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Artigo de método

Investigando a Motilidade Impulsionada por Flagella em Escherichia coli aplicando três técnicas estabelecidas em uma série

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DOI:

10.3791/61364

⸱

10 de maio de 2020

 , 
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Neste artigo

Resumo

Muitas bactérias usam motilidade impulsionada por flagela para navegar em seu ambiente e colonizar ambientes favoráveis tanto individualmente quanto como coletivos. Demonstrado aqui é o uso de três métodos estabelecidos que exploram a motilidade como ferramenta de seleção para identificar componentes/caminhos que contribuem para a natação e a motilidade.

Resumo

A motilidade é crucial para a sobrevivência e o sucesso de muitas espécies bacterianas. Existem muitas metodologias para explorar a motilidade para entender caminhos de sinalização, para elucidar a função e montagem de partes flageladoras, e para examinar e entender padrões de movimento. Aqui demonstramos uma combinação de três dessas metodologias. A motilidade no ágar macio é a mais antiga, oferecendo uma forte seleção para isolar mutações supressoras de ganho de função em cepas prejudicadas pela motilidade, onde a motilidade é restaurada através de uma segunda mutação. A técnica de amarração celular, primeiramente empregada para demonstrar a natureza rotativa do motor flagelador, pode ser usada para avaliar o impacto dos efeitos de sinalização na velocidade do motor e sua capacidade de alternar a direção rotacional. O ensaio de "travessia de fronteiras" é mais recente, onde bactérias nadando podem ser preparadas para a transição para se mover coletivamente como um enxame. Em combinação, esses protocolos representam uma abordagem sistemática e poderosa para identificar componentes da maquinaria de motilidade, e para caracterizar seu papel em diferentes facetas da natação e do enxame. Eles podem ser facilmente adaptados para estudar motilidade em outras espécies bacterianas.

Introdução

As bactérias empregam muitos apêndices para movimentação e dispersão em seus nichos ecológicos1. A motilidade conduzida por Flagella é a mais rápida delas, promovendo a colonização de locais favoráveis em resposta aos sinais ambientais, contribuindo significativamente para a capacidade patogênica de algumas espécies2,3. Bactérias flageladas podem nadar individualmente em líquido a granel, ou enxame como um coletivo sobre uma superfície semissólida4. A flagela extracelular se prende e é conduzida por motores rotativos embutidos na membrana, que aproveitam a potência dos gradientes de íons para gerar torque que causa rotação1,2,4,5,6,7,8. Em E. coli, cujos motores funcionam em um torque constante9, a saída do motor pode ser categorizada em termos de velocidade rotacional e comutação do rotor entre as direções no sentido anti-horário (CCW) e sentido horário (CW). A rotação CCW promove a formação de um feixe de flagelar coerente que impulsiona a célula para a frente (corrida), enquanto um interruptor transitório na direção rotacional (CW) faz com que o feixe se desmonte parcial ou totalmente10, e a célula reoriente sua direção de natação (tombo). E. coli normalmente corre por um segundo e cai por um décimo de segundo. A frequência de comutação do rotor ou do "viés de queda" é controlada pelo sistema de sinalização de quimiotaxis, onde os quimoreceptores transmembrano detectam sinais químicos externos e transmitem-nos via fosfora ao motor flagelador para estender as corridas em resposta aos atrativos, ou suprimi-los em resposta a produtos químicos tóxicos11,12. A motilidade da natação é avaliada em 0,3% de ágar macio.

Durante o enxame, as bactérias navegam em uma superfície semissólida como um coletivo denso, onde pacotes de bactérias fluem em um movimento contínuo de redemoinho2,13,14,15. Os enxames de E. coli apresentam fisiologia quimioensory alterada (viés de queda mais baixo), maiores velocidades e maior tolerância a antimicrobianos sobre células que nadam em líquido a granel16,17. Os enxames variam em sua implantação de uma infinidade de estratégias que auxiliam o movimento, incluindo produção surfactante, hiperflagellação e alongamento celular2. O swarming oferece às bactérias uma vantagem competitiva nos ambientes ecológicos e clínicos18,19,20. Existem duas categorias de bactérias em enxame: enxames temperados, que só podem enxamear na mídia solidificada com 0,5-0,8% de ágar, e enxames robustos, que podem navegar através de concentrações de ágar mais altas21.

Existem uma variedade de ensaios para interrogar a motilidade da natação e sua regulamentação. Quando prejudicada por mutações ou condições ambientais, a própria motilidade oferece uma forte seleção para identificar mutações supressoras de ganho de função. Esses supressores podem ser revertentes genuínos da mutação original, ou pseudo-revertentes, onde uma segunda mutação restaura a funcionalidade. Tais mutantes podem ser identificados por sequenciamento de genomas inteiros (WGS). Uma alternativa à seleção de supressores imparcial é uma estratégia de mutagênese direcionada tendenciosa (por exemplo, mutagênese PCR). Essas metodologias muitas vezes lançam luz sobre a função ou regulação ambiental do aparelho de motilidade. Se o objetivo é estudar a função motora, então a restauração da motilidade do tipo selvagem medida em ágar macio pode não necessariamente indicar a restauração da saída do motor do tipo selvagem. O ensaio de amarração celular, no qual as células são anexadas a uma superfície de vidro por um único flagellum e a rotação do corpo celular é posteriormente monitorada, pode ser o ensaio inicial de escolha para avaliar o comportamento motor. Embora metodologias mais sofisticadas estejam agora disponíveis para monitorar as propriedades do motor, a configuração necessária da câmera de alta velocidade e a aplicação de pacotes de software para análise de movimento limitam seu uso generalizado22,23,24,25. O ensaio de amarração da célula requer apenas que a flagela seja amarrada, permitindo a fixação dos filamentos curtos a um slide de vidro, seguido de filmagem da rotação do corpo celular. Embora as velocidades motoras registradas sejam baixas neste ensaio devido à alta carga que o corpo celular exerce sobre o flagelo, este ensaio contribuiu, no entanto, para insights valiosos sobre as respostas chemotactic26,27,28,29, e continua sendo uma ferramenta investigativa válida como discutido abaixo.

A motilidade repleta representa um conjunto diferente de desafios para os pesquisadores. A seleção de supressores de ganho de função só funciona em enxames que produzem surfactantes abundantes e enxames prontamente13. Não-produtores surfactantes como o E. coli são exigentes com relação à escolha do ágar, composição da mídia e umidade do ambiente2,13,14,21. Uma vez estabelecidas as condições de enxame, o ensaio de travessia de fronteiras17 é uma metodologia útil para interrogar a capacidade de um enxame de navegar em novas/condições duras. Embora os protocolos apresentados abaixo se relacionem com E. coli,eles podem ser prontamente adaptados para aplicação em outras espécies.

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Protocolo

1. Isolamento de mutantes supressores em cepas deficientes de motilidade

NOTA: Use este método como um amplo "catch-all" para identificar a natureza geral do defeito de motilidade.

  1. Preparação de placas de ágar macio
    NOTA: O ágar macio, também chamado de ágar de motilidade ou natação, é um ágar de baixa porcentagem (~0,2-0,35% w/v), muito usado para avaliarquimiotaxis 31,32.
    1. Adicione 3 g de bacto-agar (0,3% w/v) e 20 g de LB a um frasco fundo redondo de 2 L. Adicione 1 L de ddH2O (água duplamente destilada) ao frasco e misture uniformemente a suspensão usando uma haste de mexida e placa de agitação magnética.
    2. Autoclave por 20 min a 121 °C.
    3. Deixe esfriar com agitação suave usando a haste/placa como acima. Quando a temperatura atingir aproximadamente 50 °C, despeje 25 mL em placas estéreis de Petri (100 mm x 15 mm), e permita que o ágar derretido coloque a tampa no lugar por pelo menos 1h, para uso dentro de 16 h.
  2. Preparação cultural, inoculação e isolamento de mutantes supressores
    NOTA: E. coli inoculado no centro de mídia rica em nutrientes solidificada com ágar macio consome nutrientes localmente, criando um gradiente de nutrientes que eles seguem. À medida que se movem para fora, aparecem 'anéis' definidos(Figura 1A), que estão relacionados a quimioattractants específicos a que as bactérias respondem. Defeitos no sistema de quimiotaxis ou componentes estruturais do motor flagela podem comprometer o desempenho neste ensaio. Muitas vezes, mutantes com uma vantagem de motilidade surgem durante a exibição, e podem ser vistos emergindo de um único ou de vários pontos ao longo da periferia do anel, de onde eles 'flare' para fora(Figura 1C). Nota-se que a borda mais externa da frente de natação contrasta prontamente contra o ágar macio virgem não colonizado.
    1. Cresça culturas noturnas da variedade deficiente de motilidade desejada em 5 mL de Caldo de Lennox (LB; triptona de 10 g/L, extrato de levedura de 5 g/L e 5 g/L NaCl, Tabela de Materiais) a 30 °C com agitação horizontal (220 r.p.m.). No dia seguinte, subcultura (diluição de 1:100) em LB fresco, crescendo sob as mesmas condições para fase exponencial (OD600 de 0,6).
    2. Inocular 6 μL da cultura no centro de uma placa de ágar macio (1.1) usando uma pipeta, empurrando a ponta estéril carregada para dentro do ágar para expulsar suavemente o conteúdo. Transfira para 30 °C e incubar(Figura 1B),até que as "erupções" de motilidade sejam evidentes, emanando do ponto de inoculação ou da periferia dos anéis de motilidade, tipicamente em 24-36 h(Figura 1C).
      NOTA: Nos ensaios de motilidade, inocular uma cepa do tipo selvagem ao lado dos isolados mutantes para comparação. Esta cepa de tipo selvagem mostrará os anéis quimotacticos concêntricos característicos(Figura 1A) e encherá a placa dentro de 8-10 h.
    3. Use um laço de arame estéril para levantar as células da região 'flare' e listras para purificar colônias únicas em uma placa de ágar duro LB (LB preparado como acima, solidificado com 15 g/L bacto-ágar).
    4. Escolha colônias únicas da placa de raia usando um laço de arame estéril e re purifique, redimensionando-se para colônias únicas para garantir o isolamento de uma colônia "pura".
  3. Confirmação e caracterização de mutantes supressores
    1. Confirme que os mutantes isolados do supressor restauraram a motilidade. Prepare placas de ágar macio (1.1) e culturas para cepas de interesse (como em 1.2.1), incluindo o tipo selvagem e a tensão inicial "deficiente de motilidade" para comparação.
    2. Inocular as placas (como em 1.2.2) e incubar a 30 °C por 8-10 h.
    3. Regissuir o diâmetro do anel mais externo (borda do círculo) e compare para estabelecer qual dos isolados restaurou substancialmente a motilidade.
      NOTA: Recomenda-se que as placas sejam fotografadas durante todo o período de tempo do experimento. Para obter melhores resultados, use um dispositivo "balde de luz"30,onde uma câmera digital é montada acima de uma fonte de luz para melhor iluminação para medir o diâmetro da colônia de natação e distingui-lo do ágar não colonizado.
    4. O sujeito verificou isolados para WGS conforme necessário, permitindo uma "cobertura de sequência" suficiente para identificar positivamente as mutações que restauraram a função do tipo selvagem.

2. Quantificar o comportamento motor de flagela através da amarração celular

NOTA: Use este método quando o comportamento normal de queda de corrida (quimiotaxis) parece estar comprometido.

  1. Preparação cultural e flagela tesoura
    1. Prepare uma cultura de fase exponencial da tensão de interesse, conforme descrito na etapa 1.2.1.
    2. Pelota 10 mL de células por centrifugação a 2.000 x g por 3 minutos antes de reutilizar em 10 mL de tampão de motilidade esterilizado por filtro (MB; Tampão fosfato de potássio de 10 mM [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7.0], 0,1 mM EDTA [pH 7.0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl).
      NOTA: MB suporta motilidade, mas não suporta crescimento bacteriano
    3. Repita o passo 2.1.2 mais duas vezes antes de reutilizar a pelota final em 1 mL de MB.
    4. Transfira a suspensão da célula para uma seringa de 1 mL e conecte uma agulha 23G até o final. Monte um aparelho de seringa/agulha idêntico e conecte os dois juntos através de 6 polegadas de tubos de polietileno (diâmetro interno de 0,58 mm) firmemente em baia sobre cada ponta de agulha.
    5. Tesoura a flagela (eles são frágeis e quebram facilmente) passando suavemente a suspensão da célula para frente e para trás de uma seringa para a outra 50x, com 1 min pausas entre cada 10 passes.
    6. Centrifugar as células desarmadas a 2.000 x g por 3 min e resuspend em um volume final de 500 μL de MB.
  2. Preparação de slides e amarração celular
    1. Prepare uma câmara de fixação celular empilhando uma tampa de 18 mm x 18 mm sobre um slide de microscópio de vidro de 3 polegadas x 1 polegada x 1 mm, separado por fita dupla face(Figura S1).
    2. Lave a câmara com solução de poli-lise de poli-lise de 0,01% (w/v) aplicando-se ao topo da câmara. Incline a borda inferior (a mancha de cobertura alinhada com o slide do microscópio) em um limpador de tarefas (papel de tecido) para ajudar a desenhar a solução através da câmara(Figura S1). Em seguida, incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.
    3. Lave a câmara três vezes com 40 μL de MB usando como descrito na etapa 2.2.2
    4. Adicione 40 μL da suspensão da célula de corte (preparada acima) ao topo da câmara e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos para permitir que as células se conectem ao deslizamento de tampas.
    5. Lave suavemente a câmara com 40 μL de MB como em 2.2.3 para remover células nãoectadas.
  3. Gravação e quantificação de rotação celular
    1. Transfira o slide do microscópio carregado com células amarradas para o estágio do microscópio.
    2. Utilizando microscopia de contraste de fase e um objetivo de 100x, escaneie a população em busca de células fixadas no lugar e gire em um único eixo, ou seja, rotações suaves em um ponto fixo em vez de apresentar em um ângulo onde a célula se move dentro e fora de foco(Vídeo 1).
    3. Use um microscópio comercial e uma câmera associada. Abra o software associado, garanta que as células de interesse estejam em foco e clique na aquisição de vídeo para gravar a rotação do celular por um minuto (a 10 quadros por segundo ou superior).
    4. A partir da reprodução de vídeo, quantifique o número de rotações completas por minuto e o número de vezes que a célula muda de direção (frequência de comutação).
      NOTA: As velocidades de rotação e a frequência de comutação podem ser muito rápidas para medir olho por olho, por isso é recomendado usar software de vídeo que ofereça reprodução lenta/fina, ou adote um sistema de software automatizado para quantificar padrões de rotação33. Uma alternativa seria aumentar a viscosidade do MB usando celulose de metila (ou agente similar) para ajudar a retardar e resolver a rotação de bactérias mais rápidas ou compensar quando câmeras com esquadragens baixas estão em uso.
    5. Repita o passo 2.3.2 com réplicas biológicas para compilar uma representação da população de interesse.

3. Preparação de enxames em um ensaio de travessia de fronteiras

NOTA: Use este método para avaliar o impacto de uma mutação ou condição na motilidade do grupo. Swarm-agar refere-se ao ágar onde a porcentagem é tipicamente maior do que a do ágar macio. Em ágar macio (0,3%), as células nadam individualmente dentro do ágar. No ágar enxame (0,5% ou mais), as células se movem como um grupo na superfície. Enquanto as placas de enxame devem ser usadas como detalhadas aqui, as placas de natação têm uma vida útil mais longa, e podem ser usadas por vários dias. Nossa preferência pessoal é usar em 1-2 dias.

  1. Preparação do enxame ágar
    1. Adicione 5 g de agar Eiken (0,5% c/v) e 20 g de LB a um frasco fundo redondo de 2 L. Adicione 1 L de ddH2O ao frasco e misture uniformemente a suspensão usando uma haste de mexida e placa de agitação magnética.
    2. Autoclave por 20 min a 121 °C.
    3. Deixe esfriar com agitação suave para evitar quaisquer bolhas de ar usando a haste/placa como acima. Quando aproximadamente 50 °C, adicione glicose esterilizada por filtro para uma concentração final de 0,5 %.
    4. Despeje 25 mL em placas de Petri estéreis (100 mm x 15 mm) e deixe fixar em temperatura ambiente por pelo menos 14 h e não mais do que 20 h. Não guarde para uso futuro.
  2. Inoculação e incubação de placas de enxame
    1. Inocular 6 μL de uma cultura exponencial média (preparada como em 1,2) ao detectar em cima do ágar.
    2. Deixe a tampa desligada por 5-10 min e substitua quando o inóculo secar na superfície do ágar.
    3. Incubar a 30 °C por 8 h. Evite a tentação de inspecionar o progresso do enxame removendo a tampa, pois isso contribuirá para a secagem do ágar e prejudicará o enxame.
      NOTA: O tempo de incubação pode variar dependendo do fenótipo da cepa. Algumas mutações isoladas podem dificultar a capacidade de enxame e exigirão uma porcentagem reduzida de ágar ou um período mais prolongado de incubação.
  3. Elaboração de placas de ensaio de travessia de fronteira
    NOTA: Este ensaio utiliza uma placa de Petri modificada, onde uma divisão de plástico (borda) cria duas câmaras, em vez de uma(Figura 2A). Cada câmara pode ser preparada independentemente da outra, oferecendo condições diferentes para enxame, antes de "conectar" as duas. Dependendo do design experimental, a primeira câmara (designada à esquerda) pode ser preparada com ágar nadador (0,3% c/v) ou ágar enxame (0,5% c/v) de onde as bactérias podem migrar através da fronteira para a câmara direita contendo ágar enxame +/- qualquer suplemento ou desafio necessário (por exemplo, antibióticos). A migração em ambos os ágars é tipicamente medida/comparada registrando o diâmetro mais amplo da colonização bacteriana (borda a borda) do ponto original da inoculação.
    1. Prepare o ágar de natação, conforme descrito em 1.1, se necessário.
    2. Prepare o ágar do enxame, como descrito em 3.1.
    3. Despeje ~30 mL de ágar enxame (com suplementação desejada, se necessário) na câmara direita de uma placa de Petri de compartimento duplo (100 mm x 15 mm), ao ponto em que está nivelado com o divisor de plástico entre as câmaras, mas não transbordando para a esquerda(Figura 2B).
    4. Depois que o ágar endurecer, encha a câmara esquerda com ~30 mL de natação ou ágar enxame, novamente ao ponto de contato com a divisão de plástico(Figura 2C). Antes de definir, use uma ponta de pipeta estéril para arrastar suavemente o ágar sobre a borda para conectar os dois lados com uma ponte de ágar de ~1 mm de altura que abrange toda a extensão da divisão(Figura 2D).
    5. Deixe a placa secar à temperatura ambiente (3.1).
      NOTA: Um método alternativo de criação de ponte é permitir que o ágar da câmara esquerda seque e, em seguida, lentamente pipeta ~100 μL de ágar enxame derretido ao longo do divisor de plástico para fazer a ponte das duas câmaras (3.4). Inocular as placas na câmara esquerda como detalhada acima para natação (1.2.2) ou enxame (3.2) ágar, antes de incubar a 30 °C por 12-16 h, ou até que enxames tenham feito progresso suficiente sobre a câmara direita para permitir comparações entre cepas de interesse.

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Resultados

O isolamento de pseudo-revertentes em uma cepa de E. coli cuja motilidade é prejudicada por altos níveis da molécula de sinalização c-di-GMP, foi detalhado em trabalhos recentes do nosso laboratório34. Esta cepa (JP1442) abrigava duas mutações: ΔyhjH e ΔycgR. YhjH é o fosfodiesterase mais ativo que degrada c-di-GMP em E. coli. A ausência de YhjH leva a níveis elevados de c-di-GMP e inibição da motilidade. YcgR é um efeito c-di-GMP. Em complexo com c-di-GMP, YcgR...

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Discussão

O isolamento e a caracterização das mutações supressoras contribuíram com sucesso para identificar componentes-chave do sistema de quimioterapia35,36,37, bem como da própria máquina motora38,39,40. Ao usar o Protocolo 1, é importante incluir múltiplas réplicas independentes para garantir o isolamento de um grande espectro de possíveis m...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde de subvenção GM118085 e em parte pela Fundação Robert Welch (conceder F-1811 a R.M.H.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagents
Bacto Ágar DesidratadoFisher ScientificDF0140-15-4
EDTA Dissódico Sal, DihidratadoFisher Scientific02-002-786
Eiken AgarEiken Chemical Co. JapãoE-MJ00Essencial para E. coli enxameando
Glicose D (+)Fisher Scientific
LB (Lennox) CaldoFisher ScientificBP1427-500
Solução de Poli-L-lisina (0,1%)Sigma-AldrichP8920
Cloreto de potássio (KCl)Fisher Scientific18-605-496
Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
Cloreto de sódio (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Materiais e Equipamentos
CellSense software de imagem de microscópio (V. 1.6)OlympusOu software equivalente para microscópio usado
Fita Adesiva Doube Scotch 666 Fisher50-285-28
Lâminas de microscópio fosco 3x1x1mmFisher12-550-343
Microscópio Olympus BX53OlympusBX53Qualquer microscópio de fase vertical ou invertida pode ser usado
em placas de Petri (100 mm de diâmetro)Fisher ScientificFB0875712Para ensaios de ágar macio
Nebulizador de polietileno Tubo capilar (0,58 mm x 99 mm 3,0 m)Perkin Elmer
Placa de Petri redonda com 2 compartimentosVWR89200-944Para ensaios de travessia de fronteiras
Agulhas hipodérmicas de segurança (23G)Fisher Scientific14-826A
Seringa estéril - 1 mLFisher scientific14-955-450
Toalhetes de tarefas/tecidosFisher scientific06-666Ou toalhetes de tecido de uso único equivalentes
VWR micro vidro de cobertura 18x18mmVWR48366205
XM10 câmeraOlympusXM10Ou câmera de microscópio equivalente
4109550009908265

Referências

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