Muitas bactérias usam motilidade impulsionada por flagela para navegar em seu ambiente e colonizar ambientes favoráveis tanto individualmente quanto como coletivos. Demonstrado aqui é o uso de três métodos estabelecidos que exploram a motilidade como ferramenta de seleção para identificar componentes/caminhos que contribuem para a natação e a motilidade.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Investigando a Motilidade Impulsionada por Flagella em Escherichia coli aplicando três técnicas estabelecidas em uma série
Neste artigo
Resumo
Resumo
A motilidade é crucial para a sobrevivência e o sucesso de muitas espécies bacterianas. Existem muitas metodologias para explorar a motilidade para entender caminhos de sinalização, para elucidar a função e montagem de partes flageladoras, e para examinar e entender padrões de movimento. Aqui demonstramos uma combinação de três dessas metodologias. A motilidade no ágar macio é a mais antiga, oferecendo uma forte seleção para isolar mutações supressoras de ganho de função em cepas prejudicadas pela motilidade, onde a motilidade é restaurada através de uma segunda mutação. A técnica de amarração celular, primeiramente empregada para demonstrar a natureza rotativa do motor flagelador, pode ser usada para avaliar o impacto dos efeitos de sinalização na velocidade do motor e sua capacidade de alternar a direção rotacional. O ensaio de "travessia de fronteiras" é mais recente, onde bactérias nadando podem ser preparadas para a transição para se mover coletivamente como um enxame. Em combinação, esses protocolos representam uma abordagem sistemática e poderosa para identificar componentes da maquinaria de motilidade, e para caracterizar seu papel em diferentes facetas da natação e do enxame. Eles podem ser facilmente adaptados para estudar motilidade em outras espécies bacterianas.
Introdução
As bactérias empregam muitos apêndices para movimentação e dispersão em seus nichos ecológicos1. A motilidade conduzida por Flagella é a mais rápida delas, promovendo a colonização de locais favoráveis em resposta aos sinais ambientais, contribuindo significativamente para a capacidade patogênica de algumas espécies2,3. Bactérias flageladas podem nadar individualmente em líquido a granel, ou enxame como um coletivo sobre uma superfície semissólida4. A flagela extracelular se prende e é conduzida por motores rotativos embutidos na membrana, que aproveitam a potênc....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Isolamento de mutantes supressores em cepas deficientes de motilidade
NOTA: Use este método como um amplo "catch-all" para identificar a natureza geral do defeito de motilidade.
- Preparação de placas de ágar macio
NOTA: O ágar macio, também chamado de ágar de motilidade ou natação, é um ágar de baixa porcentagem (~0,2-0,35% w/v), muito usado para avaliarquimiotaxis 31,32.- Adicione 3 g de bacto-agar (0,3% w/v) e 20 g de LB a um frasco fundo redondo de 2 L. Adicione 1 L de ddH2O (água duplamente destilada) ao frasco e misture uniforme....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O isolamento de pseudo-revertentes em uma cepa de E. coli cuja motilidade é prejudicada por altos níveis da molécula de sinalização c-di-GMP, foi detalhado em trabalhos recentes do nosso laboratório34. Esta cepa (JP1442) abrigava duas mutações: ΔyhjH e ΔycgR. YhjH é o fosfodiesterase mais ativo que degrada c-di-GMP em E. coli. A ausência de YhjH leva a níveis elevados de c-di-GMP e inibição da motilidade. YcgR é um efeito c-di-GMP. Em complexo com c-di-GMP, YcgR.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O isolamento e a caracterização das mutações supressoras contribuíram com sucesso para identificar componentes-chave do sistema de quimioterapia35,36,37, bem como da própria máquina motora38,39,40. Ao usar o Protocolo 1, é importante incluir múltiplas réplicas independentes para garantir o isolamento de um grande espectro de possíveis m.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde de subvenção GM118085 e em parte pela Fundação Robert Welch (conceder F-1811 a R.M.H.).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Bacto Ágar Desidratado | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
| EDTA Dissódico Sal, Dihidratado | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
| Eiken Agar | Eiken Chemical Co. Japão | E-MJ00 | Essencial para E. coli enxameando |
| Glicose D (+) | Fisher Scientific | ||
| LB (Lennox) Caldo | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
| Solução de Poli-L-lisina (0,1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
| Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Materiais e Equipamentos | |||
| CellSense software de imagem de microscópio (V. 1.6) | Olympus | Ou software equivalente para microscópio usado | |
| Fita Adesiva Doube Scotch 666 Fisher | 50-285-28 | ||
| Lâminas de microscópio fosco 3x1x1mm | Fisher | 12-550-343 | |
| Microscópio Olympus BX53 | Olympus | BX53 | Qualquer microscópio de fase vertical ou invertida pode ser usado |
| em placas de Petri (100 mm de diâmetro) | Fisher Scientific | FB0875712 | Para ensaios de ágar macio |
| Nebulizador de polietileno Tubo capilar (0,58 mm x 99 mm 3,0 m) | Perkin Elmer | ||
| Placa de Petri redonda com 2 compartimentos | VWR | 89200-944 | Para ensaios de travessia de fronteiras |
| Agulhas hipodérmicas de segurança (23G) | Fisher Scientific | 14-826A | |
| Seringa estéril - 1 mL | Fisher scientific | 14-955-450 | |
| Toalhetes de tarefas/tecidos | Fisher scientific | 06-666 | Ou toalhetes de tecido de uso único equivalentes |
| VWR micro vidro de cobertura 18x18mm | VWR | 48366205 | |
| XM10 câmera | Olympus | XM10 | Ou câmera de microscópio equivalente |
Referências
- Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
- Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
