Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

Resumo

Este protocolo apresenta um método para medir a ligação de adenina nucleotídica a receptores em tempo real em ambiente celular. A ligação é medida como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre derivados de nucleotídeos trinitrofenila e proteínas marcadas com um aminoácido fluorescente não canônico.

Resumo

Desenvolvemos um método para medir a ligação de nucleotídeos de adenina a receptores transmembrana intactos e funcionais em um ambiente celular ou de membrana. Este método combina a expressão de proteínas marcadas com o aminoácido fluorescente não canônico ANAP, e FRET entre ANAP e derivados nucleotídicos fluorescentes (trinitrofenil). Apresentamos exemplos de ligação de nucleotídeos a canais iônicos K_ATP marcados com ANAP, medidos em membranas plasmáticas sem teto e remendos de membrana excisados de dentro para fora sob pinça de tensão. Este último permite medições simultâneas da ligação do ligante e da corrente do canal, uma leitura direta da função da proteína. O tratamento e a análise dos dados são discutidos extensivamente, juntamente com possíveis armadilhas e artefatos. Este método fornece informações mecanicistas ricas sobre o gating ligante-dependente de canais de_{K ATP} e pode ser facilmente adaptado ao estudo de outras proteínas nucleotídeos-reguladas ou qualquer receptor para o qual um ligante fluorescente adequado pode ser identificado.

Introdução

Várias classes importantes de proteínas são diretamente reguladas pela ligação do ligante. Estes variam de enzimas solúveis a proteínas embutidas na membrana, incluindo receptores tirosina quinases, receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e canais iônicos. Os GPCRs e canais respondem por ~34% e ~15% de todos os alvos atuais de drogas, respectivamente ^1,2. Portanto, há um considerável interesse bioquímico, bem como médico no desenvolvimento de métodos que forneçam insights mecanísticos sobre as interações ligante-receptor. Métodos tradicionais para medir a ligação de ligantes, incluindo estudos de marcação por fotoafinidade e ligação a radioligantes, requerem grandes quantidades de proteína parcialmente purificada e são tipicamente realizados sob condições não fisiológicas e escalas de tempo. Um método ideal exigiria apenas pequenas quantidades de proteína, poderia ser realizado em proteínas intactas expressas em um ambiente celular ou de membrana, poderia ser monitorado em tempo real e seria compatível com leituras diretas da função proteica.

A transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) é um método que detecta a proximidade entre duas moléculas marcadas fluorescentemente³. O FRET ocorre quando um fluoróforo de doador excitado transfere energia de forma não radiativa para uma molécula receptora (normalmente outro fluoróforo). A transferência de energia resulta na supressão da emissão de fluorescência do doador e sensibilização da emissão do receptor (se o receptor for um fluoróforo). A eficiência da transferência depende da^6ª potência da distância entre o doador e o receptor. Além disso, o doador e o receptor devem estar próximos (geralmente menos de 10 nm) para que o FRET ocorra. Como tal, o FRET pode ser explorado para medir a ligação direta entre um receptor de proteína fluorescentemente marcado e um ligante fluorescente.

Várias proteínas diferentes são reguladas ou ativadas pela ligação de nucleotídeos de adenina intracelulares ou extracelulares (ATP, ADP, AMP, cAMP). Muitas proteínas transportadoras requerem hidrólise de ATP para seu ciclo de reação, incluindo transportadores de de ligação a ATP e ATPases do tipo P, como a bomba Na+/K^{+ 4,5}. Os canais de K⁺ sensíveis ao ATP (K_ATP), o regulador de condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR) e os canais regulados por nucleotídeos cíclicos são canais iônicos que são limitados pela ligação de nucleotídeos de adenina intracelular, tornando-os extremamente sensíveis a mudanças no metabolismo celular e transdução de sinal ^6,7,8. Os receptores P2X e P2Y purinérgicos respondem a alterações no ATP extracelular, que pode ser liberado como neurotransmissor ou como resultado de dano tecidual⁹. Desenvolvemos um ensaio baseado em FRET para a medição da ligação de adenina nucleotídica a proteínas de membrana em tempo real. Aplicamos previamente este método para estudar a ligação de nucleotídeos a canais_{de K ATP} ^10,11.

Para medir a ligação de nucleotídeos via FRET, uma proteína de interesse deve primeiro ser marcada com um fluoróforo. A etiqueta fluorescente deve ser inserida especificamente na proteína de interesse, de modo que esteja perto o suficiente do local de ligação do ligante para que o FRET ocorra, com especial cuidado para garantir que a etiqueta não afete a estrutura e a função gerais da proteína. Para isso, empregamos uma técnica desenvolvida por Chatterjee et al., usando supressão de stop-codon âmbar para inserir um aminoácido fluorescente não canônico (l-3-(6-acetilnaftaleno-2-ilamino)-2-aminopropiônico; ANAP) no local desejado¹². Medimos a ligação de nucleotídeos como FRET entre a proteína marcada com ANAP e derivados nucleotídicos trinitrofenil (TNP) fluorescentes (Figura 1A). O espectro de emissão da ANAP sobrepõe-se ao espectro de absorbância dos nucleotídeos de TNP, condição necessária para que ocorra o FRET (Figura 1B). Aqui descrevemos dois tipos diferentes de experimento de ligação. No primeiro, a ligação de nucleotídeos ao lado intracelular dos canais de_{K ATP} marcados com ANAP é medida em células que foram destelhadas por sonicação, deixando fragmentos aderidos da membrana plasmática sobre uma lamínula de cobertura de vidro^10,11,13,14.

No segundo método, a ligação de nucleotídeos a canais K_ATP marcados com ANAP é medida em um patch de membrana sob pinça de tensão, permitindo a medição simultânea de correntes iônicas e fluorescência. Combinando essas duas abordagens experimentais, mudanças na ligação podem ser diretamente correlacionadas com mudanças na função do canal¹¹. Resultados típicos, armadilhas potenciais e análise de dados são discutidos.

Protocolo

1. Preparação das lamínulas

NOTA: Essas etapas devem ocorrer em uma capa estéril de cultura de tecidos. As quantidades são dadas para a preparação de 10 pratos.

1. Coloque dez lâminas de vidro de borossilicato autoclavadas de 30 mm individualmente em dez placas estéreis de 35 mm não tratadas e enxágue uma vez com 2 mL de água destilada estéril.
2. Diluir 1 mL de solução de poli-L-lisina a 0,1% p/v em água destilada estéril até um volume total de 10 mL (concentração final de 0,01% p/v). Misture bem, em seguida, pipetar 1 mL em cada tampa e incubar à temperatura ambiente por 20 min.
3. Aspirar a poli-L-lisina e lavar duas vezes cada lamínula com pelo menos 2 mL de água destilada estéril. Deixe até secar completamente, ou seja, pelo menos 3 h.

2. Semeadura de células HEK-293T

NOTA: Essas etapas devem ocorrer em uma capa de cultura de tecidos. As células HEK-293T foram escolhidas por seu baixo background atual e facilidade de crescimento em cultura. Este protocolo pode ser adaptado a outros tipos celulares.

1. Enxaguar um frasco T75 confluente 80-90% de células HEK-293T uma vez com 12 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes de incubar com 2 mL de tripsina por 2-5 min, ou até que as células estejam totalmente destacadas e quase completamente dissociadas.
2. Ressuspender as células adicionando 10 mL de meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Pipetar suavemente contra o fundo do balão para quebrar os aglomerados de células restantes.
3. Adicionar 2 mL de DMEM suplementado ao número desejado de placas de 35 mm contendo lamínulas revestidas. Adicionar 100 μL de células ressuspensas a cada prato. Incubar durante a noite a 37 °C.

3. Transfecção

NOTA: Essas etapas devem ocorrer em uma capa de cultura de tecidos. São dadas quantidades para a transfecção de 10 pratos. Para a incorporação ANAP sítio-específica, o códon de DNA na posição destinada à marcação deve ser substituído pelo códon de parada âmbar (TAG). Este construto é co-transfectado com dois plasmídeos: pANAP e peRF1-E55D^12,15. A pANAP codifica várias cópias de um par de tRNA/tRNA sintetase específico da ANAP. Na presença de ANAP, a transfecção desse plasmídeo produz RNAt carregado com ANAP que reconhece o códon âmbar. peRF1-E55D codifica um fator de liberação ribossomal negativo dominante que aumenta o rendimento da proteína marcada com ANAP de comprimento total.

1. Preparar um tubo de 1,5 mL com 10 μg de pANAP, 10 μg de peRF1-E55D e DNA para a construção destinada à marcação com ANAP. Levar a um volume final de 500 μL com DMEM não suplementado.
2. Num tubo separado, preparar 3 μL de reagente de transfecção à base de lípidos (ver Tabela de Materiais) para cada 1 μg de ADN e levar a um volume final de 500 μL com DMEM não suplementado.
3. Combinar as misturas de DNA e reagentes de transfecção em um único tubo e incubar por 20 min à temperatura ambiente.
4. Adicionar 400 μL do estoque de 1 mM ANAP (sal de trifluoroacetato em NaOH 30 mM) a 20 mL de DMEM suplementado para uma concentração final de 20 μM ANAP. Substitua a mídia antiga das células chapeadas por 2 mL da mídia contendo ANAP por prato.
5. Pipetar 10% da mistura de transfecção de DNA em cada prato. Incubar a 33 °C durante 2-4 dias antes das experiências. A incubação a 33 °C retarda a divisão celular e aumenta o rendimento de proteína por célula¹⁶.

4. Experimentos com membranas sem telhado

1. Use um par de pinças para quebrar uma tampa com células transfectadas em fragmentos menores.
2. Siga um dos procedimentos abaixo para destedilhar as células.
   1. Se estiver usando lamínulas pré-revestidas, enxágue um fragmento com PBS e, em seguida, coloque-o no fundo de uma placa de 35 mm contendo 2 mL de PBS. Sonicar brevemente usando um sonicador de sonda (50 W, 20%-40% de amplitude, sonda de 3 mm) posicionado 3-5 mm acima da amostra para destelhar as células e deixar para trás fragmentos aderentes da membrana plasmática (Figura 2A,C).
      NOTA: A potência, a duração e a altura da sonda do sonicador acima da amostra podem ser variadas para obter um alto rendimento de membranas destelhadas sem desnudar completamente a lamínula.
   2. Se não estiver usando lamínulas de cobertura pré-revestidas, enxágue um fragmento de lamínula de cobertura com PBS e, em seguida, mergulhe em um tubo contendo 0,1% p/v de poli-L-lisina por ~30 s antes de sonicar brevemente (como na etapa 4.2.1) para destelhar as células e deixar para trás fragmentos de membrana plasmática destelhados/parcialmente destelhados (Figura 2A,C,D). Demonstrou-se que exposições breves à poli-L-lisina melhoram a aderência à lamínula¹³.
3. Coloque o fragmento sonicado em uma placa de 35 mm com fundo de vidro contendo 2 mL de solução de banho e monte em um microscópio invertido equipado com uma objetiva de imersão em água de 60x NA. A porta da câmera do microscópio é conectada a um espectrógrafo em série com uma câmera CCD de alta sensibilidade. Perfundir a câmara de banho (0,5 – 1 mL/min) com tampão utilizando bomba peristáltica. A composição do tampão irá variar dependendo da proteína em estudo.
   NOTA: Se o usuário não tiver acesso a um objetivo com uma longa distância de trabalho, pode ser impossível focar nos fragmentos de membrana destelhados devido à altura extra do deslizamento da tampa. Uma alternativa é semear células diretamente em pratos com fundos de vidro de poli-L-lisina (veja Tabela de Materiais para um exemplo). Isso também reduzirá possíveis aberrações na imagem associadas ao foco através de dois pedaços de vidro. Essas aberrações não afetam a forma dos espectros adquiridos.
4. Identificar fragmentos de membrana sem telhado expressando o canal marcado com ANAP procurando fluorescência do canal (Figura 2C,D).
   NOTA: Recomenda-se o uso de uma etiqueta fluorescente adicional (onde o espectro de emissão é distinguível do espectro de emissão ANAP) para ajudar a identificar membranas sem telhado contendo a proteína de interesse. Os experimentos na Figura 2C,D foram realizados em canais marcados com ANAP com etiquetas de proteína fluorescente C-terminal.
5. Acople parcialmente a máscara do espectrômetro (aumente ~10%) entre a porta da câmera no microscópio e o espectrógrafo. A sombra da máscara aparecerá na imagem da câmera. Alinhe a membrana sem teto com a máscara do espectrômetro, ajustando o estágio do microscópio. Adquira uma imagem de campo brilhante e fluorescência da membrana sem telhado. Estes serão usados para selecionar uma região de interesse para análise.
6. Aproximar a ponta do sistema de perfusão de microvolume da membrana destelhada.
   NOTA: Para reduzir a fluorescência de fundo, a saída do sistema de perfusão foi substituída por uma ponta personalizada feita de vidro borossilicato.
7. Para obter imagens dos espectros de fluorescência, excite a membrana com um LED de 385 nm através de um filtro de excitação passa-banda de 390/18 nm e um dicroico de borda de 416 nm. Coletar a luz emitida através de um filtro de emissão passa-longa de 400 nm (Figura 2B).
8. Acione a máscara do espectrômetro e certifique-se de que a luz emitida seja passada. Acione as grades do espectrômetro (300 ranhuras/mm). Com as grades instaladas, a luz difratada pelo espectrômetro será projetada no chip da câmera CCD para produzir imagens espectrais (Figura 3A). Essas imagens retêm informações espaciais na dimensão y . A dimensão x é substituída pelo comprimento de onda.
9. Opcionalmente, se a proteína de interesse for marcada com uma proteína fluorescente, adquira uma imagem espectral da proteína fluorescente usando o conjunto de filtros apropriado.
10. Tome uma ou mais exposições de 0,1-10 s no início do experimento enquanto perfunde a solução tampão livre de nucleotídeo. Estes serão utilizados para corrigir e normalizar os dados ao longo do resto da experiência (ver secção 5 abaixo).
    NOTA: A escolha do tempo de exposição dependerá do nível de expressão alcançado, do brilho do fluoróforo e da ótica. O tempo de exposição deve ser escolhido para maximizar o sinal e minimizar a taxa de clareamento observada. O intervalo de tempo de exposição indicado no ponto 4.10 é adequado para medições de ligação ao equilíbrio, mas pode ser útil para medir alterações cinéticas mais lentas¹⁰. A capacidade de usar tempos de exposição curtos para rastrear cinética mais rápida será limitada pelos níveis de expressão de proteínas e fotoclareamento, em vez de hardware.
11. Aplicar uma faixa de concentrações de TNP-ATP (geralmente preparado em solução de banho) para estabelecer uma curva de concentração-resposta. Perfundir cada solução durante pelo menos 1 min para garantir que seja atingido um estado estacionário e lavar cada concentração com solução de banho durante, pelo menos, 1 min.
    NOTA: É importante garantir que o sistema de perfusão possa atingir rapidamente o equilíbrio (Figura 2E) e atingir a concentração local correta de TNP-ATP (Figura 2F).
12. Tomar uma exposição (com a mesma duração utilizada na etapa 4.10) em cada concentração e no final de cada washout.

5. Análise espectral

NOTA: Estas instruções são escritas para uso com o código de análise "pcf.m", que pode ser encontrado no GitHub. https://github.com/mpuljung/spectra-analysis¹⁰. Código adicional e alternativo pode ser encontrado em https://github.com/smusher/KATP_paper_2019¹¹. Descrevemos aqui as operações realizadas pelo software para que o usuário possa criar seu próprio código ou optar por analisar os dados manualmente.

1. Inicie o programa de análise digitando o nome do programa ("pcf") na linha de comando.
2. Quando uma caixa de diálogo de arquivo/pasta aberta for aberta com o prompt: "Selecionar arquivos para ROI", selecione os nomes de arquivo associados às imagens de campo brilhante e fluorescência da membrana destelhada. Um prompt aparecerá na linha de comando para digitar o nome do arquivo de saída.
3. Digite o nome do arquivo e pressione enter.
4. Quando o software exibir as imagens de campo brilhante e fluorescência, selecione uma região de interesse (ROI) na imagem espectral correspondente à localização do fragmento de membrana sem telhado ou do patch excisado (ver secção 6) seguindo as instruções do software. Selecione uma região de fundo na mesma imagem espectral (representando a mesma faixa de comprimento de onda da ROI) correspondente a uma seção de deslizamento de cobertura ou placa sem membrana conectada (Figura 3A). O software solicitará que você clique na parte superior do ROI e pressione Enter, clique na parte inferior do ROI e pressione Enter e, em seguida, repita esse processo para a região de fundo.
5. Quando uma caixa de diálogo de arquivo/pasta aberta for aberta com o prompt: "Selecionar arquivo para o espectro FP", selecione o nome do arquivo associado ao espectro de proteína fluorescente (FP) (etapa opcional 4.9). Se nenhum espectro FP foi adquirido, selecione um arquivo de espectro diferente. O espectro FP serve como controle de qualidade para distinguir entre proteína marcada e fluorescência de fundo.
6. Quando uma caixa de diálogo de arquivo/pasta aberta for aberta com o prompt: "Selecionar arquivos para análise", selecione todos os arquivos correspondentes aos espectros ANAP (das etapas 4.10 a 4.12), incluindo os arquivos necessários para a correção da água sanitária.
7. Quando uma caixa de diálogo de arquivo/pasta aberta for aberta com o prompt: "Selecionar arquivos para coleta de branqueamento", selecione o subconjunto de arquivos da etapa 5.6 correspondente aos espectros iniciais adquiridos em solução livre de nucleotídeos no início do experimento ou espectros adquiridos durante as lavagens em solução livre de nucleotídeo a serem usados para correção (das etapas 4.10 a 4.12).
8. Média de linha de cada imagem para produzir espectros, ou seja, média da intensidade de todos os pixels na dimensão y de uma ROI ou região de fundo em cada comprimento de onda. (Figura 3B). Subtraia o espectro de fundo médio resultante do espectro médio adquirido da ROI para remover a fluorescência e a fluorescência de fundo do TNP-ATP não ligado (Figura 3C). Essas etapas são executadas automaticamente pelo software.
9. Determine a intensidade da ANAP para cada exposição calculando a média da intensidade de uma janela de 5 nm centrada em torno do pico ANAP dos espectros subtraídos (tipicamente ~470 nm, mas pode variar dependendo do microambiente local do resíduo ANAP).
   NOTA: A Figura 3D mostra 6 espectros obtidos a partir de exposições consecutivas de 10 s de um fragmento de membrana sem telhado expressando canais marcados com ANAP. O inset mostra a intensidade média do pico de cada espectro. O software irá encontrar automaticamente o comprimento de onda de pico no primeiro espectro adquirido e usar esse valor em todo o espectro. A intensidade será calculada automaticamente pelo software.
10. Normalizar as intensidades de PANA para cada experimento dividindo a intensidade de ANAP de uma dada exposição (F) pela intensidade de ANAP da primeira exposição da série temporal, que foi tomada na etapa 4.10 (F_max). Novamente, o software executa esses cálculos automaticamente.
11. Execute as etapas abaixo para obter dados.
    1. Para corrigir o fotoclareamento ANAP, primeiro ajuste um único decaimento exponencial, (F/F_max) = A*exp(-t/τ)+(1-A), onde t é o tempo de exposição cumulativo, τ é a constante de tempo e A é a amplitude) para as etapas intermediárias de lavagem entre as aplicações de TNP-ATP ou para múltiplas exposições iniciais tomadas antes da lavagem com TNP-ATP (Figura 3D, inserção).
       NOTA: O software exibirá esse ajuste e solicitará que ele seja aceito ou rejeitado. Se o ajuste for rejeitado, outra oportunidade será fornecida para selecionar arquivos para correção de clareamento.
    2. Divida os espectros ANAP normalizados (na etapa 5.10) pelo valor previsto do ajuste exponencial da etapa 5.11.1 em cada ponto de tempo (Figura 3E).
       NOTA: Para o exemplo mostrado, a fluorescência de pico normalizada observada em 50 s é de 0,65 e a fluorescência prevista a partir do ajuste exponencial é de 0,64. Para corrigir o clareamento, divida o valor observado (0,65, Figura 3E inset, círculo vazio) pelo valor previsto (0,64, Figura 3E inset, linha tracejada) para produzir o valor corrigido (~1, Figura 3E inset, círculo colorido). Se a correção do clareamento for adequada, a intensidade da PANA de todas as exposições adquiridas na ausência de nucleotídeos deve ser aproximadamente igual (Figura 3E). Esses cálculos são realizados automaticamente pelo software.
    3. Obter a saída como uma imagem plotando os dados e uma planilha com abas contendo os espectros brutos, espectros subtraídos, espectros corrigidos para fotobranqueamento e os dados de pico para cada arquivo para que análises adicionais possam ser realizadas.

6. Experimentos de fluorometria patch-clamp

1. Puxe pipetas de remendo de capilares de vidro borossilicato de paredes espessas para uma resistência de 1,5 MΩ a 2,5 MΩ quando preenchidas com solução de pipeta. A composição da solução da pipeta varia de acordo com a proteína em estudo.
2. Transfira uma lamínula com células transfectadas para uma placa de 35 mm com fundo de vidro contendo 2 mL de solução de banho e monte em um microscópio invertido equipado com uma objetiva de imersão em água de 60x de alto NA. Perfundir a câmara de banho (0,5 – 1 mL/min) com solução de banho com bomba peristáltica. Quanto à solução de pipeta, a solução de banho irá variar dependendo da proteína em estudo.
3. Identificar uma célula que expresse canais marcados com ANAP procurando fluorescência na membrana celular.
4. Encha uma pipeta de remendo com solução de pipeta. Aplique uma pressão positiva suave na pipeta e coloque na câmara de banho. Pressione a pipeta contra a membrana da célula e aplique uma sucção suave para obter uma vedação GΩ (Figura 4A).
5. Excise o adesivo movendo rapidamente o suporte da pipeta para longe da célula (Figura 4A).
   NOTA: A excisão do adesivo desta forma deve formar um adesivo de dentro para fora, com os domínios citosólicos da proteína expostos ao sistema de perfusão. Se a localização do sítio de ligação de nucleotídeos em estudo não for citosólica, será necessário usar adesivos externos ou gravações de células inteiras para realizar experimentos de PCF.
6. Aproximar a ponta da pipeta do remendo da ponta do sistema de perfusão e verificar se o remendo está dentro da fenda da máscara do espectrômetro (Figura 4A).
7. Aplicar TNP-ATP e espectros de imagem como nas etapas 4.10-4.12, enquanto simultaneamente registra a resposta da corrente iônica à aplicação de nucleotídeos.
   OBS: O vidro da pipeta pode introduzir aberrações espaciais e reflexos nas imagens adquiridas. No entanto, essas aberrações não afetarão a forma dos espectros adquiridos e a luz de excitação refletida é facilmente separada da fluorescência usando o espectrógrafo ou um filtro de emissão passa-longa.
8. Analise os espectros. Os espectros obtidos a partir de manchas excisadas podem exibir subtração excessiva da fluorescência não ligada do TNP-ATP devido à exclusão do TNP-ATP do vidro da pipeta do remendo (Figura 4C-E). Essa subtração excessiva não afeta o espectro de emissão da ANAP e, portanto, pode ser ignorada.
   NOTA: Como o sinal de fluorescência em manchas excisadas será menor do que em membranas sem telhado, é importante usar um tempo de exposição que forneça sinal a ruído alto o suficiente sem clarear a ANAP muito rapidamente.

Resultados

A Figura 2 mostra o arranjo experimental básico para medir a ligação de nucleotídeos a proteínas fluorescentes em fragmentos de membrana sem telhado obtidos por sonicação (Figura 2A,B). Duas abordagens diferentes foram usadas para obter membranas destelhadas, cultivando diretamente as células em lamínulas de cobertura revestidas com poli-L-lisina ou cultivando células em vidro não tratado e expondo-as brevemente à poli-L-lisina (0,1% em água) antes do destelhado. A Figura 2C mostra um fragmento de membrana típico sem telhado de uma célula HEK-293T expressando canais_{de K ATP} marcados com proteína fluorescente laranja (OFP). As membranas sem teto eram virtualmente invisíveis em imagens de campo claro e foram identificadas pela fluorescência de proteínas de membrana marcadas ou por contracoloração com um corante de membrana como octadecil rodamina B¹³. Além das membranas destelhadas, a sonicação das células HEK-293T também produziu fragmentos celulares parcialmente destelhados (Figura 2D)^10,17. Esses fragmentos eram visíveis em campo claro. Isso pode ser o resultado de membranas plasmáticas babadas que são pouco aderentes ao vidro da cobertura. Alternativamente, esses fragmentos podem conter vesículas e membranas de organelas intracelulares. Como tal, é preferível adquirir imagens apenas de membranas "verdadeiras" sem teto, uma vez que a proteína-alvo marcada associada às membranas intracelulares pode refletir estágios intermediários de processamento e montagem pós-traducional. O cultivo de células em vidro revestido com poli-L-lisina é recomendado, pois isso resultou em um maior rendimento de membranas "verdadeiras" sem telhado após a sonicação.

Um sistema de perfusão de microvolumes foi aplicado a nucleotídeos fluorescentes para minimizar as quantidades necessárias em um experimento típico (Figura 2B). A ponta de vidro revestida de poliimida fornecida foi substituída por uma ponta de vidro borossilicato puxada à mão em nossa configuração de perfusão, o que reduziu o fundo de fluorescência. Para minimizar o acúmulo de nucleotídeos ao redor das membranas não cobertas que estão sendo fotografadas, toda a câmara de banho foi lentamente perfundida com tampão. Dessa forma, desejamos medir a taxa de troca de solução do nosso sistema de perfusão de microvolume e verificar se conseguimos atingir a concentração de ligante pretendida em nossa região de interesse, ou seja, que o ligante do nosso sistema de perfusão não foi diluído diretamente no meio de banho antes de atingir a membrana destelhada. Para controlar essas possibilidades, foi medida a lavagem e o wash-out de uma solução de 50 μM de tetrametilrodamina-5-maleimida (TMRM) de nosso sistema de perfusão de microvolume direcionados à superfície de uma placa de fundo de vidro de cobertura perfundida com água (Figura 2E). A cinética de troca de solução foi reprodutível e bem descrita por um único decaimento exponencial com constantes de tempo menores que 1 s tanto para o wash-in quanto para o wash-out. Esses tempos de troca de solução limitam nossa capacidade de medir a cinética de ligação e desvinculação de ligantes em nossa configuração atual. Para verificar se conseguimos atingir a concentração desejada do ligante na superfície da lamínula, comparamos a intensidade de fluorescência de 50 μM de TMRM entregue à lamínula pelo nosso sistema de perfusão de microvolume com 50 μM de TMRM em banho de parada (Figura 2F). Nenhuma diferença na intensidade foi observada, verificando-se que concentrações adequadas do ligante na superfície do deslizamento de cobertura com nosso sistema de perfusão de microvolume podem ser alcançadas, mesmo quando o banho é perfundido.

A Figura 3A mostra uma imagem espectral obtida de canais de K ATP marcados com ANAP em uma membrana sem telhado de uma célula HEK-239T exposta a 5 μM TNP-ATP. Para a obtenção dessas imagens, a luz emitida pela membrana destelhada foi direcionada através de um espectrômetro em série com uma câmera CCD. A fluorescência emitida foi difratada das grades e projetada no chip da câmera, produzindo espectros. As imagens resultantes retêm informações espaciais na dimensão y, mas a dimensão x foi substituída pelo comprimento de onda. A região de interesse (ROI), correspondente à membrana destelhada, é delineada em laranja. Duas regiões de alta intensidade são evidentes na imagem, correspondendo ao pico de emissão de ANAP e TNP-ATP. Isso foi melhor apreciado no espectro de comprimento de onda por comprimento de onda (em toda a ROI) mostrado na Figura 3B. O pico ~470 nm corresponde à ANAP incorporada ao K_ATP; o pico ~535 nm corresponde ao TNP-ATP. Para corrigir a fluorescência de fundo e a excitação direta do TNP-ATP em solução, uma região de fundo (Figura 3A, cinza) foi selecionada de cada imagem. A média do espectro de fundo é mostrada na Figura 3B. O espectro final foi obtido subtraindo-se o espectro de fundo médio do espectro de ROI médio (Figura 3C).

A ANAP é propensa a artefatos fotoclareadores. A Figura 3D mostra a redução do pico de fluorescência da ANAP após múltiplas exposições. O pico de fluorescência de várias exposições na ausência de TNP-ATP (ou de lavagens entre concentrações de TNP-ATP) foi ajustado a um decaimento exponencial único e isso foi usado para corrigir artefatos de fotoclareamento (Figura 3E). Recomenda-se a realização de experimentos de concentração-resposta de baixas a altas e altas a baixas concentrações de nucleotídeos. Se a correção do clareamento não introduzir artefatos adicionais, os resultados devem ser comparáveis¹¹.

A Figura 5A mostra imagens espectrais representativas de uma membrana sem telhado obtidas de uma célula expressando canais de K ATP marcados com ANAP na ausência e presença de TNP-ATP. Os espectros corrigidos são mostrados na Figura 5B. Observando os espectros de emissão, houve uma clara separação entre a emissão de fluorescência do doador e do receptor. Como foi observada alguma ligação inespecífica do TNP-ATP a membranas plasmáticas virgens de células HEK-293T não transfectadas, recomenda-se quantificar o FRET como uma redução na fluorescência do doador (ANAP)^10,11. Esse pico foi específico para o receptor marcado.

Para ligantes que induzem uma mudança conformacional em seu receptor, estudos de ligação isoladamente não fornecem informações diretas e mecanisticamente significativas sobre o processo de ligação do ligante¹⁸. A relação concentração-resposta para ligação do ligante depende não apenas da afinidade intrínseca de ligação, mas também da mudança conformacional induzida pela ligação do ligante, e da propensão inerente do receptor a mudar de conformação na ausência do ligante. Para entender melhor os processos que sublinham as interações ligante-receptor, as medidas de ligação podem ser emparelhadas com experimentos que fornecem uma leitura da função da proteína. Para este fim, os canais iônicos são um sistema modelo ideal, pois suas correntes podem ser medidas com resolução de tempo sub-ms até o nível de molécula única usando pinça de tensão. Historicamente, medições pareadas de corrente e fluorescência têm fornecido informações significativas sobre a abertura e fechamento (gating) de canais iônicos dependentes de tensão e ligantes 19,20,21. Experimentos têm sido conduzidos para medir simultaneamente correntes iônicas e nucleotídeos cíclicos fluorescentes ligando-se a vários canais nucleotídeos cíclicos^{regulados 22,23,24}. Esses estudos empregaram um ligante que aumentou seu rendimento quântico após a ligação. A fluorescência do ligante não ligado no volume da solução próximo ao remendo pode ser subtraída por imagem dos remendos por microscopia confocal^22,23. Em nossos estudos, a ligação foi medida usando a redução da fluorescência da ANAP. Como este sinal é específico para o canal e o FRET entre ANAP e TNP-ATP é fortemente dependente da distância (metade máxima em ~43 Å), a contaminação do nosso sinal por nucleotídeos não especificamente ligados e não ligados foi evitada.

A Figura 4A mostra um experimento típico de fluorometria patch-clamp (PCF). Um selo de alta resistência (GΩ) foi formado entre uma pipeta de vidro borossilicato preenchida com solução salina (conectada a um amplificador de pinça de tensão) e uma célula expressando K_{ATP marcado com ANAP}. Após a formação do selo, a pipeta foi afastada da célula, permitindo o acesso aos sítios de ligação de nucleotídeos intracelulares. A pipeta foi então posicionada sobre a objetiva do microscópio, centrada na fenda da máscara do espectrômetro e a saída do sistema de perfusão de microvolume (modificado com uma ponta de vidro borossilicato) foi aproximada da pipeta (Figura 4D). A tensão foi controlada e as correntes foram medidas a partir dos canais no patch. Correntes e espectros representativos de canais K_ATP marcados com ANAP são mostrados na Figura 4B, codificados por cores para corresponder os espectros às correntes. Os espectros de emissão foram corrigidos para fundo e clareamento e para membranas sem telhado.

Figura 1: ANAP e TNP-ATP formam um par FRET adequado. (A) Estruturas da ANAP e TNP-ATP. As metades fluorescentes são destacadas. (B) Espectros de absorbância e emissão de fluorescência de ANAP e TNP-ATP. A sobreposição entre a emissão ANAP e a absorbância TNP-ATP é necessária para o FRET. Adaptado de Puljung e colaboradores (publicado sob a Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Medição da ligação de nucleotídeos em membranas plasmáticas sem teto. (A) Esquema para a preparação de membranas plasmáticas sem teto a partir de células aderentes que expressam uma proteína fluorescente de membrana. São fornecidas instruções para as células cultivadas em lamínulas revestidas com poli-L-lisina ou não tratadas. (B) Instalação experimental para medição da ligação de nucleotídeos em membranas sem teto. (C) Campo brilhante e imagens fluorescentes de uma membrana plasmática completamente descoberta derivada de uma célula que expressa canais K_ATP marcados com proteína fluorescente laranja (OFP). O asterisco marca a posição da membrana, que é quase invisível na imagem de campo brilhante. O OFP foi excitado com um LED largo de 565 nm através de um filtro passa-banda de 531/40 nm e a luz dicroica de borda de 562 nm foi coletada através de um filtro passa-banda de 593/40 nm. (D) Campo brilhante e imagens fluorescentes de um fragmento de membrana parcialmente destelhado derivado de uma célula que expressa canais K_ATP marcados com proteína fluorescente laranja (OFP). (E) Curso de tempo de troca de solução adquirido usando a configuração descrita em B. Cinco réplicas técnicas são mostradas. O sistema de perfusão de microvolume foi carregado com 50 μM de tetrametilrodamina-5-maleimida (TMRM). O banho foi perfundido com água a uma taxa de ~0,5 mL/min. Os dados dos cursos de tempo wash-on (fluorescência crescente) e wash-out (fluorescência decrescente) foram ajustados com um único decaimento exponencial da forma F = A*exp(-x/τ) + y₀. A constante de tempo (τ) para wash-in foi de ~0,6 s. A constante de tempo para wash-out foi de ~1,0 s. O TMRM foi excitado com um LED largo de 565 nm através de um filtro passa-banda de 540/25 nm e a luz dicroica de borda de 565 nm foi coletada através de um filtro passa-banda de 605/55 nm. (F) Comparação da intensidade de fluorescência de uma solução de 50 μM de TMRM aplicada utilizando o sistema de perfusão de microvolume como em B e de um banho de alambique contendo 50 μM de TMRM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Subtração de fundo e correção do clareamento. (A) Imagem espectral (informação espacial na dimensão y, comprimento de onda na dimensão x) de uma membrana plasmática sem teto de uma célula expressando canais K_ATP marcados com ANAP. 5 μM TNP-ATP foi aplicado usando o arranjo descrito na Figura 2B. A caixa laranja denota a região de interesse (ROI), correspondente à membrana destelhada. A caixa cinza indica a região de fundo usada para corrigir o espectro. (B) Espectros de emissão derivados das médias comprimento de onda por comprimento de onda das regiões ROI e de fundo em A. (C) Espectro derivado subtraindo o espectro de fundo médio do espectro de ROI médio em B. A janela de 5 nm ao redor do pico ANAP usada para determinar a intensidade média é mostrada como uma área sombreada em cinza. (D) Espectros adquiridos de seis exposições consecutivas de 10 s de uma membrana plasmática sem teto de uma célula expressando canais de_{K ATP} marcados com ANAP. Observe o decremento na fluorescência resultante do fotoclareamento. O inset mostra o ajuste de fluorescência de pico normalizado com um único decaimento exponencial da forma F/F_max = A*exp(-t/τ) + (1-A). Os símbolos na inserção são codificados por cores para corresponder aos espectros. (E) Os mesmos espectros de D corrigidos para fotoclareamento. O inset mostra o pico normalizado de fluorescência de D como círculos abertos, com o pico de fluorescência corrigido mostrado usando círculos preenchidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Medidas simultâneas de ligação de nucleotídeos e correntes de canal usando fluorometria patch-clamp (PCF). (A) Esquema mostrando o arranjo experimental para medição de ligação de nucleotídeos e correntes iônicas. (B) Exemplo de correntes (esquerda) e espectros (direita) adquiridos de um patch de membrana excisado de uma célula que expressa canais K_ATP marcados com ANAP. As correntes foram registradas a um potencial de retenção de -60 mV, digitalizadas a 20 kHz e filtradas a 5 kHz. A área sombreada em cinza corresponde à faixa de comprimento de onda a partir da qual a intensidade da ANAP foi quantificada. Adaptado de Usher e colaboradores (publicado sob a Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)¹¹. (C) Espectro adquirido a partir de um adesivo de membrana excisado de uma célula que expressa canais K_ATP marcados com ANAP expostos a 1 mM TNP-ATP. Observe o pico negativo correspondente à faixa de comprimento de onda sobre a qual a fluorescência TNP-ATP é observada. A área sombreada em cinza denota a faixa de comprimento de onda usada para quantificar a fluorescência ANAP como em B. Adaptado de Usher et al., publicado sob a Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)¹¹. (D) Campo brilhante e imagens fluorescentes de uma pipeta de remendo exposta a 1 mM TNP-ATP. O asterisco marca a ponta da pipeta. (E) Imagem espectral da mesma pipeta de remendo em 1 mM TNP-ATP. O asterisco marca a posição da pipeta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Ligação do TNP-ATP aos canais K_ATP marcados com ANAP. (A) Imagens espectrais de uma membrana plasmática sem teto de uma célula expressando canais de K ATP marcados com ANAP na ausência de TNP-ATP ou na presença de 50 μM ou 1 mM TNP-ATP. As intensidades são mostradas como um mapa de calor. (B) Espectros médios de comprimento de onda a partir das imagens em A mostrando a extinção da fluorescência ANAP por TNP-ATP. As áreas sombreadas representam dois filtros passa-banda diferentes que podem ser usados para medir a têmpera ANAP se um espectrômetro não estiver disponível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Têmpera dos canais de K ATP marcados com ANAP por_TNP-ATP em membranas destelhadas e PCF. Sobreposição de dados de Usher e colaboradores (publicados sob a Creative Commons Attribution License, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)¹¹. Os dados foram ajustados à equação de Hill: F / F max = E max + (1 – E _max) / (1+10^{(EC50 –[TNP-ATP])*h}). F é a fluorescência medida, F max é a fluorescência máxima na ausência de nucleotídeo, E_max é a têmpera máxima em concentrações de nucleotídeos saturantes e h é a inclinação de Hill. EC50, (a concentração de nucleotídeos na qual a têmpera é metade máxima) e [TNP-ATP] são valores logarítmicos. Membranas sem teto: CE50 = -4,59 (25,7 μM), h = 0,82, E_max = 0,93. PCF: CE50 = -4,11 (77,6 μM), h = 0,87, E_max = 1,00. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Desenvolvemos um método para medir a ligação de adenina nucleotídica em tempo real a proteínas intactas da membrana. Nosso método baseia-se em várias outras técnicas estabelecidas, incluindo a marcação de proteínas com ANAP usando supressão de códon âmbar stop 12, destelhamento celular¹⁴ e fluorometria voltage-clamp/PCF 19,20,21,22,23,24,25 . A síntese dessas abordagens permite a mensuração da ligação de nucleotídeos com alta resolução espacial e temporal. De fato, em nosso trabalho anterior, conseguimos distinguir entre diferentes sítios de ligação no mesmo complexo proteico usando essa abordagem^10,11. É importante ressaltar que essa técnica pode ser aplicada diretamente a pequenas quantidades de proteína em um ambiente celular em condições que preservem a função proteica. O uso de nosso método de ligação em conjunto com a leitura eletrofisiológica direta de correntes de canais iônicos nos permite obter informações ricas sobre os fundamentos moleculares do fechamento de canais¹¹.

Como os espectrômetros são equipamentos de laboratório fora do padrão, a intensidade da ANAP também pode ser monitorada em relativo isolamento usando filtros passa-faixa. A Figura 5B mostra as propriedades espectrais de dois desses filtros. O filtro passa-banda de 470/10 nm filtra efetivamente o sinal de fluorescência do TNP-ATP e se sobrepõe bem com a fluorescência ANAP de pico. No entanto, o pico de transmitância deste filtro é de apenas cerca de 50%, o que pode dificultar a obtenção de bons sinais de membranas escuras (ou em remendos de membrana excisados sob pinça de tensão). Outra opção é um filtro passa-banda de 460/60 nm. Há um pouco mais de sobreposição entre o filtro de 460/60 nm e o pé do pico de emissão de TNP-ATP em comparação com o filtro de 470/10 nm. No entanto, a passagem de banda de 460/60 nm tem uma transmitância de 90-95% em uma ampla faixa do pico ANAP, o que seria esperado para aumentar o sinal de emissão de fluorescência.

A ANAP é um fluoróforo ambientalmente sensível 12,26,27. O pico de emissão e o rendimento quântico variam dependendo do local de incorporação na proteína de interesse, podendo mudar à medida que a proteína muda de conformação. Tais mudanças seriam imediatamente evidentes a partir dos espectros de emissão, mas não seriam tão óbvias quando a intensidade ANAP é medida usando filtros. Em qualquer caso, controles apropriados são necessários para demonstrar que o sinal de fluorescência não varia devido a mudanças no ambiente local ao redor da ANAP subsequentes à ligação de nucleotídeos. Experimentos de controle com nucleotídeos não marcados podem ajudar a verificar que quaisquer mudanças na intensidade da ANAP são o resultado de FRET entre os nucleotídeos ANAP e TNP. Os nucleotídeos TNP podem ligar-se não especificamente às membranas derivadas de células não transfectadas (seja à membrana plasmática ou às proteínas da membrana nativa)¹⁰. Quantificamos a ligação como um decremento na fluorescência do doador, pois este sinal é específico do canal marcado. No entanto, recomendamos a realização de experimentos de controle adicionais para cada par agonista/receptor, por exemplo, mutando o sítio de ligação de nucleotídeos, se conhecido, para verificar se a mudança na fluorescência do doador é realmente o resultado da ligação direta ao receptor marcado¹¹. Finalmente, recomenda-se trabalhar com construções que contenham uma etiqueta de proteína fluorescente além do rótulo ANAP. Isso ajuda a diferenciar a fluorescência do receptor marcado do fundo/autofluorescência. A fluorescência de fundo pode ser distinguida da ANAP pelo pico e forma dos espectros de emissão¹⁰, mas tais determinações podem ser muito difíceis quando apenas conjuntos de filtros são usados. Além disso, células e membranas sem teto expressando receptores fluorescentes podem ser identificadas usando o tag de proteína fluorescente sem ter que excitar ANAP e correr o risco de fotoclareamento excessivo.

Em muitos de nossos registros de PCF, observamos um forte pico negativo em nossos espectros em altas concentrações de TNP-ATP (Figura 4C). Esse pico negativo é um artefato do nosso protocolo de subtração de fundo. A Figura 4D mostra imagens fluorescentes e de campo claro de uma pipeta de remendo exposta a 1 mM TNP-ATP. Uma sombra na ponta da pipeta é evidente, resultante da exclusão do TNP-ATP do volume das paredes da pipeta, que é mais evidente dentro do plano de foco. A imagem espectral da Figura 4E mostra uma faixa escura, correspondente a essa sombra. Quando uma região acima ou abaixo dessa faixa escura é usada para subtração de fundo, ela produz um pico negativo. É importante ressaltar que esse pico ocorreu em uma faixa de comprimento de onda correspondente à emissão de TNP-ATP e não afetou nossas medidas de extinção da ANAP.

A principal limitação de nossos experimentos foi a obtenção da expressão adequada na membrana plasmática de construtos marcados com ANAP para medir fluorescência. Era geralmente mais fácil adquirir espectros de alta qualidade a partir de membranas sem telhado do que em PCF, devido ao seu tamanho maior e à nossa capacidade de escanear rapidamente um prato inteiro de membranas destelhadas, ao contrário do PCF, onde os adesivos só podem ser obtidos um de cada vez. Em nossos experimentos, os dados de membranas sem teto e experimentos de PCF foram semelhantes, mas não equivalentes (Figura 6)¹¹. No entanto, não há nenhuma razão a priori para que esta seja uma observação universal, pois as proteínas em uma pipeta de remendo podem estar em um estado funcional diferente daquelas em membranas sem teto.

Aqui, tentativas têm sido feitas para maximizar a expressão de nossos construtos marcados com ANAP, em particular reduzindo a temperatura de cultura celular para 33 °C^10,11,16. Em nossa experiência, a tentativa de identificar locais na proteína em que a PANA seria uma substituição conservadora não resultou consistentemente em construtos que expressassem bem. Tivemos mais sucesso na varredura sistemática de regiões inteiras de proteínas para sítios de incorporação de ANAP e triagem de candidatos para expressão de superfície¹⁰. O sistema de marcação ANAP também funciona em ovócitos de Xenopus laevis, o que permite a excisão de remendos de membrana muito maiores, aumentando o sinal para o ruído^26,27,28.

Enquanto níveis maiores de expressão devem resultar em sinais mais brilhantes, o número mínimo de canais necessários para medir a fluorescência depende de vários fatores, incluindo o brilho do fluoróforo, o grau de fotoclareamento, a intensidade da luz de excitação e o plano de foco. Teoricamente, as estimativas poderiam ser feitas correlacionando-se a intensidade da fluorescência e a corrente do canal, como já demonstrado^{anteriormente28,29}. No entanto, a confiabilidade de tais estimativas requer algum conhecimento da condutância de canal único e da probabilidade aberta do canal. Além dos fatores listados acima, o sinal de fluorescência também será afetado por canais associados a vesículas ou seções da membrana plasmática presas ao vidro da pipeta que não estão sob pinça de tensão.

Este método é prontamente adaptado ao estudo de outros canais iônicos nucleotídeos-sensíveis. A CFTR é estruturalmente semelhante à subunidade do receptor acessório de sulfonilureia do K_ATP^30,31. Assim como o K_ATP, O CFTR é controlado pela ligação de nucleotídeos, tornando-se um alvo futuro óbvio do nosso método⁷. Os receptores P2X purinérgicos são canais iônicos ligados por ATP extracelular⁹. O TNP-ATP atua como antagonista dos receptores P2X^32,33. Portanto, não será útil para estudar a ativação do P2X, embora possa ser usado em ensaios de competição com agonistas do P2X. Alternativamente, outros derivados fluorescentes de ATP com sobreposição espectral suficiente com emissão ANAP podem ser usados para estudar a ativação. Alexa-647-ATP é um agonista P2X fluorescente³⁴. O R₀ calculado entre Alexa-647 e ANAP é ~85 Å, o que significa que a ligação direta ao P2X deve resultar em supressão substancial do ANAP incorporado ao canal. No entanto, um R₀ tão longo também resultará na extinção de Alexa-647-ATP ligado a subunidades vizinhas e aumenta a probabilidade de que a ligação de nucleotídeos não específicos resulte em FRET. Como o sítio de ligação do ligante nos receptores P2X é extracelular, as medidas de ligação seriam realizadas em células intactas, em pinça de voltagem de célula inteira ou em adesivos de membrana externos. Nosso método também pode ser estendido para estudar a ligação e ativação de transportadores e bombas eletrogênicas e não-eletrogênicas que dependem de ATP para seu ciclo de reação, bem como receptores P2Y acoplados à proteína G. Finalmente, embora tenhamos desenvolvido este método para medir a ligação de adenina nucleotídica (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), a mesma abordagem pode ser usada para estudar a ligação a praticamente qualquer receptor para o qual um ligante fluorescente adequado tenha sido identificado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Balão T75 tratado para cultura de tecidos	StarLab	CC7682-4875
0,1% p/v poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920
30 mm borossilicato de vidro de cobertura VWR		631-0174
35 mm pratos estéreis não tratados	CytoOne	CC7672-3340
35 mm prato de vidro de cobertura	WPI	FD35-PDL-100
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	31966021
Soro bovino fetal (FBS)	Gibco	10500-064
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140-122
TrypLE select (triosina)	Gibco	12563-011	Reagente de tripsina/EDTA
Fosfato tamponado salino (PBS)	Gibco	14040-091
UltraPure água destilada	Invitrogen	10977-035
HEK293T células	ATTC	CRL-3216	Usado entre passagens 5-30
ANAP-TFA	AsisChem	ASIS-0014	Reconstituído em 30 mM NaOH até uma concentração final de 1 mM
plasmídeo de expressão pANAP	Addgene	Plasmid #48696	Codifica o par tRNA/tRNA sintetase para expressão da proteína marcada com ANAP
peRF1-E55D	Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Reino Unido)	Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728	Codifica o fator de liberação ribossômica eucariótico-negativo dominante
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300	Reagente de transfecção Lipopolyplex
Capilares de vidro borossilicato de paredes espessas	Harvard Apparatus	GC150F-15
Tetrametilrodamina-5-maleimida	Sigma-Aldrich	94506
TNP-ATP	Jena Bioscience	NU-221L	Entregue a 10 mM em água
Nikon Eclipse TE2000-U microscópio microscópio invertido	Objetiva de
60x (1.4 NA)	Nikon	MRD07602
Cabeça LED de alta potência de 4 comprimentos de onda	ThorLabs	LED4D245	LEDs de 385/490/565/625 nm
Driver de LED de quatro canais	ThorLabs	DC4100
Filtro de excitação passa-banda de 390/18 nm	ThorLabs	MF390-18	Para excitação ANAP
400 nm filtro de emissão passa-longa	ThorLabs	FEL0400	Para geração de imagens de espectros ANAP
416 nm dicróico de borda	ThorLabs	MD416	Para geração de imagens de espectros ANAP
460/60 nm filtro de emissão passa-banda	ThorLabs	MF460-60	Filtro passa-banda largo sugerido para imagem de fluorescência ANAP (Figura 4B)
Filtro de emissão passa-banda de 470/10 nm	ThorLabs	FB470-10	Filtro passa-banda estreito sugerido para imagem de fluorescência ANAP (Figura 4B)
Filtro de excitação passa-banda 531/40	Brightline	FF01-531/40-25	Para excitação de proteína fluorescente laranja (OFP)
Filtro de excitação passa-banda de 540/25 nm	Chroma	D540 / 25X	Para excitação de tetrametilrodamina-5-maleimida (TMRM)
562 nm dicróico de borda	Semrock	FF562-Di03	Para imagem OFP fluorescência
565 nm borda dicróica	Chroma	565DC	Para imagem TMRM fluorescência
593/40 nm filtro de excitação passa-banda	Brightline	FF01-387 / 11-25	Para imagem OFP fluorescência
605/55 nm passa-banda filtro de emissão	Chroma	D605/55M	Para imagem de fluorescência TMRM
Espectrômetro de imagem IsoPlane-160 Câmera	Princeton Instruments	IsoPlane-160
PIXIS	Princeton Instruments	PIXIS: 400BR_eXcelon
Amplificador Axopatch 200B	Molecular Devices	Axopatch 200B-2
Digidata 1440A digitalizador	Sonicador	Digidata 1440A
da Molecular	Sonics & Materiais	VC-50	Para destelhado
Bomba peristáltica digital REGLO	Ismatec	ISM 832	Para perfusão em banho
Sistema de perfusão de microvolume	ALA Scientific Instruments	ALA μ Flow-8	Para perfusão TNP-ATP
pClamp 10.6.2	Dispositivos Moleculares		Gravação e análise de correntes
Lightfield 5.20.1507	Princeton Instruments		Software de aquisição para imagens e espectros
Matlab	Mathworks		Para análise de dados
Python 3.8.1	Python Software Foundation		Para análise de dados