Artigo de método

Avaliação quantitativa de PCR em tempo real de expressões de microRNA no rim do rato com obstrução ureteral unilateral

DOI:

10.3791/61383

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27 de agosto de 2020

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1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos um método para avaliar a expressão de microRNA nos rins de camundongos com obstrução ureteral unilateral (UUO) por reação quantitativa em cadeia de polimerase de transcrição reversa. Este protocolo é adequado para estudar perfis de expressão de microRNA renal em camundongos com UUO e no contexto de outras condições patológicas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA não codificadas e não codificadas que normalmente regulam a expressão genética no nível pós-transcricional, vinculando-se a locais-alvo parcialmente complementares na região não traduzida (UTR) de RNA mensageiro (mRNA), o que reduz a tradução e estabilidade do mRNA. Os perfis de expressão miRNA em vários órgãos e tecidos de camundongos foram investigados, mas métodos padrão para a purificação e quantificação do miRNA no rim de camundongos não estão disponíveis. Estabelecemos um método eficaz e confiável para extrair e avaliar a expressão miRNA no rim do rato com fibrose intersticial renal por reação quantitativa de cadeia de polimerase de transcrição reversa (qRT-PCR). O protocolo exigia cinco etapas: (1) criação de camundongos de obstrução ureteral falsa e unilateral (UUO); (2) extração de amostras de rins dos camundongos UUO; (3) extração do RNA total, que inclui miRNA, a partir das amostras de rim; (4) síntese complementar de DNA (cDNA) com transcrição reversa do miRNA; e (5) qRT-PCR utilizando o cDNA. Usando este protocolo, confirmamos com sucesso que, em comparação com os controles, a expressão de miRNA-3070-3p foi significativamente aumentada e as de miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p foram significativamente diminuídas nos rins de um modelo de camundongo de fibrose interstícia renal. Este protocolo pode ser usado para determinar a expressão miRNA nos rins de camundongos com UUO.

Introdução

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MicroRNAs (miRNAs) — os RNAs curtos e não codificados que causam a degradação e inibição transcricional do RNA mensageiro (mRNA)1 — têm mostrado regular a expressão de vários mRNAs que têm papéis cruciais tanto na fisiologia quanto na doença (por exemplo, inflamação, fibrose, distúrbios metabólicos e câncer). Alguns dos miRNAs podem, portanto, ser novos biomarcadores candidatos e alvos terapêuticos para uma variedade de doenças2,3,,4,5. Embora os perfis de expressão do miRNA em órgãos e tecidos do camundongo, incluindo cérebro, coração, pulmão, fígado e rim tenham sido descritos6,7,8,9,10, não houve métodos padrão para a extração e avaliação de miRNAs em rim de camundongo com fibrose intersticial renal.

Nós projetamos um protocolo para purificar e detectar de forma confiável as expressões de miRNAs nos rins de camundongos com fibrose interstícia renal. O protocolo envolve cinco etapas principais, da seguinte forma. (1) Camundongos machos C57BL/6 de 8 semanas de idade são divididos em grupos de camundongos submetidos a uma operação falsa (controles) e camundongos submetidos a uma cirurgia que fornece obstrução ureteral unilateral (UUO), que está ligada à fibrose intersticial renal. (2) As amostras de rim são extraídas dos camundongos sham e UUO, homogeneizadas separadamente em um homogeneizador de silício e, em seguida, transferidas para um sistema de trituração de biopolímeros em uma coluna de spin de microcentrifuuge11,,12. (3) O RNA total contendo miRNA é extraído das amostras de rim por uma coluna de spin baseada em membrana sílica12,13. (4) Utilizando este RNA total extraído, o DNA complementar (cDNA) é sintetizado a partir do RNA total com o uso de transcriptase reversa, poli(A) polimerase e primer oligo-dT14,15. (5) As expressões de miRNAs são avaliadas pela reação quantitativa da cadeia de polimerase de transcrição reversa (qRT-PCR) utilizando um corante intercalante14,15.

Este protocolo baseia-se em investigações que obtiveram extrações significativas e avaliações de miRNAs em uma variedade de tecidos11,,12,,13,,14,15, e o sistema de trituração de biopolímeros utilizado no protocolo foi mostrado para purificar RNA total de alta qualidade dos tecidos em 200612. Além disso, estudos anteriores confirmaram a exatidão e sensibilidade dos aspectos do protocolo (ou seja, a síntese de cDNA com transcriptase reversa, poli(A) polimerase e primers oligo-dT do RNA total extraído) para a determinação da expressão miRNA por qRT-PCR com um corante intercalante14,15. Como o novo protocolo tem as vantagens da simplicidade, economia de tempo e redução de erros técnicos, o protocolo pode ser usado em pesquisas que exigem a identificação precisa e sensível do perfil miRNA no rim do rato. Além disso, o protocolo poderia ser aplicado a investigações de muitas condições patológicas.

Em seguida, descrevemos a determinação dos perfis de expressão miRNA em camundongos com UUO, que está ligado à fibrose intersticial renal. Em humanos, a fibrose intersticial renal é uma característica comum e importante tanto da doença renal crônica quanto da doença renal em estágio terminal, independentemente de sua etiologia16,17. Esta fibrose intersticial renal está associada à progressão da insuficiência renal, e é caracterizada pelo aumento das expressões de componentes da matriz extracelular nos espaços intersticiais (por exemplo, colágeno, fibronectina e actina muscular α suave)17,18.

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Protocolo

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Todos os protocolos experimentais animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Jichi Medical University e foram realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Guia da Universidade Médica jichi para animais de laboratório.

1. A falsa cirurgia

  1. Prepare os seguintes itens: isoflurane, folha de cortiça, creme depilatório, lenços umedecidos de laboratório, placa de Petri com soro fisco tamponado de fosfato (PBS), 4-0 nylon, pinças, tesoura cirúrgica, cotonetes de algodão e camundongos C57BL/6 machos de 8 semanas de idade.
  2. Anestesiar um rato com isoflurane de 1,5% e manter-se em 1,5%. Em seguida, aplique creme depilatório no abdômen do rato. Depois de alguns minutos, limpe o creme depilatório com um lenço de laboratório encharcado de PBS.
  3. Injete 70% de etanol no abdômen do mouse e coloque o mouse na folha de cortiça na posição supina.
  4. Utilizando tesoura cirúrgica e pinça, faça uma incisão na pele no abdômen e corte a membrana muscular e peritoneal da bexiga até a borda inferior esquerda das costelas.
  5. Umedeça dois cotonetes de algodão com PBS e, em seguida, puxe os intestinos cuidadosamente para o lado. Coloque os cotonetes umedecidos para identificar o rim esquerdo e o ureter.
  6. Feche a membrana peritoneal e feche a incisão com 4-0 de nylon.

2. A cirurgia uuo

  1. Prepare os seguintes itens: isoflurane, folha de cortiça, creme depilatório, lenços umedecidos de laboratório, placa de Petri com PBS, 4-0 de seda, 4-0 nylon, uma seringa de 2,5 mL, cotonetes de algodão, pinças, tesoura cirúrgica e 8 semanas de idade C57BL/6 ratos machos.
  2. Anestesiar um rato com isoflurane de 1,5% e manter-se em 1,5%. Em seguida, aplique creme depilatório no abdômen do rato. Depois de alguns minutos, limpe o creme depilatório com um lenço de laboratório encharcado de PBS.
  3. Injete 70% de etanol no rato do abdômen do mouse e coloque o mouse na posição supina na folha de cortiça.
  4. Utilizando tesoura cirúrgica e pinça, faça uma incisão na pele no abdômen e corte a membrana muscular e peritoneal da bexiga até a borda inferior esquerda das costelas.
  5. Coloque a seringa de 2,5 mL debaixo do mouse. Pegue dois cotonetes de algodão e os umedeça com PBS. Puxe os intestinos cuidadosamente para o lado com a pinça, e coloque os cotonetes umedecidos adequadamente para identificar o ureter esquerdo. Usando a pinça, levante o rim esquerdo.
  6. Use a seda 4-0 para ligar o ureter esquerdo em dois lugares com aproximadamente 1 cm de distância. Corte o ureter no ponto central das duas ligaduras e use suturas de nylon 4-0 para fechar a membrana peritoneal e incisão.

3. Coleta de amostras de rins

  1. Prepare o seguinte: tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, isoflurane, folha de cortiça, 70% de etanol, placa de Petri com PBS, pinça e tesoura cirúrgica.
  2. Anestesiar um rato com isoflurane de 1,5% e manter-se em 1,5%. Injete 70% de etanol no abdômen e coloque o rato na folha de cortiça na posição supina.
  3. Utilizando tesoura cirúrgica e pinça, faça uma incisão na pele no abdômen e corte a membrana muscular e peritoneal da bexiga até a borda inferior esquerda das costelas.
  4. Levante a membrana peritoneal com a pinça. Com a tesoura cirúrgica, faça uma incisão lateral na borda superior da membrana peritoneal, e continue a incisão ao longo da borda mais baixa das costelas.
  5. Em seguida, identifique o rim esquerdo, refluxeá-lo com PBS até que o rim fique amarelo-branco para lavar o sangue dos vasos, e remova o rim cortando a artéria renal esquerda e veia com a tesoura cirúrgica. Coloque o rim na placa de Petri e lave-o cuidadosamente com PBS.
  6. Corte o rim em amostras de 10 mgs com a tesoura cirúrgica e a pinça (10 mgs é um tamanho apropriado para o próximo passo). Coloque cada pedaço do rim em seu próprio tubo de microcentrifutura de 1,5 mL e feche a tampa do tubo.
  7. Transfira cada tubo de microcentrifuuagem em nitrogênio líquido e mantenha os tubos a −80 °C para armazenamento a longo prazo antes de usar.

4. Extração do RNA total das amostras de rim

  1. Prepare os seguintes itens: tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL, tubos de microcentrifuuge de 2,0 mL, 100% etanol, clorofórmio, homogeneizador de silício, gelo, um misturador de vórtice, colunas de rotação biopolímeras em tubos de coleta de 2,0 mL11,,12, colunas de spin ancoradas em membrana em tubos de coleta de 2,0 mL12,,13, reagente à base de fenol/guanidina, tampão de lavagem contendo guanidina e etanol (tampão de lavagem 1), tampão de lavagem contendo etanol (tampão de lavagem 2) e água sem rnase.
  2. Coloque uma amostra de 10 mg de rim no homogeneizador de silício. Adicione 700 μL do reagente de lise à base de fenol/guanidina no homogeneizador.
  3. Prepare o homogeneizador e, em seguida, pressione/torça lentamente o pilão do homogeneizador contra a amostra renal para homogeneizar a amostra. Repita a prensagem/torção até que a amostra de rim esteja completamente dissolizada no reagente de lise à base de fenol/guanidina.
  4. Para homogeneizar ainda mais a amostra, transfira o liseto homogeneizado (em um tubo de coleta de 2,0 mL) para a coluna de giro biopolímero.
  5. Gire o lise homogeneizado a 14.000 x g por 3 min a temperatura ambiente (RT), e depois transfira o liceu precipitado para um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL nãoutil.
  6. Misture o lise no tubo com 140 μL de clorofórmio e, em seguida, feche a tampa do tubo firmemente. Para misturar o liseto e o clorofórmio, inverta o tubo 15 vezes.
    NOTA: O clorofórmio pode ser usado sem capô.
  7. Incubar cada amostra por 2-3 min no RT e, em seguida, girar cada amostra a 12.000 x g por 15 min a 4°C.
  8. Sem perturbar o precipitado, transfira o supernascer (que normalmente é ~300 μL) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e, em seguida, adicione 1,5x seu volume (tipicamente ~450 μL) de 100% de etanol. Vórtice a mistura para 5 s.
  9. Carregue 700 μL da amostra em uma coluna de giro ancorada em membrana em um tubo de coleta de 2,0 mL. Feche a tampa da coluna e gire a coluna a 15.000 x g para 15 s. Jogue fora o lysate precipitado no tubo de coleta.
  10. Lave bem a amostra adicionando 700 μL de tampão de lavagem 1 à coluna de giro ancorada na membrana em um tubo de coleta de 2,0 mL. Feche a tampa da coluna e gire a coluna a 15.000 x g para 15 s. Jogue fora o lysate precipitado no tubo de coleta.
  11. Carregue 500 μL de tampão de lavagem 2 na coluna de giro ancorada na membrana em um tubo de coleta de 2,0 mL para remover sais de rastreamento. Feche a tampa da coluna e gire a coluna a 15.000 x g para 15 s. Jogue fora o lysate precipitado no tubo de coleta.
    NOTA: Uma coluna de spin ancorada em membrana pode separar RNA e DNA.
  12. Executar passo 4.11 novamente.
  13. Gire a coluna de giro ancorada em membrana em um tubo de coleta de 2,0 mL novamente a 15.000 x g por 1 min. Jogue fora o lysate precipitado no tubo de coleta.
  14. Transfira a coluna de giro ancorada na membrana para um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Dissolva o RNA total adicionando 30 μL de água sem RNase à coluna. Feche a tampa da coluna e espere 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, gire a coluna a 15.000 x g por 1 min.
  15. Transfira a quantidade total de amostra contendo RNA total para um novo tubo de microcentrífuga. Coloque cada um dos tubos no gelo, e meça a concentração do RNA total por espectrofotometria.
  16. Mantenha os tubos com amostras a −80 °C para armazenamento a longo prazo antes de usar.

5. Síntese de cDNA com a transcrição reversa do RNA total

NOTA: As diretrizes do MIQE (Informações Mínimas para a Publicação de Experimentos Quantitativos em Tempo Real de PCR) foram emitidas para incentivar melhores práticas experimentais e ajudar a obter resultados confiáveis e inequívocos19. Neste protocolo, o cDNA é sintetizado a partir de 1,0 μg de RNA total purificado em um procedimento de duas etapas usando transcriptase reversa, poli(A) polimerase e primer oligo-dT.

  1. Prepare o seguinte: tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL, tubos de tira de oito poços com tampas, a tampa de cada tubo de oito tiras, água destilada, gelo, um kit de transcriptase reversa (ver a Tabela de Materiais)14,15 no estado derretido, um cicloviário térmico e um misturador de vórtice.
  2. Inicie o cicloviário térmico.
  3. Prepare uma solução de mix mestre: Adicione 2,0 μL de mistura de transcriptase reversa (incluída no kit) e 2,0 μL de mistura de ácido nucleico de 10x em 4,0 μL de tampão de alta especificação de 5x (para obter um total de 8,0 μL mix mestre por tubo).
  4. Coloque 8,0 μL da solução de mistura mestre em cada tubo de um tubo de tira de oito poços.
  5. Ajuste a densidade total do RNA. Para isolar 1,0 μg de RNA total das amostras de rim em 12 μL de água livre de RNase, transfira a quantidade apropriada de RNA total para água destilada, utilizando os dados de densidade medidos conforme descrito na etapa 4.15.
    NOTA: Se houver contaminação do DNA, o DNA contaminado será co-amplificado no qRT-PCR.
  6. Coloque uma alíquota de 12 μL de RNA total em cada tubo e feche a tampa do tubo. Centrifugar o tubo por 15 x.
  7. Coloque o tubo no cicloviário térmico e incubar a amostra por 60 min a 37 °C. Em seguida, incuba imediatamente a amostra por 5 min a 95 °C para a síntese de cDNA.
  8. Quando a incubação estiver completa, transfira o cDNA para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e dilua o cDNA dez vezes (1:10) com água destilada. Vórtice e centrífuga do tubo para 5 s.
  9. Armazene temporariamente o cDNA diluído no gelo e mova as amostras para −80 °C para armazenamento a longo prazo antes de usar.

6. qRT-PCR de miRNA

NOTA: Utilizamos o método intercalador para executar o qRT-PCR de miRNA. Os primers para RNA são U6 pequeno nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p foram usados.

  1. Prepare o seguinte: tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL, um misturador de vórtice, uma placa de reação de 96 poços para o qRT-PCR, filme adesivo para a placa de reação de 96 poços, um aplicador de filme adesivo, um rotor de centrífugas de 96 poços, primers específicos de miRNA, um instrumento PCR em tempo real e um kit PCR verde baseado em corante (ver a Tabela de Materiais)14,,15 contendo mix mestre PCR 2x e primer universal de 10x.
  2. Depois de misturá-los em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL, vórtice os seguintes itens: 6,25 μL de água destilada, 1,25 μL de cada primer miRNA de 5 μM dissolvido em água sem nuclease, 12,5 μL de 2× mix mestre PCR e 2,5 μL de primer universal de 10x.
  3. Prepare o cDNA sintetizado como descrito na etapa 5, e derreta-o. Vórtice e centrífuga o cDNA para 5 s.
  4. Coloque uma alíquota de 22,5 μL do reagente (criado como descrito na etapa 6.2) em cada poço da placa de 96 poços.
  5. Coloque uma alíquota de 2,5 μL de cDNA em cada poço da placa.
  6. Usando o aplicador de filme adesivo, fixe a película adesiva firmemente na placa de 96 poços. Centrifugar a placa com o rotor centrífuga de 96 poços a 1.000 x g por 30 s para resolver as reações na parte inferior de cada poço.

7. Ciclismo pcr

  1. Inicie o sistema PCR em tempo real e coloque a placa criada conforme descrito na etapa 6.6. no sistema PCR em tempo real. Definir as propriedades do experimento em seguida; identificar o nome do experimento. Selecione o seguinte: "96-well (0.2 mL)" como o tipo de experimento do sistema, "Ct comparativo (ΔΔCT)" como o método de quantitação, "SYBR Green Reagents" como reagentes para detectar a sequência de destino, e "padrão" à medida que o sistema é executado.
  2. Atribua um nome à amostra e ao miRNA de destino e, em seguida, atribua um nome à amostra e ao miRNA alvo em cada poço. As amostras devem ser atribuídas em duplicata para obter dados apropriados para confirmação dos resultados. Selecione uma amostra de referência e um controle endógeno e selecione "nenhum" para que o corante seja usado como referência passiva. Certifique-se de definir a transcriptase reversa negativa e o controle não-modelo para a expressão miRNA, a fim de eliminar a contaminação cruzada dos reagentes.
  3. Certifique-se de que a configuração do volume de reação é "20 μL" e as condições de ciclismo PCR são definidas em 95 °C por 15 min, seguidas por 40 ciclos de desnaturação a 94 °C para 15 s, ressarem a 55 °C para 30 s e extensão a 70 °C para 30 s.
  4. Após o processo qRT-PCR ser concluído, use o programa de software do sistema para analisar os dados qRT-PCR. Certifique-se de que a linha de limiar que é automaticamente selecionada pelo programa de software é apropriada para cada poço.
  5. Verifique o valor do ciclo limiar (CT) do controle endógeno e do miRNA de destino analisado em cada amostra. O valor da TC é determinado pela intersecção da curva de amplificação e da linha limiar. No presente estudo, utilizamos RNU6-2 como um controle endógeno para o nível de expressão miRNA alvo, e utilizamos o método ΔΔCT para determinar o nível de expressão relativa de cada alvo miRNA20.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um modelo de rato UUO foi criado por ligadura ureteral esquerda, como descrito21 em camundongos machos de 8 semanas de idade pesando 20-25 g. Os ureteres foram completamente obstruídos por ligadura dupla com suturas de seda 4-0. Um analgésico (meloxicam 5 mg/kg, injeção subcutânea) foi administrado antes da cirurgia e também diariamente nos 2 dias pós-cirurgia. Aos 8 dias após a cirurgia, foram coletados rins, enxaguados com PBS, dissecados e armazenados em nitrogênio líquido para análise posterio...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo acima descrito com qRT-PCR determinou com sucesso os níveis de expressão dos miRNAs direcionados. A avaliação das miRNAs extraídas é importante na busca de obter dados significativos de qRT-PCR, e a fim de confirmar a qualidade dos miRNAs antes de realizar o qRT-PCR, a razão de absorção em 260 nm para que em 280 nm deve ser verificada com um espectótmetro. Se uma única amplificação pcr do comprimento esperado e temperatura de fusão ou uma curva de fusão monomodal não pode ser obtida por qRT-PCR, pode haver co...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Michelle Goody, PhD, do Grupo Edanz (https://en-author-services.edanzgroup.com/) por editar um rascunho deste manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Qiagen79216Tampão de lavagem 2
Qiagen1067933Tampão de lavagem 1
Tokyo Laboratory Animals ScienceNão atribuído
Thermo Fisher Scientific4316813placa
Thermo Fisher Scientific4311971Filme adesivo para placa
de reação de 96 poçosQiagenMS000017015'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen
MS000651415'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3'Qiagen
MS000680675'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3'Qiagen
MS000680815'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen
217004Rotação ancorada por membrana coluna em um tubo de coleta de 2,0 mL
Instrumento de PCR em tempo real
Rolamento 9968-32
de reação de 96 poços Qiagen 218161 Kit de transcriptase reversa Qiagen 218073 Kit de PCR à base de corante verde Qiagen 79654 Colunas de rotação de biopolímero em um tubo de coleta de 2,0 mL Qiagen 79306 Reagente de lise à base de fenol/guanidina Thermo Fisher Scientific 4472380 Thermo Fisher Scientific 4472380 Software de instrumento de PCR em tempo real Qiagen 129112 Qiagen MS00033740 Não divulgado Takara Bio 9790B Homogeneizador de silício ASKUL GA04SW COMO UM ER1004NA45-KF2,62 -

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Express o de MicroRNAExtra o de RNAS ntese de cDNAmiRNA 3070 3pmiRNA 7218 5pmiRNA 7219 5pFibrose Renal

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