Artigo de método

Um modelo pré-clínico de impacto cortical controlado para hemorragia traumática, contusão e neuroinflamação

DOI:

10.3791/61393

⸱

10 de junho de 2020

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Cheng Hsin General Hospital, 2Graduate Institute of Physiology, College of Medicine, National Taiwan University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemorragia intraparenquimatosa e neuroinflamação acompanhadas de contusão cerebral podem desencadear lesão cerebral secundária grave. Este protocolo detalha um modelo de impacto cortical controlado por camundongos (CCI), permitindo que os pesquisadores estudem a contusão por hemorragia e respostas imunes pós-traumáticas e explorem possíveis terapêuticas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A contusão cerebral é um problema médico grave que afeta milhões de pessoas em todo o mundo a cada ano. Há uma necessidade urgente de entender o mecanismo fisiopatológico e desenvolver uma estratégia terapêutica eficaz para esse distúrbio neurológico devastador. A hemorragia intraparenquimatosa e a resposta inflamatória pós-traumática induzida pelo impacto físico inicial podem agravar a ativação da microglia/macrófago e a neuroinflamação que subsequentemente pioram a patologia cerebral. Fornecemos aqui um protocolo de impacto cortical controlado (CCI) que pode reproduzir a contusão cortical experimental em camundongos usando um sistema de impactor pneumático para fornecer força mecânica com magnitude e velocidade controláveis na superfície dural. Este modelo pré-clínico permite que os pesquisadores induzam contusão cerebral focal moderadamente grave em camundongos e investiguem uma ampla gama de progressões patológicas pós-traumáticas, incluindo contusão hemorrágica, ativação de micróglia/macrófagos, toxicidade de ferro, lesão axonal, bem como déficits neurocomportamentais de curto e longo prazo. O presente protocolo pode ser útil para explorar os efeitos a longo prazo e as possíveis intervenções para a contusão cerebral.

Introdução

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A contusão cerebral é uma forma de lesão cerebral traumática que está entre os problemas de saúde mais mortais da sociedade moderna1. É causada principalmente por eventos acidentais, como acidentes de trânsito, que resultam em forças externas que aplicam energia mecânica na cabeça. O traumatismo cranioencefálico afeta aproximadamente 3,5 milhões de pessoas e é responsável por 30% de todas as mortes relacionadas a lesões agudas nos EUA a cada ano2. Os pacientes que sobrevivem à contusão cerebral muitas vezes sofrem consequências de longo prazo, incluindo fraqueza motora focal, disfunção sensorial e doença mental1.

A lesão primária da contusão cerebral é induzida por fatores mecânicos, incluindo forças de estiramento e ruptura, levando à deformação imediata da estrutura parenquimatosa e morte celular focal do SNC3. Contusão hemorrágica é um termo geral para hemorragias cerebrais devido a ruptura vascular no local do traumatismo craniano4. Especificamente, a hemorragia intraparenquimatosa ocorre imediatamente após uma contusão cerebral que leva à formação tardia de hematoma. Dentro do hematoma, a hemoglobina e o ferro livre liberados dos glóbulos vermelhos lisados podem desencadear ainda mais toxicidade relacionada ao sangue 5,6, que causa hérnia, edema cerebral e elevação da pressão intracraniana 5,6. As funções colaborativas dos neurônios (axônios), glia, vasos sanguíneos e tecido de suporte também são comprometidas pelo efeito de massa do hematoma7. Além disso, a neuroinflamação persistente e difusa com neurodegeneração progressiva continua por meses e causa danos secundários no cérebro8.

A ativação da microglia é uma das muitas características patológicas importantes da contusão cerebral 9,10. Depois de detectar os padrões moleculares associados a danos (DAMPs) e o sangue vazado no tecido lesionado, a microglia ativada desencadeia neuroinflamação que promove danos cerebrais secundários11. Além disso, o quimioatraente liberado pela microglia promove a infiltração de células imunes periféricas no território traumático, resultando na produção de espécies reativas de oxigênio e citocinas pró-inflamatórias. Isso cria um ambiente pró-inflamatório autoperpetuante que desencadeia lesão cerebral progressiva 9,12. Enquanto isso, a microglia com um fenótipo ativado alternativamente pode contribuir para a restauração homeostática do tecido e reparo cerebral através da limpeza de detritos do tecido lesionado13. A prevenção da neuroinflamação secundária por meio da redução das respostas imunes microgliais prejudiciais demonstrou ser particularmente útil para promover a recuperação cerebral da contusão cerebral 3,9,10,12.

Vários modelos pré-clínicos foram desenvolvidos para estudar lesão cerebral traumática, incluindo modelo de queda de peso, lesão por percussão de fluido lateral e modelo de onda de choque14,15. No entanto, cada um desses modelos tem sua fraqueza, incluindo alta taxa de mortalidade durante o procedimento, baixa reprodutibilidade dos resultados histológicos e alta variabilidade da lesão infligida entre os laboratórios 16,17. Em comparação, o modelo de impacto cortical controlado (ICC) é mais adequado para o estudo da contusão cerebral focal devido ao seu controle preciso e alta reprodutibilidade 14,15,18,19.

Além disso, por meio da manipulação dos parâmetros de deformação biomecânica, como velocidade e profundidade do impacto, a gravidade do dano induzido pode ser controlada para produzir uma ampla gama de magnitudes de lesão, permitindo que os pesquisadores mimetizem diferentes níveis de comprometimento frequentemente observados em pacientes17. O modelo pré-clínico da ICC foi desenvolvido pela primeira vez em 189620. Desde então, o CCI tem sido o modelo aplicável mais amplo a ser modificado para uso em primatas21, suínos22, ovinos23, ratos24 e camundongos25. Juntas, essas características fazem do ICC um dos modelos experimentais de contusão cerebral maisadequados26.

Nosso laboratório usa um sistema de impacto CCI pneumático disponível comercialmente e parâmetros de deformação biomecânica testados para produzir contusão cerebral focal moderadamente grave que territorializa as áreas corticais sensoriais e motoras primárias sem danificar o hipocampo27,28. Nós e outros demonstramos que este procedimento de ICC pode ser usado para estudar características clínicas de contusão cerebral humana, incluindo perda de tecido cerebral, lesão neuronal, hemorragia intraparenquimatosa, neuroinflamação e deficiência sensório-motora 24,25,27,28,29,30 . Aqui, detalhamos um protocolo padrão para realizar CCI em camundongos que permite fazer perguntas sobre perda de mielina induzida por CCI, deposição de ferro, inflamação do SNC, toxicidade hemorrágica e as respostas de microglia / macrófagos após contusão cerebral focal.

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Protocolo

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Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram conduzidos sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral Cheng Hsin e da Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Taiwan. Camundongos C57BL/6 machos do tipo selvagem de oito a dez semanas de idade foram usados neste protocolo.

1. Indução anestésica

  1. Anestesiar o camundongo com ~4% de isoflurano misturado com ar ambiente a ~0,2 L/min em uma câmara de indução conectada ao vaporizador de isoflurano.
  2. Certifique-se de que o padrão respiratório seja suave. Verifique a profundidade da anestesia confirmando a falta de reflexo de pinça no animal.

2. Preparação pré-cirúrgica

  1. Raspe a cabeça do mouse com um cortador elétrico na direção caudal a rostral. Não apare os bigodes do mouse.
    NOTA: A perda de bigodes pode influenciar a precisão dos resultados dos testes comportamentais subsequentes.
  2. Coloque o mouse no quadro estereotáxico. Insira cuidadosamente as barras auriculares nos canais auditivos. Certifique-se de que a cabeça do mouse esteja estabilizada por ambas as barras auriculares igualmente.
  3. Traga o cone do nariz e mantenha a anestesia a 1% - 2% de isoflurano durante a cirurgia.
  4. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento durante a cirurgia. Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento para manter uma temperatura corporal de 37 °C.
  5. Desinfete a cabeça raspada com betadine seguido de álcool 70% usando cotonetes estéreis. Repita três vezes.

3. Cirurgia CCI

  1. Administrar 100 μL de Bupivacaína (0,25%) por via subcutânea com agulha de insulina 31 G antes da incisão. Massageie suavemente o local da injeção para melhor absorção.
    NOTA: Este anestésico local proporciona alívio da dor diretamente no local da cirurgia.
  2. Faça uma incisão longitudinal (~ 1,5 cm) ao longo da linha média do couro cabeludo com um bisturi ou tesoura. Use um hemostático para segurar a pele do lado direito e deixe o crânio exposto secar por 1 min. Use um cotonete estéril para limpar qualquer resíduo de sangue e tecidos no crânio.
  3. Verifique se a cabeça do mouse está nivelada no plano horizontal.
    1. Identifique os pontos de referência anatômicos Bregma e Lambda e marque ambos os locais com um marcador/lápis cirúrgico estéril.
    2. Certifique-se de que a cabeça do animal esteja nivelada na direção rostral-caudal. Faça isso medindo as coordenadas Z de Bregma e Lambda usando uma agulha de insulina de 31 G presa ao quadro estereotáxico.
      NOTA: Ajuste a barra auricular verticalmente, se necessário.
    3. Execute o posicionamento horizontal da cabeça do animal seguindo o mesmo procedimento de verificação das coordenadas Z na linha média junto com dois locais correspondentes no lado esquerdo e direito da linha média e ajuste as barras auriculares, se necessário.
      NOTA: Um posicionamento nivelado e estável da cabeça do animal é crucial para a reprodutibilidade e confiabilidade do modelo CCI.
  4. Use a mesma agulha de insulina 31 G para identificar o local da craniectomia. Defina a origem XY para Bregma e mova lateralmente a agulha 3 mm para a direita. Marque esta posição como o local da craniectomia e desenhe um círculo de 4 mm de diâmetro no crânio com um marcador/lápis cirúrgico estéril.
  5. Use uma micro broca de alta velocidade com uma trefina (4 mm de diâmetro) para cortar ao longo do círculo contornado a lápis para criar um orifício aberto de 4 mm de diâmetro. Use uma configuração de velocidade de 20.000 rpm. Evite aplicar pressão excessiva.
    NOTA: Execute esta etapa rapidamente (geralmente dentro de 30 s a 1 min) para evitar qualquer dano térmico ao cérebro. A aplicação de pressão excessiva durante a perfuração pode levar à penetração acidental que pode comprimir e ferir a superfície do cérebro.
  6. Remova cuidadosamente o retalho ósseo com uma pinça e guarde-o temporariamente em solução salina normal gelada. Enxágue suavemente o orifício com solução salina normal antes de aplicar pressão na superfície do cérebro com a ponta do cotonete para parar o sangramento.
  7. Ajuste a ponta arredondada do pêndulo de 2,5 mm de diâmetro no dispositivo CCI para um ângulo de 22,5°. Zere a ponta de impacto na superfície dural. Defina os parâmetros de impacto na caixa de controle para uma velocidade de 4 m/s e uma profundidade de deformação de 2 mm. Retraia a ponta de metal.
    NOTA: Zerar a ponta enquanto ela é estática e levemente pressionada contra a superfície dural na posição de curso completo melhora a precisão do ponto zero e a reprodutibilidade do nível de lesão.
  8. Descarregue o pistão para gerar impactação no cérebro. Coloque um cotonete estéril na área lesionada para parar o sangramento.
  9. Coloque a aba óssea de volta no cérebro do camundongo e prenda com cimento dental. Feche o couro cabeludo com adesivo tecidual (por exemplo, 3M Vetbond).

4. Recuperação pós-operatória

  1. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa com roupa de cama sob a lâmpada de calor até a recuperação total.
  2. Forneça ração umedecida e administre cetoprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea por dois dias consecutivos após a cirurgia.
  3. Execute os procedimentos acima, exceto as etapas 3.7 e 3.8 para animais de controle simulados.

5. Eutanásia de camundongos

  1. Eutanásia de camundongos no dia do estudo por overdose de isoflurano e depois decapitação.
    NOTA: Várias estratégias podem ser usadas para sacrificar os animais experimentais antes da coleta da amostra.
  2. Colete amostras de cérebro para análise histológica.

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Resultados

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Ilustração da colocação estereotáxica e do procedimento de craniotomia.

O modelo CCI é conhecido por sua estabilidade e reprodutibilidade na produção de lesões que variam de leves a graves18. A técnica estereotáxica adequada e o procedimento de craniotomia são os principais determinantes na produção de lesão cerebral induzida por CCI estável e reprodutível (Figura 1A, B). Um procedimento ideal de craniotomi...

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Discussão

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O protocolo CCI produz lesões mecânicas altamente reprodutíveis no cérebro para pesquisa de contusão cerebral. As etapas a seguir são cruciais para gerar lesões cerebrais consistentes em animais usando este protocolo CCI.

Primeiro, a cabeça do mouse deve ser montada de forma estável na estrutura estereotáxica e os marcos anatômicos Bregma e Lambda sempre no mesmo plano horizontal. A colocação instável ou desnivelada da cabeça muitas vezes resulta em níveis var...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Danye Jiang por editar o manuscrito e sua contribuição perspicaz. Agradecemos a Jhih Syuan Lin por ajudar na preparação do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (MOST 107-2320-B-002-063-MY2) para C.F.C.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Broca Trefina Curta de 4mmSalvin Dental Specialties, Inc.TREPH-SHORT-4
anticorpo anti-Iba1Wako chemicals#019-19741
anticorpo anti-Ly76abcamab91113
cimento carboxilato3M70201136010
impactor de lesão de contusão corticalDesign personalizado e Fabricação, Inc.S/N 49-2004-C, eCCI Modelo 6.3Dispositivo CCI (S/N 49-2004-C, eCCI Modelo 6.3)
acetato violeta de cresilSigma-AldrichC5042
DAB kit de coloraçãoVectorSK-4105
anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
anticorpo secundário IgG de cabra anti-rato, Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
Pinças de HematoxilinaScyTekHMM500
ferramentas de ciências finas11252-20 NO. 5
isofluranoPanion & BF Biotech Inc.
Bupivacaína 0,25%Hospira
carbonato de lítioSigma-Aldrich62470
esteriotexica
de ciência fina ferramentas14068-12
solvente azul 38Sigma-AldrichS3382
de Mayerestrutura tesoura tesoura

Referências

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  1. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16 (12), 987-1048 (2017).
  2. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 66 (9), 1-16 (2007).
  3. Pearn, M. L., et al. Pathophysiology Associated with Traumatic Brain Injury: Current Treatments and Potential Novel Therapeutics. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (4), 571-585 (2017).
  4. Nyanzu, M., et al. Improving on Laboratory Traumatic Brain Injury Models to Achieve Better Results. International Journal of Medical Sciences. 14 (5), 494-505 (2017).
  5. Zhao, M., et al. Iron-induced neuronal damage in a rat model of post-traumatic stress disorder. Neuroscience. 330, 90-99 (2016).
  6. Cepeda, S., et al. Contrecoup Traumatic Intracerebral Hemorrhage: A Geometric Study of the Impact Site and Association with Hemorrhagic Progression. Journal of Neurotrauma. 33 (11), 1034-1046 (2016).
  7. Robicsek, S. A., Bhattacharya, A., Rabai, F., Shukla, K., Dore, S. Blood-Related Toxicity after Traumatic Brain Injury: Potential Targets for Neuroprotection. Molecular Neurobiology. 57 (1), 159-178 (2020).
  8. Morganti-Kossmann, M. C., Semple, B. D., Hellewell, S. C., Bye, N., Ziebell, J. M. The complexity of neuroinflammation consequent to traumatic brain injury: from research evidence to potential treatments. Acta Neuropathologica. 137 (5), 731-755 (2019).
  9. Ramlackhansingh, A. F., et al. Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury. Annals of Neurology. 70 (3), 374-383 (2011).
  10. Wang, G. H., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864-1874 (2013).
  11. Karve, I. P., Taylor, J. M., Crack, P. J. The contribution of astrocytes and microglia to traumatic brain injury. British Journal of Pharmacology. 173 (4), 692-702 (2016).
  12. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
  13. Russo, M. V., McGavern, D. B. Inflammatory neuroprotection following traumatic brain injury. Science. 353 (6301), 783-785 (2016).
  14. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 128-142 (2013).
  15. Johnson, V. E., Meaney, D. F., Cullen, D. K., Smith, D. H. Animal models of traumatic brain injury. Handbook of Clinical Neurology. 127, 115-128 (2015).
  16. Albert-Weissenberger, C., Siren, A. L. Experimental traumatic brain injury. Experimental & Translational Stroke Medicine. 2 (1), 16(2010).
  17. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal Models of Traumatic Brain Injury and Assessment of Injury Severity. Molecular Neurobiology. 56 (8), 5332-5345 (2019).
  18. Osier, N. D., Korpon, J. R., Dixon, C. E. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. Kobeissy, F. H. , (2015).
  19. Osier, N. D., Dixon, C. E. The Controlled Cortical Impact Model: Applications, Considerations for Researchers, and Future Directions. Frontiers in Neurology. 7, 134(2016).
  20. Kramer, S. P. A Contribution to the Theory of Cerebral Concussion. Annals of Surgery. 23 (2), 163-173 (1896).
  21. King, C., et al. Brain temperature profiles during epidural cooling with the ChillerPad in a monkey model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 27 (10), 1895-1903 (2010).
  22. Costine, B. A., et al. Neuron-specific enolase, but not S100B or myelin basic protein, increases in peripheral blood corresponding to lesion volume after cortical impact in piglets. Journal of Neurotrauma. 29 (17), 2689-2695 (2012).
  23. Anderson, R. W., Brown, C. J., Blumbergs, P. C., McLean, A. J., Jones, N. R. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. Journal of Neurotrauma. 20 (10), 961-974 (2003).
  24. Chen, S., Pickard, J. D., Harris, N. G. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Experimental Neurology. 182 (1), 87-102 (2003).
  25. Lee, H. F., Lin, J. S., Chang, C. F. Acute Kahweol Treatment Attenuates Traumatic Brain Injury Neuroinflammation and Functional Deficits. Nutrients. 11 (10), 2301(2019).
  26. Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
  27. Hung, T. H., et al. Deletion or inhibition of soluble epoxide hydrolase protects against brain damage and reduces microglia-mediated neuroinflammation in traumatic brain injury. Oncotarget. 8 (61), 103236-103260 (2017).
  28. Wu, C. H., et al. Post-injury treatment with 7,8-dihydroxyflavone, a TrkB receptor agonist, protects against experimental traumatic brain injury via PI3K/Akt signaling. PLoS One. 9 (11), 113397(2014).
  29. Chen, S. F., Su, W. S., Wu, C. H., Lan, T. H., Yang, F. Y. Transcranial Ultrasound Stimulation Improves Long-Term Functional Outcomes and Protects Against Brain Damage in Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 55 (8), 7079-7089 (2018).
  30. Su, W. S., Wu, C. H., Chen, S. F., Yang, F. Y. Low-intensity pulsed ultrasound improves behavioral and histological outcomes after experimental traumatic brain injury. Scientific Reports. 7 (1), 15524(2017).
  31. Chen, S. F., et al. Salidroside improves behavioral and histological outcomes and reduces apoptosis via PI3K/Akt signaling after experimental traumatic brain injury. PLoS One. 7 (9), 45763(2012).
  32. Chen, C. C., et al. Berberine protects against neuronal damage via suppression of glia-mediated inflammation in traumatic brain injury. PLoS One. 9 (12), 115694(2014).
  33. Furmanski, O., Nieves, M. D., Doughty, M. L. Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells. Journal of Visualized experiments. (149), e59561(2019).
  34. Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized experiments. (90), e51781(2014).
  35. Saatman, K. E., Feeko, K. J., Pape, R. L., Raghupathi, R. Differential behavioral and histopathological responses to graded cortical impact injury in mice. Journal of Neurotrauma. 23 (8), 1241-1253 (2006).
  36. Robertson, C. L., et al. Cerebral glucose metabolism in an immature rat model of pediatric traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (24), 2066-2072 (2013).
  37. Adelson, P. D., Fellows-Mayle, W., Kochanek, P. M., Dixon, C. E. Morris water maze function and histologic characterization of two age-at-injury experimental models of controlled cortical impact in the immature rat. Child's Nervous System. 29 (1), 43-53 (2013).

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