Ferramentas de RNAi específicas para tecidos para identificar componentes para sinalização de estresse sistêmico

Resumo

A manutenção da proteostase do organismo requer a coordenação das respostas de controle de qualidade da proteína, como a expressão de chaperonas de um tecido para outro. Aqui, fornecemos ferramentas usadas em C. elegans que permitem monitorar a capacidade de proteostase em tecidos específicos e determinar as respostas de sinalização intercelular.

Resumo

Na última década, houve um aumento transformador no conhecimento em torno da regulação dos processos de controle de qualidade de proteínas, revelando a importância dos processos de sinalização intercelular na regulação da proteostase não autônoma celular. Estudos recentes estão começando a descobrir componentes e vias de sinalização que coordenam o controle de qualidade de proteínas de um tecido para outro. Portanto, é importante identificar mecanismos e componentes da rede de proteostase não autônoma (NP) celular e sua relevância para o envelhecimento, respostas ao estresse e doenças de desdobramento de proteínas. No laboratório, usamos knockdown genético por RNAi específico do tecido em combinação com repórteres de estresse e sensores de proteostase específicos do tecido para estudar isso. Descrevemos metodologias para examinar e identificar componentes do NP não autônomo celular que podem atuar em tecidos percebendo uma condição de estresse e em células respondedoras para ativar uma resposta protetora. Primeiro, descrevemos como gerar construções de RNAi em grampo para knockdown genético constitutivo em tecidos específicos e como realizar knockdown genético específico do tecido alimentando RNAi em diferentes estágios da vida. Repórteres de estresse e ensaios comportamentais funcionam como leituras valiosas que permitem a triagem rápida de genes e condições que modificam os processos sistêmicos de sinalização de estresse. Finalmente, sensores de proteostase expressos em diferentes tecidos são utilizados para determinar mudanças na capacidade específica do tecido do NP em diferentes estágios de desenvolvimento e envelhecimento. Assim, essas ferramentas devem ajudar a esclarecer e permitir o monitoramento da capacidade da NP em tecidos específicos, ao mesmo tempo em que ajudam a identificar componentes que funcionam em diferentes tecidos para mediar a NP não autônoma celular em um organismo.

Introdução

A proteostase celular é monitorada por uma intrincada rede de componentes de controle de qualidade de proteínas, como chaperonas moleculares, respostas ao estresse e mecanismos de degradação, incluindo o sistema de proteassoma de ubiquitina (UPS) e autofagia ^1,2. A ativação de vias de resposta ao estresse, como a resposta ao choque térmico mediada por HSF-1 (HSR), a resposta proteica desdobrada do retículo endoplasmático (UPR^ER) e as mitocôndrias (UPR^mito) é vital para a adaptação celular e sobrevivência durante desafios ambientais ou doença de desdobramento de proteínas que levam à agregação de proteínas tóxicas ^{1,2,3,4,5, 6}.

A proteostase celular é coordenada por uma camada adicional em organismos multicelulares, como C. elegans, que requer a orquestração de respostas ao estresse celular em diferentes tecidos para ativar componentes protetores de controle de qualidade de proteínas, como chaperonas moleculares⁷. Na última década, a ativação não autônoma celular de vias de resposta ao estresse "celular" foi observada para a resposta ao choque térmico (HSR), o^{UPR ER} e o^{UPR mito}, bem como a sinalização de chaperona transcelular (TCS)3,4,7,8,9,10 . Em cada caso, o sistema nervoso, bem como a sinalização do intestino, desempenha um papel crucial no controle da ativação de chaperonas nos tecidos, para proteger contra as consequências tóxicas de estresses agudos e crônicos de dobramento incorreto de proteínas 3,5,9,11. Essa transmissão dos neurônios para o intestino e outras células da periferia pode ser alcançada por neurotransmissores, como é o caso da RPU,^RE e RSS ^6,8,11. Em uma forma de sinalização de estresse não autônomo celular, TCS, que é ativado pelo aumento da expressão de HSP-90 nos neurônios, os peptídeos imunes secretados desempenham um papel na ativação da expressão da chaperona hsp-90 dos neurônios para o músculo⁵. Em outra forma de TCS, a redução da expressão da chaperona molecular principal hsp-90 no intestino leva a um aumento da expressão de hsp-70 induzível pelo calor em temperatura permissiva no músculo da parede corporal ^5,10. Neste caso particular, as moléculas de sinalização específicas ativadas no intestino que percebe o estresse e as células musculares que respondem são, no entanto, desconhecidas.

Assim, para identificar como a expressão da chaperona é ativada de um tecido para outro, é necessária uma abordagem que permita monitorar a capacidade da rede de proteostase (NP) e a ativação da resposta ao estresse no nível específico do tecido. Para investigar qual via de resposta ao estresse é ativada nos tecidos individuais, uma seleção disponível de repórteres de acompanhantes transcricionais fundidos a marcadores de proteínas fluorescentes pode ser utilizada (ver também Tabela 3). Estes incluem repórteres transcricionais hsp-90, hsp-70 e hsp-16.2 marcados com fluorescência que indicam a indução do HSR, hsp-4 que indica a ativação do^{UPR ER} e hsp-6, indicando o^mito UPR. A combinação desses repórteres com uma condição de estresse específica do tecido permite uma leitura poderosa que identificará os tecidos individuais que respondem a um desequilíbrio do NP em um tecido "emissor" distal percebendo o estresse. Para induzir uma condição de estresse ou desequilíbrio da NP em um tecido específico, diferentes abordagens podem ser adotadas. Por exemplo, uma dessas abordagens é pela expressão ectópica da forma ativada de um fator de transcrição de estresse (por exemplo, xbp-1s) e outra é pela redução dos níveis de expressão de uma chaperona molecular essencial (por exemplo, hsp-90) usando promotores específicos do tecido ^8,10. Para esgotar os componentes do NP em apenas um tipo de célula, o knockdown específico do tecido por RNAi é uma ferramenta útil.

Em C. elegans, o RNAi é, no entanto, sistêmico; o RNA de fita dupla no ambiente pode entrar e se espalhar por todo o animal para silenciar um gene alvo^12,13. Essa disseminação sistêmica do dsRNA ingerido é mediada por proteínas SID (sistêmicas defeituosas de RNAi), como as proteínas SID-1 e SID-2 que são transportadoras de dsRNA, bem como SID-5, que colocaliza com proteínas do endossomo tardio e está implicado na exportação de dsRNA ingerido 14,15,16. SID-1 é uma proteína transmembrana de múltiplas passagens em todas as células, exceto neurônios, e é necessária para a exportação de dsRNA, bem como para importação para as células¹⁷. A expressão de SID-2 é restrita ao intestino, onde funciona como um receptor endocítico para dsRNA ingerido do lúmen intestinal para o citoplasma das células intestinais¹⁶. Os neurônios não respondem ao RNAi sistêmico, e isso se correlaciona com a expressão reduzida da proteína transmembrana SID-1 nos neurônios, que é essencial para que o dsRNA seja importado^15,18. Assim, para que o RNAi específico do tecido seja eficaz em apenas um tipo de célula, a disseminação sistêmica do dsRNA precisa ser evitada. Isso pode ser alcançado utilizando o mutante sid-1 resistente a RNAi (pk3321) que impede a liberação e absorção de dsRNA nos tecidos¹⁵. A expressão de uma construção de RNAi em grampo de cabelo específico do tecido neste mutante ou a expressão ectópica de SID-1 em um tecido específico pode então complementar a função do sid-1 mutante e permitirá o RNAi¹⁹ específico do tecido.

Então, como o dsRNA é ingerido pelo intestino em um mutante de perda de função sid-1 e como ele pode atingir neurônios ou células musculares que expressam ectopicamente uma construção SID-1? Em um modelo atual que explica esse mecanismo, o dsRNA endocitado é absorvido pelo citoplasma intestinal via SID-2 e depois exportado para o pseudoceloma por outro mecanismo independente de SID-1, envolvendo SID-5 e transcitose¹⁷. Assim, como o SID-1 é necessário para a importação de dsRNA¹⁷, apenas as células que expressam o SID-1 do tipo selvagem serão capazes de absorver o dsRNA liberado do intestino para o pseudoceloma.

Aqui demonstramos o uso de um conjunto de ferramentas que permitem o RNAi específico do tecido. Usamos o exemplo da chaperona molecular Hsp90 para descrever a construção do RNAi em grampo de cabelo que pode ser útil para derrubar constitutivamente a expressão gênica em um tecido específico¹⁰. A abordagem descrita pode ser usada para qualquer gene alvo de interesse. A resposta de outros tecidos ao desequilíbrio da proteostase causado pelo RNAi hsp-90 específico do tecido pode ser investigada monitorando a expressão de repórteres de estresse marcados com fluorescência em outros tecidos. Como um segundo método para RNAi específico do tecido, demonstramos como o sistema mutante sid-1 pode ser adaptado para alimentar bactérias que expressam RNAi em vez da expressão de uma construção de RNAi em grampo de cabelo. Isso pode ser útil ao realizar uma triagem de RNAi candidato ou de todo o genoma para identificar os componentes necessários para uma resposta específica do tecido. Da mesma forma, defeitos de desenvolvimento associados à depleção de um componente vital de NP exigirão knockdown mediado por RNAi em tecidos específicos em estágios posteriores de desenvolvimento. Demonstramos como um sistema de complementação SID-1 pode ser usado em uma triagem de RNAi candidata para modificadores TCS específicos do tecido. No exemplo, pretendemos identificar componentes de sinalização que, após o knockdown no tecido emissor "perceptivo de estresse" (intestino) e no tecido que afeta o estresse (músculo), levam à expressão alterada de um repórter hsp-70 marcado com fluorescência nas células musculares.

Protocolo

1. RNAi específico do tecido de duas maneiras: RNAi em grampo e complementação SID-1 específica do tecido

1. Geração de construções de RNAi em grampo para expressão específica de tecido em mutantes sid-1
   1. Amplificar a sequência do gene alvo (por exemplo, sequência hsp-90 isolada do clone de RNAi hsp-90 da biblioteca de RNAi^{Ahringer 20}) por PCR. Coloque uma sequência não palindrômica na extremidade 3 'da sequência hsp-90 , que é um local SfiI (ATCTA) ²¹ .
      NOTA: Os primers usados para clonar o hsp-90 com a sequência SfiI (sublinhado) são:
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      as-hsp90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
   2. Subclone a sequência amplificada no vetor do kit de clonagem comercial (por exemplo, TOPO pCR BluntII).
   3. Isole a sequência hsp-90 invertida do clone de RNAi hsp-90 (biblioteca de RNAi de Ahringer) ²⁰ por digestão de restrição usando locais de restrição XbaI e PstI e coloque-a a jusante da sequência hsp-90-SfiI no vetor (da etapa 1.1.1), resultando em uma construção de grampo de cabelo hsp-90 (Figura 1).
   4. Subclone a construção do grampo de cabelo em um vetor de entrada Gateway pDONR221 e funda-o com clones de entrada Gateway que contêm promotores específicos de tecido para qualquer expressão em neurônios (rgef-1p); no intestino (VHA-6p); ou o músculo da parede corporal (unc-54p) e o unc-54 3'UTR (ou qualquer outro 3'UTR de escolha) em uma reação Gateway, conforme descrito no protocolo do fornecedor.
   5. Linearize as construções de RNAi em grampo de cabelo resultantes (Figura 1) usando um local de restrição único fora da sequência de codificação e microinjete como uma matriz complexa a uma concentração de 1 ng / μL de construção de RNAi em grampo de cabelo, misturado com DNA genômico de Bristol N2 de 100 ng / μL (digerido com ScaI) em uma cepa de C. elegans expressando o repórter hsp-70p :: RFP (cepa AM722) e cruzado para o fundo genético de sid-1 (pk3321) mutantes (estirpe NL3321). Para obter um protocolo sobre como realizar a microinjeção de matrizes complexas, siga²².
   6. Como controle negativo, use construções de grampo de cabelo de vetor vazio expressando a sequência contendo SfiI não palindrômica (GGCCATCTAGGCC) sob controle de um promotor específico do tecido.
   7. Use a expressão aumentada de hsp-70p::RFP do repórter como uma leitura para pontuar transformantes positivos que expressam o RNAi em grampo de cabelo hsp-90 (Figura 3). Para uma abordagem mais geral para verificar o knock-down específico do tecido de qualquer gene de interesse, meça os níveis de mRNA de animais inteiros usando qRT-PCR do gene de interesse.
   8. Integre a matriz extracromossômica da cepa resultante que expressa a construção de grampo de cabelo hsp-90 específica do intestino (PVH2; ver Tabela 1) por irradiação gama. Para integração das matrizes extracromossômicas no genoma, consulte²².
2. Expressão de SID-1 específica do tecido para permitir RNAi específico do tecido, alimentando bactérias que expressam dsRNA
   1. Subclone o DNA genômico sid-1 do vetor TU867 (unc-119p::SID-1)¹⁹ no vetor de entrada do Gateway pDONR221. Primers para clonagem de DNA sid-1 podem ser encontrados em¹⁹. Fundir a construção sid-1 pDONR221 com clones de entrada Gateway contendo promotores específicos do músculo (myo-3p) ou intestino (vha-6p) e o unc-54 3'UTR (ou qualquer outro 3'UTR de escolha) na reação Gateway conforme descrito anteriormente em 1.1.4.
   2. Microinjete as construções vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR ou myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR resultantes a uma concentração de 30 ng/μL junto com um marcador de co-injeção faríngea fluorescente vermelha (por exemplo, myo-2p::RFP; 5 ng/μL) em mutantes sid-1(pk3321).
   3. Integre as matrizes sid-1 específicas do intestino extracromossômico ou do músculo no genoma, conforme descrito em²². Aqui, isso resultou em cepas PVH5 [myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) e PVH65 [vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP]; SID-1 (PK3321).
   4. Para a expressão específica do neurônio de sid-1 no mutante sid-1 (pk3321), use a cepa TU3401 uIs3401 [unc-119p :: SID-1; myo-2p :: RFP]; sid-1(pk3321) que foi gerado anteriormente por Calixto et ^al.19.
   5. Conforme mencionado em 1.1.7, garantir o knockdown específico do tecido do gene de interesse medindo os níveis de mRNA do gene alvo desejado por qRT-PCR. Como alternativa, confirme a sensibilidade do RNAi específico do tecido usando uma proteína fluorescente (por exemplo, GFP ou RFP) expressa no mesmo tecido e trate os vermes com GFP ou RFP RNAi. Exponha os nematóides ao RNAi GFP / RFP como larvas sincronizadas no estágio L1 e cresça nas bactérias RNAi até o dia 1 da idade adulta (ver Figura 2). Em nosso caso, usamos cepas que expressam SID-1 nos neurônios, músculo ou intestino e cruzamos com cepas que expressam HSP-90::RFP em neurônios (AM987), no intestino (AM986) e no músculo (AM988).

2. Usando repórteres de estresse e sensores de proteostase para monitorar a proteostase celular autônoma e não autônoma da célula

NOTA: Para monitorar a capacidade de NP em tecidos específicos, use sensores de proteostase específicos do tecido (como cepas que expressam Q44 no intestino ou Q35 no músculo – consulte a Tabela 3) e repórteres de estresse (como o repórter hsp-70p::mCherry induzível pelo calor; Tabela 3).

1. Cruzando geneticamente o alelo mutante sid-1 (pk3321) em uma cepa de sensor de proteostase e confirmando a presença de sid-1 (pk3321) alimentando RNAi
   1. Cruze geneticamente a cepa do sensor de proteostase/repórter de estresse com o fundo genético da cepa mutante sid-1 (pk3321). Para estabelecer cruzamentos genéticos entre diferentes cepas transgênicas, siga²³ para um protocolo detalhado.
      NOTA: os mutantes sid-1 (pk3321) são resistentes à alimentação de RNAi e, portanto, o tratamento de embriões com RNAi contra um gene essencial (como elt-2 ou hsp-90) só levará a paradas de desenvolvimento ou letalidade larval em cepas heterozigóticas ou selvagens para o gene sid-1.
   2. Deixe 10 hermafroditas grávidas botarem ovos em placas de RNAi contra elt-2 ou hsp-90 e controle (vetor vazio; EV) placas de RNAi a 20 °C. Remova as mães após 1 - 2 h. Use N2 Bristol e o mutante sid-1 (pk3321) como controle.
   3. Observe o desenvolvimento das larvas nas placas de RNAi nos próximos 2-3 dias. ELT-2 O RNAi resultará na parada larval L1, enquanto o RNAi hsp-90 resulta na parada larval L3 em N2 Bristol. Os mutantes sid-1 não serão afetados pelo tratamento com RNAi e se desenvolverão em adultos grávidas.
      NOTA: C. elegans homozigoto para sid-1 (pk3321) mostrará uma população uniforme se desenvolvendo até a idade adulta. Os heterozigotos serão indicados por populações mistas de alguns animais que apresentam parada larval e alguns animais que se desenvolvem em adultos.
2. Confirmando a presença de sid-1 (pk3321) por genotipagem
   1. Escolha 15-20 vermes da cepa F2 candidata selecionada em um tubo de PCR contendo 15 μL de tampão de lise de vermes (Tabela 2).
   2. Coloque o tubo a -80 °C por pelo menos 10 min ou durante a noite.
   3. Incube o tubo na máquina de PCR usando o seguinte programa:
   4. 65 °C por 60 min (verme de lise); 95 °C por 15 min (inativar a proteinase K); manter a 4 °C.
   5. Use 2 μL do lisado de verme como um "molde" para realizar a reação de PCR para genotipagem, usando os seguintes primers para sid-1: sid-1 forw: 5'-agctctgtacttgtattcg-3' e sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
   6. Use o seguinte programa para genotipagem por PCR: 1 ciclo a 95 °C por 3 min; em seguida, 30 ciclos de 95 °C por 10, 55 °C por 30 s e 72 °C por 30 s; 1 ciclo a 72 °C durante 10 min, manter a 4 °C.
   7. Purifique o produto de PCR de ~ 650 pb usando um kit de purificação de PCR (Tabela de Materiais) e sequencie o produto de PCR sid-1 para identificar a mutação pontual G-to-A do alelo sid-1 (pk3321). Alternativamente, a mutação pontual G-para-A cria um local de restrição ApoI, que pode ser usado no produto de PCR para genotipagem, conforme descrito em²⁴.
3. Usando iQ44::YFP como um sensor de proteostase para o intestino
   1. Sincronizar C. elegans expressando Q44::YFP no intestino (cepa OG412) ou cruzado para o fundo mutante sid-1(pk3321) por branqueamento, seguindo o protocolo descrito em²⁵. A placa sincronizou as larvas L1 em uma placa de meio de crescimento de nematóides (NGM)-ágar de 9 cm contendo bactérias OP50 e cresceu até o estágio L4 a 20 ° C.
   2. Colete os animais L4 lavando as minhocas da placa usando 5 mL de tampão M9. Transfira o tampão M9 contendo vermes L4 para um tubo de 15 mL usando uma pipeta de vidro ou uma pipeta de plástico siliconizado e centrifugue a 1000 x g por 1 min em temperatura ambiente para peletizar suavemente os vermes. Remova o sobrenadante com cuidado, certificando-se de deixar o pellet de minhoca intacto.
   3. Etapa crítica: Para transferir ou eliminar nematóides, use uma pipeta de vidro ou uma ponta de pipeta de plástico que foi tratada com um agente siliconizante (por exemplo, SigmaCote) seguindo as instruções do fabricante. Isso evita a aderência de vermes à superfície plástica de uma ponta de pipeta.
   4. Repita a etapa 2.3.2 mais três vezes para lavar todas as bactérias OP50 dos vermes.
   5. Pegue o pellet de minhoca em 5 mL de tampão M9 e conte o número de vermes presentes em 10 μL.
   6. Placa L4: animais em placas de ágar NGM de 6 cm contendo bactérias vazias de controlo vetorial (EV) ou hsp-90 RNAi a uma densidade de 10 vermes por placa (preparar 5 placas por ponto no tempo e réplica biológica) e incubar durante 24 -48 horas a 20 °C.
   7. Após 24 horas (= adultos do dia 1) e 48 horas (= adultos do dia 2) contar o número de focos de Q44 nos intestinos dos nematóides que exibem agregados. Pontue um total de 30-50 nematóides por réplica biológica.

3. Triagem de RNAi candidato a tecido específico para modificadores de proteostase não autônoma celular

NOTA: Para a triagem de RNAi específico do tecido, usamos a cepa PVH172 permitindo RNAi específico do intestino alimentando bactérias RNAi e a cepa PVH171 permitindo RNAi específico do músculo (consulte a Tabela 1 para genótipo).

1. Preparação das placas de RNAi candidatas
   1. Preparar placas de ágar-ágar 6 cm NGM suplementadas com 100 μg/ml de ampicilina, 12,5 μg/ml de tetraciclina e 1 mM de IPTG de acordo com os métodos normalizados²⁵.
   2. Use a biblioteca de RNAi da Ahringer para obter os clones de RNAi candidatos para a triagem de RNAi²⁰.
   3. Inocule 3 mL de meio LB-amp (50 μg / mL de ampicilina em meio LB) em um tubo de 15 mL com o clone de RNAi desejado usando uma ponta de pipeta de plástico. Crescer a 37 °C durante a noite com agitação.
   4. No dia seguinte, adicione isopropil-b-D-tiogalactopiranoside (IPTG) (de um estoque de 1 M) a uma concentração final de 1 mM na cultura bacteriana durante a noite.
   5. Agitar as culturas durante mais 3 h a 37 °C.
   6. Placa de 300 μL de cultura de RNAi bacteriano em uma placa de ágar NGM de 6 cm suplementada com 100 μg/mL de ampicilina, 12,5 μg/mL de tetraciclina e 1 mM de IPTG. Deixe as placas secarem na bancada por 2 dias em temperatura ambiente, cobertas com papel alumínio para proteger da luz. Depois de secas, as placas de RNAi podem ser armazenadas em uma caixa a 4 °C por várias semanas.
2. Sincronização de C. elegans e tratamento com bactérias RNAi
   1. Para sincronizar as cepas de vermes, escolha 15 adultos grávidas em placas de RNAi e deixe botar ovos por 1 h. Em seguida, retire os adultos do prato.
   2. Etapa crítica: A sincronização por branqueamento é evitada neste caso, pois pode induzir o repórter hsp-70p::RFP , pois é uma condição estressante para C. elegans.
   3. Escolha larvas sincronizadas do estágio L4 e transfira para uma placa de RNAi fresca.
   4. Permitir que os nemátodos cresçam no RNAi relevante durante duas gerações para garantir a absorção eficiente do dsRNA, certificando-se de que a temperatura é mantida a 20 °C.
   5. Para imagens e quantificação de fluorescência hsp-70p::RFP , use adultos do Dia 1.
3. Preparação de lâminas de microscópio
   1. Prepare as lâminas do microscópio colocando ~ 250 μL de uma solução de agarose a 2% (em tampão M9) em uma lâmina de microscópio de vidro e uma segunda lâmina colocada na parte superior para criar um disco plano.
   2. Coloque 5 μL de solução de levamisol 5 mM (em tampão M9) na almofada de agarose definida e transfira 5 vermes adultos do dia 1 para a gota de levamisol. Deixe os nematóides paralisarem por 5 min.
   3. Assim que C. elegans estiver paralisado, alinhe cuidadosamente com um palito de fio de platina e remova o excesso de levamisol com um lenço de laboratório antes da adição de uma lamínula.
   4. Etapa crítica: Certifique-se de tirar imagens dos vermes dentro de 30 minutos após a preparação das lâminas do microscópio. Os nematóides paralisados na lâmina do microscópio podem secar e estourar, o que pode comprometer as medições de fluorescência.
4. Configurações do microscópio e análise de imagem
   NOTA: As imagens são obtidas usando um microscópio confocal equipado com uma câmera EM-CCD e um software de automação de imagem e análise de imagem por microscopia.
   1. Tire imagens com ampliações de 10x usando um laser de 561 nm para excitação de fluorescência RFP. Certifique-se de que todas as imagens sejam tiradas usando as mesmas configurações de potência do laser, tamanho do orifício e ganho de fluorescência para permitir comparações.
   2. Salve todas as imagens como arquivos TIFF.
   3. Execute a análise de imagem usando o ImageJ. Meça a intensidade da fluorescência em cada imagem como pixels por unidade de área, com a fluorescência de fundo subtraída. Normalize a intensidade de fluorescência de cada imagem para a área da imagem, bem como o comprimento dos vermes.
   4. Meça a intensidade média usando Analisar | Meça em ImageJ. Normalize o valor de intensidade resultante para a área da imagem dividindo a intensidade por área.
   5. Para normalizar a intensidade do comprimento do verme, meça o verme desenhando uma linha ao longo do comprimento do verme no ImageJ e usando Analisar | Medir. A razão para normalizar a intensidade da fluorescência para o comprimento do verme é que os vermes podem variar em tamanho, dependendo do gene que é derrubado pelo RNAi, e isso pode afetar a intensidade média.
   6. Normalize as intensidades de fluorescência medidas para controles não tratados (ou seja, C. elegans cultivados em placas de RNAi de controle (EV)). Agrupe os valores normalizados para comparar as intensidades médias de fluorescência para cada condição de RNAi. Procure obter imagens de 20 vermes por réplica biológica e coletar pelo menos 3 imagens de réplicas biológicas.
   7. Calcule os valores de P dos valores médios de intensidade de fluorescência usando o teste t de Student e execute uma correção para testes múltiplos usando o método de Benjamini-Hochberg, usando uma taxa de descoberta falsa de 0,05.

Resultados

RNAi específico do tecido de duas maneiras: Expressão de construções em grampo ou complementação de SID-1 específico do tecido
A expressão de construções de RNAi em grampo de cabelo específicas do tecido permite o knockdown constitutivo de um gene ao longo do desenvolvimento. No entanto, isso às vezes pode ser impraticável quando o gene pesquisado é necessário para a organogênese desse tecido específico, como elt-2 , que é necessário para o desenvolvimento do intestino²⁶

Discussão

Os métodos aqui descritos demonstram o uso de ferramentas que permitem o knockdown tecido-específico dos componentes da NP de forma constitutiva e temporal. Identificamos anteriormente o TCS, um mecanismo de resposta ao estresse não autônomo da célula que é induzido pela alteração específica do tecido dos níveis de expressão de Hsp90¹⁰. O knockdown específico do tecido de hsp-90 pela expressão de RNAi em grampo de cabelo leva à regulação positiva não autô...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ampicilina	Merck	A0166-5G	Protocolo Seção 3.1.
DNA Limpo & Concentrador-500	Zymo Research	D4031	Protocolo Seção 2.2.
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactosídeo	Merck	367-93-1	Seção 3.1 do protocolo.
Kit de clonagem de gateway multissite	Thermo Fisher	12537100	Protocol Seção 1.2.
SigmaCote	Merck	SL2-25mL	Protocolo Seção 2.3.
Tetraciclina	Merck	T7660-5G	Protocolo Seção 3.1.
Kit de clonagem de PCR TOPO sem corte zero	Thermo Fisher	K280002	Seção 1.1 do protocolo.