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Cancer Research

मानव पेट के कैंसर कोशिकाओं में डीएनए क्षति और मरम्मत Foci के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61399
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Nuclear Facilities Operations Department, National Centre for Nuclear Research, Sołtana 7, 05-400 Otwock, Poland

Summary

बोरोन न्यूट्रॉन कैप्चर थेरेपी (बीएनसीटी) में इस्तेमाल होने वाले न्यूट्रॉन मिश्रित-बीम द्वारा सक्रिय विकिरण-प्रेरित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया पूरी तरह से स्थापित नहीं की गई है । यह प्रोटोकॉल न्यूट्रॉन-मिश्रित बीम के साथ विकिरण के बाद मानव पेट के कैंसर सेल लाइनों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा मरम्मत प्रोटीन के विकिरण-प्रेरित फोसी (आरआईएफ) का पता लगाने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रक्रिया प्रदान करता है।

Abstract

पांडुलिपि का उद्देश्य बोरोन न्यूट्रॉन कैप्चर थेरेपी (बीएनसीटी) में उपयोग किए जाने वाले न्यूट्रॉन-गामा मिश्रित-बीम द्वारा प्रेरित विकिरण-प्रेरित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करना है। विशेष रूप से, प्रस्तावित पद्धति मरम्मत प्रोटीन सक्रियण का पता लगाने के लिए लागू की जाती है जिसे डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएनए-डीएसबी) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके फोसी के रूप में कल्पना की जा सकती है। न्यूट्रॉन मिश्रित बीम के साथ विकिरण के बाद पेट के कैंसर कोशिकाओं (एचसीटी-११६) में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा डीएनए मरम्मत फोसी का आकलन किया गया था । डीएनए-डीएसबी सबसे जेनोटॉक्सिक घाव हैं और दो प्रमुख मार्गों द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में मरम्मत की जाती है: गैर-मुताबिक़ अंत-जुड़ने वाला मार्ग (एनएचईजे) और मुताबिक़ पुनर्संयोजन मरम्मत (एचआरआर)। γ-एच2एएक्स, 53BP1 जैसे रेडियोबायोलॉजी में आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले मार्कर के लिए फोसी, इम्यूनोकेमेमिक रूप से दाग की आवृत्तियां डीएनए-डीएसबी नंबर से जुड़ी होती हैं और डीएनए-डीएसबी के प्रेरण और मरम्मत की निगरानी के लिए कुशल और संवेदनशील मार्कर के रूप में माना जाता है । यह स्थापित किया गया था कि γ-H2AX फोसी मरम्मत प्रोटीन को आकर्षित करते हैं, जिससे डीएसबी के पास मरम्मत कारकों की उच्च एकाग्रता होती है। सेलुलर स्तर पर डीएनए क्षति की निगरानी के लिए, एनएचईजे मार्ग से डीएनए-पीकेएस प्रतिनिधि मरम्मत प्रोटीन फोसी की उपस्थिति के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण और एचआरआर मार्ग से Rad52 की योजना बनाई गई थी । हमने एनएचईजे और एचआरआर रास्तों से मरम्मत कारकों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ विकिरण-प्रेरित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटोकॉल विकसित और पेश किया है और विकिरण-प्रेरित फोसी (आरआईएफ) मनाया है। प्रस्तावित पद्धति का उपयोग मरम्मत प्रोटीन की जांच के लिए किया जा सकता है जो न्यूट्रॉन-मिश्रित बीम विकिरण के मामले में अत्यधिक सक्रिय है, जिससे मरम्मत मार्ग के प्रभुत्व का संकेत मिलता है।

Introduction

बोरोन न्यूट्रॉन कैप्चर थेरेपी (बीएनसीटी) में इस्तेमाल होने वाले न्यूट्रॉन मिश्रित-बीम द्वारा सक्रिय विकिरण-प्रेरित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया पूरी तरह से निर्धारित नहीं की गई है । यह प्रोटोकॉल न्यूट्रॉन-मिश्रित बीम के साथ विकिरण के बाद मानव पेट के कैंसर सेल लाइन में इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला जैसे द्वारा मरम्मत प्रोटीन के विकिरण-प्रेरित फोसी (आरआईएफ) का पता लगाने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रक्रिया प्रदान करता है।

आयनीकरण विकिरण (आईआर) डीएनए क्षति के विभिन्न प्रकार के एक भीड़ लाती है (डीएनए-DSBs, डीएनए-SSBs, डीएनए आधार क्षति) जिनमें से डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक सबसे जेनोटॉक्सिक डीएनए घाव1हैं । अप्राप्य ब्रेक सेल मृत्यु का कारण बन सकता है, जबकि गलत मरम्मत किए गए ब्रेक गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था, म्यूटेनेसिस और निर्णायक आनुवंशिक जानकारी के नुकसान की संभावना को बढ़ाते हैं। डीएसबी को जवाब देने वाले क्षति प्रतिक्रिया मार्गों में डीएनए मरम्मत के रास्ते जैसे गैर-समरूप अंत में शामिल होने (एनएचईजे), एक तंत्र शामिल है जिसके लिए केयू 70/80, डीएनए-पीकेसीएस, एक्सआरसी 4 और डीएनए लिगाज़ चतुर्थ को प्रमुख कारकों के,रूप में2,,3,4,5, 6शामिल हैं।,,6 स्तनधारियों में, दूसरा मुख्य डीएनए मरम्मत मार्ग समरूप पुनर्संयोजन (एचआरआर) मार्ग है जिसके लिए प्रमुख घटकों की आवश्यकता होती है - रैड52 एपिस्टेसिस जीन परिवार- रैड51, रैड52, रैड54, रैड55, रैड57 और रैड587। Rad51 और Rad54 यूकेरियोट्स में प्रतिकृति तनाव और डीएनए ब्रेक से संबंधित मरम्मत तंत्र में शामिल प्रमुख मानव पुनर्संयोजन कारक हैं। दिलचस्प बात यह है कि यह देखा गया कि एचआरआर मार्ग का डाउनरेगुलेशन एनएचईजे मार्ग को बढ़ाता है जो जीनोमस्थिरता 8के लिए एचआर पाथवे प्रासंगिकता पर त्रुटि-प्रवण है ।

डीएसबी गठन का पहला कदम सेर-139 में γ-एच2एक्स हिस्टोन का फॉस्फोरिलेशन है, जो PI3 किनेज़ परिवार7,,8से एटैक्सिया टेल्एंजेक्टिया म्यूटेटेड किनेज़ (एटीएम) द्वारा है। दिलचस्प बात यह है कि एच2एक्स फॉस्फोरिलेशन को फोसी (γ-एच2एक्स फोसी) के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक द्वारा आसानी से कल्पना की जा सकती है, जो फॉस्फोरिलेटेड एच2एक्स6के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर रही है। डीएसबी और γ-एच2एक्स फोसी की संख्या के बीच 1:1 संबंध है, इसलिए, डीएसबी मार्कर, γ-एच2एक्स, फोसी गठन, आकार और मात्रा,,6,7,8,9,10, 11के लक्षण वर्णन के माध्यम से बड़ेपैमानेपर अध्ययन कियाजाताहै।,, γ-H2AX foci के गठन की भर्ती और डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (DDR) प्रोटीन और क्रोमेटिन संशोधित कारकों, जैसे 53BP1 (p53 बाध्यकारी प्रोटीन 1), MDC1 (डीएनए क्षति चौकी के मध्यस्थ), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, और कई अंय मरम्मत कारकों के संचय की ओर जाता है इस प्रकार विकिरण प्रेरित (RIF) फार्म । ये सभी प्रोटीन प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष बाध्यकारी 1 ,11, 12,11के माध्यम से γ-एच2एक्स के साथ सह-स्थानीयकरणकरते12हैं ।

उचित संवेदनशील परीक्षण के साथ डीएनए क्षति और मरम्मत का पता लगाना महत्वपूर्ण है, इसलिए, अत्यधिक सटीक तकनीकों के विकास पर अधिक ध्यान दिया जाता है13। डीएनए क्षति और मरम्मत अध्ययन के संदर्भ में, जीनोम डीएनए क्षति का संवेदनशील पता लगाने, क्षति श्रेणी का विवरण, और डीएनए क्षति और मरम्मत तंत्र13की मात्रा के लिए कार्यप्रणाली महत्वपूर्ण है। क्षतिग्रस्त डीएनए के साथ एकल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, धूमकेतु परख का उपयोग आमतौर पर रेडियोबायोलॉजिकल अध्ययन14में किया जाता है। अन्य उपलब्ध साइटोजेनेटिक विधियां डिसेंट्रिक्स, ट्रांसलोकेशन, एसेंट्रिक टुकड़े, छल्ले, और क्रोमेटिड प्रकार के विपथन, और माइक्रोन्यूक्लिस क्रोमोसोमल क्षति (एमएन) सहित गुणसूत्र विपथनों को पहचानती हैं। रेडियोबायोलॉजी में सबसे अधिक बार उपयोग की जाने वाली विधि, विशेष रूप से जैविक डोसिमेट्री में, विकिरण15के लिए अपनी उच्च विशिष्टता के कारण डिसेंट्रिक गुणसूत्र परख है। उदाहरण के लिए, पीसीआर, एक क्लासिक आणविक विधि, पता लगाया डीएनए क्षति के प्रकार को पहचान नहीं कर सकते । इस मामले में, इम्यूनोमेट्रिक विधियां संवेदनशीलता के स्तर को पारित करती हैं क्योंकि प्रतिक्रियाएं एंटीजन और एंटीबॉडी के बीच विशिष्ट होती हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग डीएनए हानिकारक एजेंटों जैसे आयनीकरण विकिरण16के प्रत्युत्तर में विभिन्न प्रोटीनों की उपस्थिति के लिए दृश्य साक्ष्य प्रदान करता है। हालांकि, नुकसान और मरम्मत प्रोटीन के एमआरएनए स्तरों के सक्रियण स्तर वास्तविक समय पीसीआर द्वारा आसानी से पता लगाया जा सकता है जो डीएनए क्षति प्रतिक्रिया17के संदर्भ में आगे आणविक अध्ययन के लिए एक उचित मात्रात्मक तरीका है।

इस बात को ध्यान में रखतेहुएकि γ-एच2एक्स फोसी सेलुलर स्तर पर डीएनए क्षति और मरम्मत की निगरानी करने के लिए मरम्मत कारकों को आकर्षित करते हैं, हमने एनएचईजे मार्ग (डीएनए-पीकेसीएस) और एचआरआर मार्ग से Rad52 से प्रतिनिधि मरम्मत प्रोटीन फोसी के विश्लेषण के आधार पर एक विश्वसनीय इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रक्रिया विकसित की है ।

यहां, हम डीएनए-डीएसबी प्रेरण और मरम्मत की निगरानी के लिए कुशल और संवेदनशील प्रक्रिया के रूप में इन प्रोटीनों के लिए इम्यूनोडेटेक्शन के उपयोग का प्रस्ताव करते हैं । अब तक, γ-एच2एक्स और 53BP1 मार्कर19को छोड़कर, बीएनसीटी के लिए न्यूट्रॉन मिश्रित बीम विकिरण के बाद सेलुलर स्तर पर मरम्मत प्रोटीन के फोसी के आधार पर डीएनए-डीएसबी पर कोई डेटा उपलब्ध नहीं हुआ है । हम एचसीटी-116 पेट के कैंसर सेल लाइन के अनुकूलन का सुझाव देते हैं, क्योंकि यह डीएनए क्षति विश्लेषण के लिए एक मानक सेल लाइन के रूप में डीएसबी फोसी में समृद्ध है, क्योंकि आरआईएफ आसानी से पता लगाया जा सकता है। इस अनुयायी सेल लाइन को बनाए रखने के लिए आसान है और विकिरण प्रक्रियाओं के लिए उचित है। प्रस्तावित प्रक्रिया γ-एच2एक्स धुंधला की सामान्य इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रक्रिया से संबंधित पिछले अध्ययनों की एक बड़ी राशि पर आधारित है । हालांकि, इसमें प्रत्येक मरम्मत मार्ग से संबंधित प्रत्येक प्रतिनिधि प्रोटीन के लिए परीक्षण कमजोर पड़ने के साथ उचित एंटीबॉडी के चयन के बारे में सभी विवरण शामिल हैं। इसके अलावा, यह बीएनसीटी थेरेपी में उपयोग की जाने वाली एक अनूठी न्यूट्रॉन मिश्रित बीम के उपयोग का वर्णन करता है। हालांकि, हम दोनों तरीकों के साथ अध्ययन का विस्तार करने की सलाह देते हैं, इम्यूनोफ्लोरेसेंस सबसे पहले और फिर, उच्च लागत वाले आणविक विश्लेषण के साथ जैसा कि पहले4,,17प्रदर्शन किया गया था।

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Protocol

1. सेल संस्कृति और प्रायोगिक सेट-अप की तैयारी

  1. मानव पेट के कैंसर की कोशिकाओं को बनाए रखें, एचसीटी-116 आपूर्तिकर्ता द्वारा अनुशंसित, मोनोलेयर्स में 75 सेमी2 संस्कृति फ्लास्क में तैयार मैककॉय के 5ए माध्यम संशोधित के 10 एमएल युक्त, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ पूरक।
  2. हर2 से 3 दिनों में मध्यम नवीकरण के साथ 70% की नरमी तक 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत 5% सीओ 2 पर्यावरण में कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  3. भारी कणों के रूप में कैंसर कोशिकाओं को मारने और बोरोन युक्त कैंसर कोशिकाओं के भीतर अपनी ऊर्जा का अधिकांश जमा करने के लिए BNCT बीम (जैसे, न्यूट्रॉन बीम प्लस 10BPA) और BNCT प्रभाव हासिल करने के लिए, विकिरण से पहले दिन, सेल कल्चर मीडियम में बोरोन डिलिवरी एजेंट जोड़ें - उदाहरण के लिए, 10बीपीए, 4-बोरोनो-एल-फेनिलैनीन (10 माइक्रोन 10बी/एमएल, 0.925 mM फाइनल) 12-16 एच (बोरोन का अधिकतम तेज) विकिरण से पहले, जैसा कि पहले पेट की कैंसर कोशिकाओं और थायराइड कैंसर कोशिकाओं के लिए अध्ययन किया गया था20, 2,21
    नोट: यदि एक और सेल लाइन का उपयोग कर रहा है, जिसके लिए BNCT अध्ययन के मामले में कोई डेटा मौजूद नहीं है, इष्टतम बोरोन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक सेल लाइन के लिए बोरोन तेज का परीक्षण करें। डग्रोसा समूह21द्वारा किए गए 10बीपीए सेलुलर तेज को प्रेरक रूप से प्लाज्मा ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीपी-ओईएस) द्वारा मापें।
  4. बोरोन डिलीवरी के 12-16 घंटे के बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 1x पीबीएस के 10 एमएल से धोएं। फिर कोशिकाओं में ट्राइप्सिन-एडटा समाधान के 2 एमसीएल जोड़कर कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें और कोशिका टुकड़ी को बढ़ाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तक इनक्यूबेट करें। जब कोशिकाएं अलग होने लगें, तो 10 एमएल पूर्ण माध्यम जोड़कर ट्राइपसिन क्रिया को रोकें।
  5. 15 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन को एस्पिरेट करें और एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं को गिनते हैं, जिसमें 0.4% ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन नीले रंग को 10 माइक्रोन कोशिकाओं में जोड़कर, मिश्रण करें, और एक गिनती स्लाइड पर 10 माइक्रोल को एलिकोटिंग करें। कोशिका निलंबन को माध्यम की 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता में पतला करें। प्रति क्रायोट्यूब सेल सस्पेंशन का 1 एमएल अलीकोट।
  6. न्यूट्रॉन फ्लूएंसी के लिए गामा-रे खुराक और सोने की पन्नी के माप के लिए थर्मोल्यूमिनेसेंट डोसीमीटर (टीएलडी) तैयार करें और विकिरण से पहले क्रायोट्यूब या सेल कल्चर फ्लास्क में टीएलडी संलग्न करें।
  7. सुविधा क्षमताओं के आधार पर संस्कृति फ्लास्क या क्रायोट्यूब में 5.9 x 1011 (n/सेमी-2 मिनट-2 −1)4 के न्यूट्रॉन-मिश्रित बीम के साथ 1 x10 6 कोशिकाओं/एमएल को विकिरणित करें।6
    नोट: अनुशंसित न्यूट्रॉन फ्लक्स प्राप्त करने से पहले विकिरण के समय की स्थापना करें।
  8. विकिरण के बाद, 35 मिमी पेट्री व्यंजन या 6 अच्छी प्लेटों में 22 x 22 मिमी कवरलिप पर विकिरणित कोशिकाओं (1 x 106 कोशिकाओं/एमएल) के बीज 1 एमएल, आवश्यक माध्यम के 2 एमएल के साथ पूरक। एक आर्द्रीकृत 5% सीओ2 पर्यावरण में अधिकतम 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए इनक्यूबेट कोशिकाएं उन्हें कवरस्लिप से जुड़ने देती हैं। 20x उद्देश्य के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत समय-समय पर कोशिकाओं के लगाव का निरीक्षण करें।
    नोट: एचसीटी-116 कोशिकाओं के लिए न्यूनतम घनत्व बीज के लिए 600,000 कोशिकाओं है। जल्दी आगे धुंधला प्रक्रिया के लिए कक्ष स्लाइड का उपयोग करें, तदनुसार सेल घनत्व को कम करें।

2. कोशिकाओं का निर्धारण

  1. विकिरण और कोशिकाओं के इनक्यूबेशन के बाद, संलग्न कोशिकाओं से माध्यम को हटा दें और पीबीएस के 2.5 मिलील के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं।
  2. आरटी में 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के 1 मिलील के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से पहले19की सिफारिश के अनुसार निर्धारण के लिए 1%-3.7% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का उपयोग करें । यहां प्रोटोकॉल रुका हुआ है। आगे के विश्लेषण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए कुछ हफ्तों से अधिक नहीं के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर में इथेनॉल में फिक्स्ड कोशिकाओं को स्टोर करें।

3. कोशिकाओं का पारमेबिलाइजेशन

  1. फिक्सेशन के बाद पेट्री डिश से इथेनॉल निकालें और 1x पीबीएस के 2.5 एमएल से धोएं।
    नोट: कोशिकाओं को कुल्ला चरणों के बीच सूखने न दें।
  2. पेट्री व्यंजनों में कोशिकाओं के साथ कवरस्लिप को कवर करने के लिए ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस के 0.2% की 1 मिलियन की 1 मिलियन धीरे-धीरे जोड़ें।
  3. आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  4. कोशिकाओं को 1x पीबीएस के 2.5 एमएल के साथ 3x धोएं।
    नोट: जरूरत पड़ने पर पीबीएस में ट्राइटन एक्स-100 का प्रतिशत 0.5% तक बढ़ाएं (अधिक फोसी डिटेक्शन, परीक्षण सेल लाइन पर निर्भर)। अविशिष्ट बाध्यकारी से बचने के लिए पीबीएसटी (0.5% ट्वीन के साथ पीबीएस) के साथ अतिरिक्त वॉश करें।
  5. पीबीएस में पतला 2% बीएसए (गोजातीय सीरम अंश वी एल्बुमिन) के 1 एमसीएल के साथ ब्लॉक परिव्यय कदम और 1% बीएसए के साथ न्यूनतम 30 मिनट या 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: इस कदम को छोड़ा जा सकता है और इस्तेमाल किए गए एंटीबॉडी के प्रकार पर निर्भर है। वैकल्पिक रूप से, रेफरी4में अनुशंसित 5% एफबीएस का उपयोग करें।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. अनुशंसित (अनुशंसित विघ्न के साथ तालिका 1 देखें) (अनुशंसित डिलयूंस के साथ तालिका 1 देखें) (प्रति नमूना 100 माइक्रोन) के रूप में बीएसए (2% गोजातीय सीरम फ्रैशन वी एल्बुमिन) के साथ पीबीएस में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-ɣ-एच2एक्स, एंटी-डीएनए-पीसी, और एंटी-रेड52) की उचित मात्रा जोड़ें।
प्राथमिक एंटीबॉडी समारोह अनुशंसित कमजोर पड़ने भंडारण [डिग्री सेल्सियस]
एंटी-ɣ-H2AX डीएनए-डीएसबी का पता लगाना 1:1000 (पीबीएस-बीएसए) 4
एंटी-डीएनए-पीकेसीएस एनएचईजे से संबंधित डीएनए-पीकेसीएस प्रोटीन के आरआईएफ का पता लगाना 1:200 (पीबीएस-बीएसए) -20
एंटी-रैड52 एचआरआर से संबंधित Rad52 प्रोटीन के RIFs का पता लगाना 1:200 (पीबीएस-बीएसए) -20
माध्यमिक एंटीबॉडी अंधेरे में
एंटी-माउस आईजीजी फिटसी ɣ-H2AX foci 1:400 (पीबीएस-बीएसए) 4
बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी एच एंड एल (एलेक्सा फ्लोर 488) NHEJ और एचआरआर मरम्मत प्रोटीन फोसी के लिए 1:500 (पीबीएस-बीएसए) -20

तालिका 1: धारा 4 में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के उपयोग के लिए अनुशंसित कमजोर पड़ने और नोट्स।

  1. एक प्लास्टिक बॉक्स में नमी को बनाए रखने के लिए पेट्री डिश को कवर करें, जिसमें आसुत पानी का उपयोग करके मॉइस्चराइज्ड लिग्निन और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । इनक्यूबेशन रात के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया जा सकता है।
  2. इनक्यूबेशन के बाद पीबीएस के 2.5 एमएल के साथ 3 वॉश करते हैं।
    नोट: रिंसिंग चरणों के दौरान स्लाइड को सूखने की अनुमति न दें।
  3. बीएसए (तालिका1 देखें) (प्रति नमूना 100 माइक्रोन की आवश्यकता है) के साथ पीबीएस में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी (एंटी-माउस आईजीजी फिटसी, बकरी एंटी-रैबिट आईजीजी (एलेक्सा फ्लोर 488) की उचित मात्रा जोड़ें। इसके लिए और निम्नलिखित चरण अंधेरे में काम करते हैं।
  4. एक प्लास्टिक बॉक्स में नमी को नमी बनाए रखने के लिए पेट्री डिश को फिर से कवर करें, जिसमें मॉइस्चराइज्ड लिग्निन और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट किया जा सके।
  5. इनक्यूबेशन के बाद पीबीएस के 2.5 एमएल के साथ 3 वॉश करते हैं।
  6. नाभिक का मुकाबला करने के लिए 1 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में पतला DAPI के 100 μL जोड़ें।
  7. शीघ्र ही इनक्यूबेट, आरटी में अधिकतम 2 मिनट के लिए।
  8. इनक्यूबेशन के बाद पीबीएस के 2.5 एमएल के साथ 3 वॉश करते हैं।
  9. पीबीएस निकालें और धीरे-धीरे बढ़ते माध्यम के शीर्ष पर एक कवरस्लिप डाल दें, हवा के बुलबुले और नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के सील किनारों के गठन से बचें। जब तक वार्निश सूख जाएगा और चारों ओर कवरस्लिप पेंट करें तब तक प्रतीक्षा करें।
  10. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत छवि विश्लेषण से पहले बढ़ते माध्यम (3 घंटे तक) के सख्त होने की प्रतीक्षा करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक बॉक्स में ग्लास स्लाइड स्टोर करें।

5. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. विसर्जन तेल के साथ 100x उद्देश्य के तहत फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ छवियों को प्राप्त करें।
    1. न्यूक्लियी में फोसी का विश्लेषण करें एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ निम्नलिखित फिल्टर से लैस: एलेक्सा फ्लोर 488: उत्तेजन/उत्सर्जन (एनएम): 496/519, उत्सर्जन रंग हरा; DAPI: उत्तेजन/उत्सर्जन (एनएम): 358/461, उत्सर्जन रंग नीला।
      नोट: एकल कण पटरियों के साथ डीएसबी के विश्लेषण के लिए उच्च संकल्प के साथ कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी जैसे उन्नत माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता हो सकती है।
  2. उपयुक्त इमेजिंग सॉफ्टवेयर जैसे, इमेजजे या इमेज प्रो,3,20के साथ अधिग्रहीत छवियों और प्रक्रिया को सहेजें।
    नोट: व्यक्तिगत बायोइंफॉर्मेटिक सॉफ्टवेयर के स्वत विश्लेषण या विकास/खरीद के लिए विकसित व्यक्तिगत मैक्रो और प्लगइन्स के उपयोग की सिफारिश की जाती है ।
  3. यदि फोसी विश्लेषण के लिए इमेज-प्रो सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हैं, तो टिफ फ़ाइलों में छवियों को संसाधित करें: काउंट/साइज बटन का चयन करें, फिर प्रकारों पर क्लिक करें [जैसे, व्यास या क्षेत्र) का चयन करें], रेंज [माप की सेट रेंज] पर क्लिक करें, यदि आवश्यक हो तो स्प्लिट ऑब्जेक्ट्सपर क्लिक करें। चमक को समायोजित करने के लिए, क्लिक करें ब्राइट [समायोजित ट्रेहोल्ड]। इसके बाद काउंट [रेड बटन] पर क्लिक करें।
  4. डेटा निर्यात करने के लिए, डेटा टेबल पर क्लिक करें । आंकड़े । एक्सेल को निर्यात करें। स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में, आवश्यक सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ रेखांकन आकर्षित करें।

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Representative Results

सबसे पहले, हम डीएनए-DSBs, पेट के कैंसर की कोशिकाओं में γH2AX फोसी, गैर विकिरण, और न्यूट्रॉन मिश्रित बीम के साथ विकिरणित का पता लगाने के एक मानक मार्कर का विश्लेषण किया । γ-H2AX foci अलग फ्लोरोसेंट डॉट्स के रूप में दिखाई देते हैं और डीएनए-डीएसबी के गठन को दिखाते हैं (जैसा कि प्रत्येक γ-एच2एक्स फ्लोरोसेंट डॉट एक डीएसबी का प्रतिनिधित्व करता है) (चित्र 1देखें)।

Figure 1
चित्रा 1: सेल लाइन एचसीटी-116 (विकिरण के बिना) और न्यूट्रॉन मिश्रित बीम विकिरण के बाद पेट के कैंसर कोशिकाओं में γ-H2AX फोसी के पैटर्न की प्रतिनिधि छवियां। न्यूट्रॉन मिश्रित बीम विकिरण बीपीए (एन + बीपीए) के साथ एक दिन पहले इलाज कोशिकाओं में २.६ Gy की खुराक पर किया गया था । (क)बायां पैनल नाभिक के दापी-धुंधला का प्रतिनिधित्व करता है । सही पैनल, ग्रीन फोसी (एलेक्सा 488), γ-एच2एक्स के इम्यूनोडेटेक्शन से मेल खाती है। पीला तीर नाभिक को पार करने वाले α-कण के ट्रैक को इंगित करता है (स्केल बार = 10 माइक्रोन)। (ख)रेडियो प्रेरित फोसी के आकार में देखी गई वृद्धि को दर्शाते हुए प्रतिनिधि आरेख । γ-H2AX फोसी व्यास का मतलब छवि-प्रो सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

दिलचस्प बात यह है कि लगभग 2.6 जीवाई (1,33 जीवाई (γ) + 1,26 जीवाई (एन)) की खुराक पर न्यूट्रॉन-मिश्रित बीम (एन + बीपीए) के साथ विकिरणित कोशिकाओं में, हमने γ-एच2एक्स फोसी(चित्रा 1 बी)के उच्च व्यास स्तर को देखा। इसके अलावा, उच्च LET α-कण का एक ट्रैक (BNCT परमाणु प्रतिक्रिया के कारण) कोशिका (पीला तीर)(चित्रा 1A)के नाभिक को पार करने का पता चला था। विभिन्न प्रकार के विकिरण विभिन्न प्रभावों का कारण बन सकते हैं: उच्च चलो विकिरण, अधिक जटिल डीएनए-डीएसबी, γ-एच2एक्स फोसी और विकिरण-प्रेरित फोसी18के रूप में दिखाई देने वाले प्रोटीन के उच्च क्षेत्र स्तर।

इसलिए, हमने डीएनए-पीकेएस (एनएचईजे मरम्मत मार्ग से) और रेड52 (एचआर पाथवे से) के प्रतिनिधि मरम्मत प्रोटीन के स्तर का परीक्षण एक ही परिस्थितियों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया था, जो बीएनसीटी बीम के मामले में पहले नहीं किया गया था। हम नियंत्रण कोशिकाओं (कोई विकिरण) (चित्रा 2देखें) की तुलना में एक न्यूट्रॉन मिश्रित के बाद डीएनए ब्रेक पर डीएनए-पीकेसीएस के फोसी व्यास के उच्च औसत मूल्य का पता लगाने में सक्षम थे ।

Figure 2
चित्रा 2: कोशिका रेखा एचसीटी-116 (विकिरण के बिना) और न्यूट्रॉन-मिश्रित बीम विकिरण के बाद पेट के कैंसर कोशिकाओं में डीएनए-पीकेसीएस और Rad52 मरम्मत फोसी के पैटर्न की प्रतिनिधि छवियां। न्यूट्रॉन मिश्रित बीम विकिरण बीपीए (एन + बीपीए) के साथ एक दिन पहले इलाज कोशिकाओं में २.६ Gy की खुराक पर किया गया था । (क)बायां पैनल नाभिक के दापी-धुंधला का प्रतिनिधित्व करता है । मध्य पैनल विकिरण-प्रेरित फोसी का पता लगाने का प्रतिनिधित्व करता है। सही पैनल विलय छवि है। (ख)रेडियो प्रेरित फोसी के आकार में देखी गई वृद्धि को दर्शाते हुए प्रतिनिधि आरेख । Rad52 और डीएनए-PKcs foci व्यास का मतलब स्वचालित रूप से छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इस मामले में, हमने न्यूट्रॉन-मिश्रित बीम द्वारा विकिरणित एचसीटी-116 कोशिकाओं में संकुल डीएनए-डीएसबी का अवलोकन किया है क्योंकि डीएनए-पीकेसीएस अधिक जटिल फोसी के लिए विशिष्ट है। किरणित कोशिकाओं में, न्यूट्रॉन-मिश्रित बीम द्वारा, इन फोसी को केवल कोशिका नाभिक के भीतर अधिक जटिल, बड़ा और उच्च तीव्रता(चित्रा 2ए, बी)के साथ संकुल के रूप में देखा गया था। Rad52 के मामले में, प्रभाव डीएनए-पीकेसीएस के लिए उतना मजबूत नहीं था जो इस प्रकार के विकिरण में एनएचईजे मार्ग के प्रभुत्व को इंगित करता है। इसके अलावा, साहित्य के आंकड़ों के आधार पर, जटिल डीएसबी की धीरे-धीरे मरम्मत की जाती है और डीएनए-पीकेसीएस को केवल लंबे समय तक रहने वाले जटिल डीएसबी में भर्ती किया जाता है जो इंगित करता है कि न्यूट्रॉन मिश्रित बीम जटिल डीएसबी के गठन और डीएनए-पीकेसीएस के माध्यम से मरम्मत की ओर जाता है, हालांकि, इन पहले प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने के लिए आणविक स्तर पर अधिक शोध की आवश्यकता है22।

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Discussion

γ-एच2एएक्स और 53बीपी1 के लिए फोसी, इम्यूनोकेमेमिक रूप से दाग की आवृत्तियां आमतौर पर रेडियोबायोलॉजी में उपयोग की जाती हैं और डीएनए-डीएसबी संख्या से जुड़ी होती हैं और डीएनए-डीएसबी19के प्रेरण और मरम्मत की निगरानी के लिए कुशल और संवेदनशील मार्कर के रूप में माना जाता है। γ-एच2एक्स और 53BP1 की सह-धुंधला प्रक्रिया डीएनए-डीएसबी का पता लगाने के लिए एक मानक प्रक्रिया है । γ-H2AX foci का गठन 53BP1 की भर्ती से जुड़ा हुआ है, जो डीएनए क्षति प्रतिक्रिया23का एक नियामक है । हालांकि, विभिन्न सेल लाइनें γ-H2AX/53BP1 foci 11के पृष्ठभूमि स्तर में भिन्न हो सकतीहैं । यह दिखाया गया है कि γ-H2AX foci मरम्मत कारकों को आकर्षित18,एक डीएसबी साइट के करीब मरम्मत प्रोटीन की एक उच्च एकाग्रता जमते । अधिक जटिल डीएनए-DSBs, अधिक से अधिक γ-H2AX foci और उच्च मरम्मत प्रोटीन के स्तर । यह मरम्मत के रास्तों के झरने को सक्रिय करता है, यदि डीएसबी साइट में उच्च एकाग्रता में मरम्मत कारक जमा होते हैं, तो वे विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके आसानी से पता लगाया जा सकता है और प्रस्तावित प्रोटोकॉल उन्हें आसानी से कल्पना करने की अनुमति देता है। यहां हम बीएनसीटी थेरेपी के लिए सेलुलर स्तर पर जैविक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक पद्धति प्रदर्शित करते हैं, जो मानव पेट के कैंसर कोशिकाओं में इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक का उपयोग करके डीएनए मरम्मत पर न्यूट्रॉन-मिश्रित बीम का प्रभाव है। लेखकों ने एनएचईजे और एचआरआर मार्ग से मरम्मत कारकों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के आधार पर डीएनए मरम्मत मार्गों का पता लगाने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ कदम-दर-कदम विश्वसनीय प्रोटोकॉल विकसित और पेश किया और विकिरण-प्रेरित फोसी (आरआईएफ) मनाया। इसके अलावा, लेखकों डीएनए क्षति विश्लेषण के लिए एक मानक सेल लाइन के रूप में HCT-११६ पेट कैंसर सेल लाइन के उपयोग का प्रस्ताव है और डीएनए की मरंमत एंटीबॉडी के परीक्षण के लिए एक नियंत्रण सेल लाइन के रूप में क्योंकि इस सेल लाइन ही DSBs foci में अमीर है । डीएनए-डीएसबी आसानी से पता लगाने योग्य हैं, और विभिन्न सेल लाइनें, विशेष रूप से ग्रीवा सेल लाइन जैसी कैंसर कोशिकाएं एच2एक्स फोसी के विभिन्न पृष्ठभूमि स्तरों और तीव्रता24का प्रतिनिधित्व करती हैं।

प्रोटोकॉल में दो प्रमुख महत्वपूर्ण कदम हैं, कोशिकाओं का निर्धारण, और इम्यूनोदाता प्रक्रिया। लेखक 70% इथेनॉल में कोशिकाओं के निर्धारण की सलाह देते हैं क्योंकि यह लंबे समय तक कोशिकाओं को संरक्षित करता है, और इसे फ्रीजर में कुछ हफ्तों से अधिक नहीं संरक्षित किया जाता है। इसके अलावा, यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि विकिरण प्रक्रिया के बाद यह ठहराव बिंदु हो सकता है, उदाहरण के लिए, किसी अन्य संस्थान/भवन/एक अन्य दिन में । एक और महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी की उचित एकाग्रता है। लेखकों ने तालिका में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की परीक्षण सांद्रता को संलग्न किया है।

प्रस्तुत प्रक्रिया विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करती है, हालांकि, कुछ पैरामीटर प्रयोगों के परिणामों को बदल सकते हैं, जैसे कि इस्तेमाल किए गए एंटीबॉडी का उचित विकल्प, निर्धारण और पारमेपन चरणों के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न अभिकर्मक, अभिकर्मकों का समय, अभिकर्मक का महत्वपूर्ण प्रतिशत, धोने के कदम, अंधेरे में काम करना, और उचित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप। लेखकों की व्याख्या कैसे नोटों में विश्वसनीय और दोहराने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए ।

इस तकनीक की एक मामूली सीमा न्यूट्रॉन स्रोत जैसे विकिरण के स्रोत तक पहुंच है, हालांकि, प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रकार के विकिरण के बाद प्राप्त डीएनए मरम्मत मार्गों का पता लगाने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल के रूप में किया जा सकता है और विभिन्न प्रकार के विकिरण के लिए सार्वभौमिक प्रोटोकॉल के रूप में माना जा सकता है जैसे, कम-एलईए और उच्च-एलईएफ विकिरण मरम्मत मार्गों की सक्रियता की तुलना करें।

हम एक सार्वभौमिक, तैयार करने के लिए उपयोग पद्धति है कि सेलुलर स्तर पर इस्तेमाल किया जा सकता है BNCT चिकित्सा के संदर्भ में जैविक प्रभाव का विश्लेषण प्रदान करते हैं । बीएनसीटी में, गैर-रेडियोधर्मी बोरोन-10 (उदाहरण के लिए, 4-बोरोनो-एल-फेनिलैनिन, बीपीए - बोरोन डिलीवरी एजेंट के साथ उपचार के बाद) कम ऊर्जा थर्मल न्यूट्रॉन के साथ विकिरणित होता है और परमाणु प्रतिक्रिया अल्फा कणों और उच्च एलईटी के साथ लिथियम-7 नाभिक का उत्पादन होता है25,,26। इसलिए, हमारा प्रोटोकॉल सेलुलर स्तर पर जैविक प्रभावों के विश्लेषण के लिए भी उपयोगी हो सकता है, जो प्रोटोन बीम थेरेपी27में उपयोग किए जाने वाले प्रोटॉन जैसे अन्य उच्च एलईओ बीम द्वारा प्रतिनिधित्व किए गए विकिरण के लिए भी उपयोगी हो सकता है, और हैड्रॉन थेरेपी28में उपयोग किए जाने वाले कार्बन आयनों के लिए। हमने देखा है कि उच्च-एलई एलई विकिरण और मिश्रित बीम के क्षेत्र में अधिक विस्तृत अनुसंधान की आवश्यकता है, और प्रभावी कैंसर रोधी उपचार विकसित करने के लिए डीएनए मरम्मत प्रक्रिया का ज्ञान आवश्यक है, इसलिए, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो न्यूट्रॉन-मिश्रित बीम द्वारा सक्रिय विकिरण-प्रेरित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया पर शोध करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया और डीएनए की मरम्मत का पता लगाने की इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधि ट्यूमर का आकलन और पता लगाने के लिए एक संभावित तरीका हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

न्यूट्रॉन/गामा विकिरण से बना न्यूट्रॉन मिश्रित बीम पोलैंड में नेशनल सेंटर फॉर न्यूक्लियर रिसर्च में मारिया रिसर्च रिएक्टर से पहुंचा गया था । K.M.O. राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र, पोलैंड (Miniatura 2) अनुदान संख्या #2018/02/X/NZ5/02849 द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm Coverslips VWR 89015-725
35 mm Petri dishes Sarstedt 7.183.390.000
4-Borono-L-phenylalanine SIGMA-ALDRICH 17755
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062
Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad Abcam AB18192
Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat SIGMA-ALDRICH F0257
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 MerckMillipore 05-636
Anti-RAD52 antibody Abcam AB117097
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) Roche BSAV-RO
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) ThermoFisher SCIENTIFIC D1306
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) SIGMA-ALDRICH F9665
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam AB150077
HCT-116 cell line ATCC CCL-247™
ImageJ National Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
Image Pro Media cybernetics http://www.mediacy.com/imagepro
LUNA II Automated Cell Counter Logos Biosystems L40002
McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) SIGMA-ALDRICH M9309
microscope slides ThermoFisher SCIENTIFIC B-1198
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS 20.59.52.0
Triton X-100 SIGMA-ALDRICH X100
Trypan Blue Stain, 0.4% Logos Biosystems T13001
Trypsin-EDTA solution 0.25% SIGMA-ALDRICH T4049

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १६० BNCT डीएनए-DSBs विकिरण प्रेरित foci डीएनए क्षति मरम्मत के रास्ते मिश्रित बीम
मानव पेट के कैंसर कोशिकाओं में डीएनए क्षति और मरम्मत Foci के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग
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Maliszewska-Olejniczak, K., Dróżdż, A., Waluś, M., Dorosz, M., Gryziński, M. A. Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells. J. Vis. Exp. (160), e61399, doi:10.3791/61399 (2020).

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