Caracterização de Células Imunes e Mediadores Proinflamatórios no Ambiente Pulmonar

Summary

Este protocolo descreve o uso de citometria de fluxo para identificar as alterações na composição das células imunes, perfil de citocina e perfil de quimiocina no ambiente pulmonar após a oclusão da artéria cerebral média transitória, um modelo murino de derrame isquêmico.

Abstract

A expansão, ativação e tráfico de células imunes aos pulmões, que são controladas pela expressão de múltiplas citocinas e quimiocinas, podem ser alteradas por lesões cerebrais graves. Isso é evidenciado pelo fato de que a pneumonia é uma das principais causas de mortalidade em pacientes que sofreram de AVC isquêmico. O objetivo deste protocolo é descrever o uso de análises citométricas de fluxo multicolorido para identificar 13 tipos de células imunes nos pulmões de camundongos, incluindo macrófagos alveolares, macrófagos intersticiciais, células dendríticas CD103+ ou CD11b+ (DCs), DCs plasmacitoides, eosinófilos, monocitos/células derivadas de monocitos, neutrófilos, células T e B derivadas de linfoides, células NK e NKT, após indução de derrame isquêmico por oclusão de artéria cerebral média transitória. Além disso, descrevemos a preparação de homogeneizadores pulmonares utilizando um método de homogeneização de contas, para determinar os níveis de expressão de 13 citocinas diferentes ou quimiocinas simultaneamente por matrizes multiplex de contas acopladas à análise citométrica de fluxo. Este protocolo também pode ser usado para investigar a resposta imune pulmonar em outros ambientes da doença, como doença pulmonar infecciosa ou doença alérgica.

Introduction

Os pulmões são um órgão de barreira, exposto ao ambiente externo e, portanto, estão constantemente recebendo desafios imunológicos, como patógenos e alérgenos¹. A ativação de células imunes residentes no pulmão e a infiltração de células imunes da periferia são necessárias para limpar patógenos do ambiente pulmonar. Além disso, as células imunes residentes no pulmão mantêm a tolerância às bactérias commensais, sugerindo que essas células desempenham um papel no desembaraço do patógeno e na manutenção da homeostase¹. Macrófagos alveolares e intersticiais estão entre as células imunes sentinelas residentes no pulmão que se....

Protocol

Todos os protocolos e procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia Ocidental. Os camundongos foram alojados sob condições específicas sem patógenos no vivarium da Universidade da Virgínia Ocidental.

1. Preparação de soluções

1. Prepare o tampão de perfusão (salina tampão fosfato, PBS). Use aproximadamente duas alíquotas de 10 mL de PBS geladas por mouse.
2. Prepare o tampão médio/FACS da célula pulmonar. O tampão FACS contém PBS suplementado com 1% de soro bovino fetal (FBS). Mantenha o meio frio durante todo o processo de excisão pulmonar e....

Results

Recentemente, relatamos que a indução de derrame isquêmico em camundongos altera a composição celular imune dos pulmões¹¹. Especificamente, isquemia cerebral transitória aumentou percentuais de macrófagos alveolares, neutrófilos e DCs CD11b+, enquanto diminuiu percentuais de células T CD4+, células T CD8+, células B, células NK e eosinófilos no compartimento pulmonar. Além disso, a alteração celular correspondeu a níveis significativamente reduzidos de quimiocinas múltiplas nos pulmões. Descrito a.......

Discussion

Os protocolos aqui descritos permitem a identificação de tipos de células imunes pulmonares e a expressão de quimiocinas ou citocinas no mesmo rato. Se um estudo de histopatologia for desejado, um lobo individual pode ser removido e fixado para esse fim antes de prosseguir para as etapas de isolamento de célula única. Uma limitação deste método é que essa abordagem pode não ser adequada em alguns cenários da doença se a mudança na composição das células imunes e a expressão de quimiocinas e/ou citocinas forem previstas p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B220-APC, clone RA3-6B2	Biolegend	103212	diluição 1:200
Beadbug Homogeneizador de esferas de 3 posições	Benchmark Scientific	D1030	Homogeneizador de tecidos
CCR2-BV421, clone SA203G11	Biolegend	150605	diluição 1:200
CD103-BV421, clone 2E7	Biolegend	121422	diluição 1:200
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70	Biolegend	101216	diluição 1:400
CD11c-PE/Cy7, clone N418	Biolegend	117318	diluição 1:200
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418	Biolegend	117328	diluição 1:200
CD4-BV421, clone GK1.5	Biolegend	100443	diluição 1:200
CD45-FITC, clone 30-F11	Biolegend	103108	diluição 1:200
CD64-APC, clone X54-5/7.1	Biolegend	139306	diluição 1:200
CD8-PE, clone 53-6.7	Biolegend	100708	diluição 1:800
Colagenase D	Sigma Aldrich	11088882001	Componente no tampão de dissociação
Tubo cônico com tampa de rosca	ThermoFisher	02-681-344	Tubo para homogeneização de tecidos
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001	Componente no tampão de dissociação
Fc bloco CD16/32 anticorpo	Biolegend	101320	diluição 1:100
dissociador genlteMACS	Miltenyi Biotec	130-093-235	Comparação da digestão pulmonar com ou sem separador mecânico
gentleMACS C tubos	Miltenyi Biotec	130-093-237	Tubo para disscoiação de tecidos com dissociador genlteMACS
Halt protease e inibidor de fosfatase cocktial	ThermoFisher	78442	Componente no tampão de homogeneização
Monitor doppler a laser	Moor	MOORVMS-LDF	Monitoramento do fluxo sanguíneo durante o painel de
quimiocinas pró-inflamatórias tMCAO LEGENDplex	Biolegend	740451	Matriz de contas multiplex
LIVE/DEAD corante de infravermelho próximo corrigível	ThermoFisher	L34976	Uso para exclusão de células mortas durante a análise de citometria de fluxo
Ly6C-PE, clone HK1.4	Biolegend	128008	diluição 1:800
Ly6G-BV510, clone 1A8	Biolegend	127633	diluição 1:200
sutura MCAO L56 meio reutilizável 6-0 Doccol		602356PK10Re	tMCAO
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2	Biolegend	107636	diluição
1:800NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136	Biolegend	108728	diluição 1:200
Siglec F-PE, clone E50-2440	BD Biosciences	552126	diluição 1:200
Fio de sutura de seda, tamanho 6/0	Fine Science Tools	18020-60 Sistema de	tMCAO
SomnoSuite Kent	Scientific	SS-01	Anestesia em camundongo para tMCAO
TCRb-BV510, clone H57-897	Biolegend	109234	diluição 1:200
Grânulos de zircônia/sílica, 2,3 mm	Biospec	11079125z	Grânulos para homogeneização de tecidos