	AMQAX1000
Contador de células desliza	Invitrogen	C10283
Contas de compensação	ThermoFisher	01-1111-42
Contas de contagem	ThermoFisher	01-1234-42
Pinça curva	Fisher Scientific	16-100-123
Enzima de digestão	Sigma Aldrich	5401020001
microscópio de dissecação	National Optical and Scientific Instruments, Inc.	DC3-420T
	Miltenyi Biotec	130-096-334
DNase	Roche	10104159001
Dissociador eletrônico	Miltenyi Biotec	130-095-937
FACS Diva software	BD Biosciences
Fc block, rato anti-rato CD16 / CD32	BD Biosciences	553142
Pinça fina	Integra Miltex	17035X
Amortecedor de fluxo	Miltenyi Biotec	130-091-221
Citômetro de fluxo	BD Biosciences
Tubos de fluxo	Falcon	352008
Hamster anti-mouse CD11c BV421	BD Biosciences	562782
Balde de gelo	Fisher Scientific	07-210-123
Corante vivo/morto	ThermoFisher	65-0866-14
Solução de lise, solução 10x	BD Biosciences	555899
Tubo de titulação micro e rack	Fisher Scientific	02-681-380
Mouse anti-mouse CD64 PE	BioLegend	139304
Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594	BD Biosciences	562864
Ponteiras de pipeta P1000	Denville Scientific	Pipetador P2404
P1000	Gilson	FA10006M
Ponteiras de pipeta P2	Pipetador eppendorf	22491806
P2	Gilson	FA10001M
Pipetador P20 Pontas	Gilson	FA10003M
P200	Denville Scientific	P2401
Pipetador P200	Gilson	FA10005M
Homem Pipet	Fisher Scientific	FB14955202
Rato anti-rato B220 PECF594	BD Biosciences	562313
Rato anti-rato CD11b APC-Cy7	BD Biosciences	557657
Rato anti-rato CD19 AlexaFluor 700	BD Biosciences	557958
Rato anti-rato CD19 PE	BD Biosciences	553786
Rato anti-rato CD4 PECF594	BD Biosciences	562314
Rato anti-rato CD45 FITC	ThermoFisher	11-0451-82
Rato anti-rato CD45 PE-Cy7	BD Biosciences	552848
Rato anti-rato CD8 PECF594	BD Biosciences	562315
Rato anti-rato Ly6C	BD Biosciences
Rato anti-rato Ly6G PECF594	BD Biosciences	562700
Rato anti-rato MHC II AlexaFluor 700	BioLegend	107622
Rato anti-rato Siglec F PECF594	BD Biosciences	562757
Rato anti-rato Tim4 AlexaFluor647	BD Biosciences	564178
Incubadora de agitação	Labnet	311DS
Tesoura de mola	Fine Science Tools	15024-10
Filtro de células estéreis, malha de nylon de 40 mm	Fisher Scientific	22363547
Água estéril, 500 ml	Gibco	A12873-01
Centrífuga de balde oscilante	eppendorf	5910 R
Trypan blue, solução a 0,4%	Gibco	15250061