Artigo de método

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

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DOI:

10.3791/61403

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7 de outubro de 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Neste artigo

Resumo

Aqui, são descritos quatro métodos para a geração de organoides testiculares testiculares de células testiculares neonatais primárias, ou seja, matriz extracelular (ECM) e ambientes de cultura 2D e 3D livres de ECM. Essas técnicas possuem múltiplas aplicações de pesquisa e são especialmente úteis para estudar desenvolvimento testicular e fisiologia in vitro.

Resumo

Organoides testiculares fornecem uma ferramenta para estudar desenvolvimento testicular, espermatogênese e endocrinologia in vitro. Vários métodos foram desenvolvidos para criar organoides testiculares. Muitos desses métodos dependem da matriz extracelular (ECM) para promover a montagem de novos tecidos, no entanto, há diferenças entre métodos em termos de morfologia biomimética e função dos tecidos. Além disso, há poucas comparações diretas de métodos publicados. Aqui, uma comparação direta é feita estudando diferenças nos protocolos de geração organoide, com resultados fornecidos. São descritos quatro métodos de geração arquetípica: (1) cultura ECM 2D, (2) ECM 2D, (3) 3D ECM livre e (4) cultura ECM 3D. Foram utilizados três benchmarks primários para avaliar a geração organoide testicular. São células de automontagem celular, inclusão de grandes tipos celulares (sertoli, Leydig, germes e células peritubulares) e arquitetura de tecido compartimentalizada adequadamente. Dos quatro ambientes testados, culturas 2D ECM e 3D sem ECM geraram organoides com morfologias internas mais semelhantes aos testículos nativos, incluindo a compartimentação de novo dos tipos de células tubulares versus intersticiais, o desenvolvimento de estruturas semelhantes a túbulos e uma função endócrina estabelecida a longo prazo. Todos os métodos estudados utilizaram suspensões de células testiculares murinas não variadas e utilizaram recursos culturais comumente acessíveis. Essas técnicas de geração organoide testicular fornecem um kit de ferramentas altamente acessível e reprodutível para iniciativas de pesquisa sobre organogênese testicular e fisiologia in vitro.

Introdução

Organoides testiculares são uma técnica pioneira para estudar desenvolvimento testicular, espermatogênese e fisiologia in vitro1,2,,3,4. Vários métodos têm sido explorados para a geração organoide; estes incluem uma variedade de sistemas de cultura extracelular (ECM) e sem ECM, tanto em orientações bidimensionais (2D) quanto tridimensionais (3D). Diferentes métodos de geração podem promover estratégias distintas de montagem celular; isso resulta em um alto nível de variabilidade morfológica e funcional entre modelos organoides publicados. O objetivo deste artigo é discutir o estado atual dos modelos testiculares in vitro, e servir de modelo para futuros pesquisadores, ao projetar experimentos organoides testiculares. No presente estudo, quatro arquétipos diferentes do sistema cultural são definidos e caracterizados em processo experimental e desfecho biológico. Estes incluem: métodos de cultura 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free e 3D ECM. As estratégias aqui apresentadas destinam-se a ser simples, acessível e altamente reprodutível entre diferentes laboratórios e grupos de pesquisa.

Historicamente para os testis, a designação "in vitro", tem sido usada para vários métodos culturais diferentes de tecidos e células testiculares. Estes incluem métodos organotípicos de tecido/cultura de órgãos (ou seja, cultura explant)5, cultura de túbulos seminiferosisolados 6,cultura celular testicular7, e métodos de morfogênese de novo tecido (ou seja, construções biológicas e organoides)1. As primeiras investigações sobre espermatogênese in vitro foram realizadas há aproximadamente 100 anos, com a cultura de explants de testígenos de coelho em 19208, e mais tarde em 1937 com explants de camundongos9. Dentro desses experimentos iniciais, a espermatogonia foi observada para se degenerar em grande parte durante a primeira semana de cultura, embora algumas células meioticamente diferenciadas tenham sido identificadas. Lembrando esses relatos históricos, a cultura explant testis foi revivida e otimizada em 2011 para se tornar uma técnica viável para o estudo do testis10. Desde 2011, a cultura explant produz esperma competente em múltiplos relatórios11,12,13. No entanto, devido à dependência da cultura explant em túbulos de testículos nativos pré-existentes, esses avanços recentes são descritos com mais precisão como exemplos de função testicular "ex vivo" e espermatogênese, função tecidual que foi mantida ou retomada após a remoção do corpo de um organismo. Apesar de sua prevalência na literatura, a manutenção de células germinativas de longo prazo e a diferenciação dentro de explants testiculares são desafiadoras para replicar14,15,16,17,18, especialmente em períodos longos o suficiente para observar totalmente a espermatogênese in vitro (~35 dias em camundongos19 e 74 em humanos20). É intrigante perceber que muitos dos mesmos desafios experimentados há 100 anos, ainda são experimentados dentro da espermatogênese ex vivo hoje.

Diferente das abordagens ex vivo, os organoides testiculares são microtissues montados de novo gerados inteiramente in vitro a partir de fontes celulares (ou seja, células testiculares primárias). Organoides testiculares fornecem uma estratégia criativa para contornar a dependência histórica do campo sobre o tecido nativo pré-existente, e para recapitular a biologia testicular completamente in vitro. Existem múltiplos requisitos compartilhados pela maioria dos modelos de tecido organoide; estes incluem (1) morfologia ou arquitetura de tecido simicoético vivo, (2) múltiplos tipos de células principais do tecido representado, (3) auto-montagem ou auto-organização em sua geração, e (4) a capacidade de simular algum nível da função e fisiologia do tecido representado21,,22,,23,,24. Para os testis, isso pode ser capturado em quatro grandes marcas: (1) a inclusão de grandes tipos de células testiculares, germe, Sertoli, Leydig, peritubular, e outras células intersticiais, (2) conjunto de tecidos direcionados por células, (3) tipos de células compartimentadas apropriadamente em compartimentos tubulares separados (germe e Sertoli) e regiões intersticiais (todos os outros tipos de células), e (4) algum grau de função tecidual (por exemplo, secreção hormonal reprodutiva ou respostas teciduais, germe e manutenção celular e diferenciação). Considerando os desafios históricos na manutenção da diferenciação de células germinativas ex vivo e in vitro, a recapitulação de arquiteturas testiculares intramicéticas (ou seja, estruturas semelhantes a túbulos seminiferos) com marcadores adicionais sugerindo simulação de fisiologia testicular (por exemplo, função endócrina), são marcos prioritários para a geração de organoides que podem um dia sustentar na espergenena.

A maioria dos métodos organoides testiculares publicados aproveitam as formulações de ECM disponíveis comercialmente (por exemplo, colágeno ou ecm proprietário)25,,26,27 ou ECMs de origem personalizada (ou seja, testis descelularizados)28,,29,,30. O ECM exógeno promove a formação de tecidos de novo através do fornecimento de um andaime de suporte à montagem para a geração de tecidos. Os métodos de ECM têm proporcionado um nível impressionante de formação tecidual, incluindo alguma presença de células germinativas e morfologia mímica tecidual25,,28. No entanto, os ECMs que utilizam nem sempre estão disponíveis universalmente (ou seja, hidrogéis derivados do ECM), e alguns métodos requerem orientações sofisticadas de gel e semeadura celular (por exemplo, gradientes de 3 camadas de ECM e impressão 3D)25,,31,,32. Métodos livres de andaimes (por exemplo, gota suspensa e placas de cultura não adesê),33,,34,35 também geraram organoides robustos e altamente reprodutíveis sem a necessidade de géis ECM ou andaimes. No entanto, a morfologia tecidual desses organoides livres de andaimes é muitas vezes diferente dos testículos in vivo, e a maioria desses relatórios incorpora um aditivo bioquímico de ECM para promover a formação de tecidos33,,34,,36ou, alternativamente, dependem de centrifugação para agregação celular forçada e compactação34, tornando-os menos ideais para estudar migração e auto-organização dirigidas por células.

Os quatro métodos de geração organoide apresentados neste manuscrito incluem estratégias dependentes do ECM e independentes, cada uma utilizando semeadura celular simples que permite a observação da automontagem organoide orientada por células. Todas as quatro técnicas podem ser realizadas a partir das mesmas suspensões celulares ou podem fazer uso de populações personalizadas e enriquecidas do tipo celular. Uma força desses métodos é a capacidade de observar organoides auto-montados em tempo real, e comparar diretamente como estruturas testiculares se auto-reúnem entre diferentes microambientes culturais. As diferenças fenotípicas entre esses quatro métodos culturais devem ser consideradas por seu impacto na questão da pesquisa ou assunto do pesquisador. Cada método produz construções biológicas ou organoides dentro de 24 h ou menos. Em conclusão, os métodos aqui apresentados fornecem um kit de ferramentas de técnicas de montagem organoide para o estudo do montagem organoide testicular, desenvolvimento de tecidos e fisiologia testicular in vitro.

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Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade northwestern, e todos os procedimentos foram realizados sob protocolos aprovados pela IACUC.

1. Preparação de soluções enzimáticas de dissociação de tecidos

  1. Use duas soluções enzimáticas diferentes (Solução 1 e Solução 2), ambas feitas utilizando uma solução média de cultura basal (BM).
  2. Para preparar bm, adicione soro e penicilina-estreptomicina ao mínimo essencial de concentrações médias para finais de 10% e 1% respectivamente (ver Tabela de Materiais para reagentes específicos). Em seguida, estéril filtro o BM através de um filtro de 0,22 μm. Antes do uso com células, pré-equilibre bm estéril a um pH neutro, dispensando em um prato de cultura e colocando dentro de uma incubadora de CO2 umidificada de 5% a 37 °C para um mínimo de 1h.
    NOTA: A BM pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana, após a qual deve ser feita bm fresca.
  3. Para preparar as soluções de estoque de colagenase I, primeiro dissolva 100 mg de colagenase I em 1 mL de embrião estéril grau H2O (concentração final de 10% m/v), inverter ou girar para dissolver, e armazenar alíquotas de 20 μL a -20 °C para uso posterior. Alíquotas devem ser descongeladas apenas uma vez.
  4. Para preparar soluções de estoque desoxyribonuclease I (DNase I), adicione 20 mg de DNase I em 1 mL de embrião estéril grau H2O (concentração final 2% m/v), inverter ou girar para dissolver (não vórtice) e armazenar 20 alíquotas de μL a -20 °C para uso posterior. Alíquotas devem ser descongeladas apenas uma vez.
  5. Para soluções de estoque de hialuronidase, adicione 30 mgs em 1 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato estéril (PBS; concentração final de 3% m/v de hyaluronidase em PBS contendo Ca++/Mg++), inverter ou redemoinho para dissolver, e armazenar 100 alíquotas μL a -20 °C para uso posterior. As alíquotas podem ser descongeladas e re congeladas várias vezes sem perda de atividade enzimática.
  6. Para preparar a solução de dissociação 1,adicione 10 μL de colagenase I e 10 μL DNase I em 1 mL de BM estéril e pré-equilibrada (concentrações finais: 1 mg/mL colagenase I e 5 μg/mL DNase I). Triturar suavemente com uma pipeta para misturar a solução e pré-aquecer a 37 °C antes de usar com o tecido.
    NOTA: A solução 2 é preparada adicionando 33 μL de hialuronidase (pré-37 °C) por 1 mL de Solução 1, (a uma concentração final de 1 mg/mL). Isso ocorre no meio do caminho através da dissociação enzimática do tecido testiá-s na etapa 2.5 abaixo.

2. Dissociação tecidual testis

NOTA: Todos os ratos foram alojados dentro de gaiolas de polipropileno e fornecidos com comida e água ad libitum. Os animais foram alimentados com comida irradiada que não contém fitoestrogênios. Camundongos cd-1 juvenis, 5 dias pós-parto (dpp), foram usados para todos os experimentos e anestesiados antes da eutanásia e coleta de tecidos, dentro de uma câmara de anestesia anexada a um vaporizador isoflurane (2,5 L/min em O2). Os camundongos foram confirmados para anestesia total através da ausência de uma resposta ao toe-prick, após o qual os ratos foram eutanizados via decapitação.

  1. Anestesiar ratos em uma câmara isoflurane, garantir anestesia através de um dedo do dedo do dedo do dedo do pedaço, e, em seguida, decapitar o rato usando uma tesoura afiada. Coloque o supino de camundongos eutanizado em um tapete de dissecção e esterilize o abdômen com 70% de etanol. Tenda a pele do abdômen inferior com fórceps e abra o abdômen com uma tesoura.
  2. Localize os testículos nas regiões inferior esquerda e direita do abdômen. Corte suas conexões com os adiamentos vas e qualquer tecido conjuntivo de ancoragem, em seguida, levante todo o testíase (com epidídis ainda ligado) do animal. Coloque testículos em uma placa de Petri de BM pré-equilibrada.
  3. Sob um microscópio de dissecção e dentro de um campo estéril, faça uma pequena incisão na tunica albuginea em uma extremidade de cada teste com uma pequena tesoura de microdisseção ou rasgando suavemente usando duas fórceps finas.
    1. Em seguida, enquanto segura o testío da extremidade oposta da incisão, aperte suavemente o testíps com fórceps finos e empurre em um movimento suave de varredura em direção ao buraco na tunica; isso vai liberar o tecido testicular como uma peça coesa.
  4. Corte os testículos em pedaços menores (≤ 2 mm3) e coloque-os em 1 mL de solução de dissociação pré-aquecida (37 °C).
    1. Incubar a 37 °C por 10 min.
    2. Para mais de 10 testículos, aumente o volume total da solução de dissociação em 1 mL, garantindo um mínimo de 1 mL de solução de dissociação por 10 testículos (por exemplo, 2 mL para 20 testículos, 3 mL para 30 testículos, etc.).
    3. Triturar suavemente as peças testis 50 vezes (50x) na solução 1 usando uma pipeta P1000. Certifique-se de que os túbulos se separem um do outro e do tecido intersticial neste momento. Se os aglomerados permanecerem, incubar por mais 5 minutos e triturar mais uma vez (50x).
  5. Adicione 33 μL de solução de estoque de hialuronidase (pré-aquecida a 37 °C, a partir da etapa 1,5) por 1 mL de mistura de dissociação da solução 1 (contendo o tecido testicular parcialmente dissociado e as tubulações). Depois de adicionar hyaluronidase, esta é chamada solução 2.
    1. Triturate (50x) utilizando um P1000 e incubar a 37 °C por 5 min.
    2. Triturata (50x) usando uma pipeta P200.
    3. Certifique-se de que, neste momento, não há túbulos visíveis ou aglomerados de células. Se as aglomerações persistirem, incubar por mais 5 minutos, com mais trituração usando uma pipeta P200 (50x).
  6. Sacie as enzimas de dissociação adicionando soro bovino fetal (FBS) a 10% do volume total da solução 2. Triturar várias vezes usando uma pipeta P200 para garantir que não restem aglomerados e filtrar através de um coador de células de 40 μm para produzir uma suspensão de célula única.
  7. Centrífugas a 100 x g por 7 min, descartam o supernascedor e resuspensam as células em BM fresco.
  8. Conte as concentrações celulares totais e viáveis usando a exclusão azul tripano em um hemócito. Adicionar 10 μL de 1:1 diluído, suspensão celular: solução azul trypan, na câmara de contagem de células hemótâmica (ver Tabela de Materiais).
    1. Re-centrífugas células a 100 x g por 7 min e resuspend em BM fresco.
      NOTA: Use apenas células viáveis para calcular a concentração celular e o número. Basta usar suspensões celulares de ≥ viabilidade de 80% para geração de organoides.
    2. Prepare a suspensão de célula única em concentrações celulares conforme descrito para alíquotar de 280.000 células, dado os volumes utilizados no protocolo de etapas específicas abaixo na seção 3: 2D ECM-Free – 0,56 x 106 células/mL, 2D ECM – 0,56 x 106 células/mL , 3D ECM-Free – 4,66 x 106 células/mL, 3D ECM – 2,8 x 106 células/mL.
      NOTA: Todos os experimentos culturais apresentados aqui começam com 280.000 células semeadas por cultura bem. Esses números são combinados com os dados representativos na Figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura 4.

3. Preparação de pratos de cultura organoide e semeadura de células

NOTA: Para garantir um ECM homogêneo, pré-descongelar alíquotas congeladas de ECM durante a noite antes da experimentação. As alíquotas do ECM devem ser submersas dentro de um balde de gelo dentro de uma geladeira de 4 °C ou sala fria para garantir um aumento lento e gradual da temperatura. Todo ECM é usado em uma diluição final de 1:1 em BM para cultura. Mantenha o ECM descongelado e o ECM diluído 1:1 no gelo até imediatamente antes do uso, caso contrário, o ECM pode polimerizar prematuramente.

  1. Para a cultura livre de ECM 2D, não é necessária uma preparação especial, suspensões de célula única de placa (500 μL de 0,56 x 106 células/mL em BM) diretamente em slides de câmara de 4 poços, e coloque em uma incubadora de 35 °C para cultura.
    NOTA: As células devem aderir ao fundo do prato de cultura dentro das primeiras 24 horas de cultura e podem exibir alguns pequenos aglomerados de células 3D dentro deste mesmo tempo.
  2. Para a cultura 2D ECM, dispense 100 μL de frio 1:1 diluído extracelular matriz de porão médio em um slide de câmara de 4 poços, garantindo que o gel cubra a totalidade do fundo do prato.
    1. Coloque o deslizamento da câmara em uma incubadora de 35 °C por um mínimo de 30 minutos para permitir que o ECM polimerize em um gel.
    2. Adicione a suspensão celular (500 μL de 0,56 x 106 células/mL em BM) diretamente na parte superior do gel 2D uma vez que tenha polimerizado.
      NOTA: As células devem agrupar-se para formar pequenos clusters 3D dentro das primeiras 24 horas de cultura.
  3. Para a cultura livre de ECM 3D, prepare as pastilhas 3D de placas de Petri antes de iniciar a cultura celular.
    1. Primeiro, autoclave 1,5 g pó de agarose em um béquer de 100 mL, em seguida, adicione 75 mL de água estéril, água destilada e micro-ondas para produzir 2% de agarose derretida para fundição de placa 3D Petri.
    2. Dentro de um espaço de trabalho estéril, dispense agarose derretida no molde da placa 3D Petri até que o menisco esteja nivelado com as laterais do molde.
    3. Deixe a agarose esfriar e solidificar. Quando sólido, vire o molde de cabeça para baixo e flexione suavemente repetidamente até que a placa 3D Petri cai livre do molde.
      NOTA: Neste ponto, pode-se preparar muitas placas 3D Petri agarose e armazená-las em H2O ou DPBS estéreis a 4 °C por mais de um mês.
    4. Antes de cultivar, coloque pratos 3D Petri em uma placa de cultura de 24 poços, e cubra-os com 1 mL de BM. Deixe que as placas 3D Petri se equilibrem em BM por pelo menos 30 min dentro de uma incubadora de cultura de 37 °C. Descarte o BM e repita o equilíbrio mais uma vez com 1 mL de BM fresco. Após o equilíbrio das placas 3D Petri em BM, elas aparecerão da mesma cor do BM (ou seja, rosa).
    5. Para se preparar para a semeadura celular, remova todo o BM do poço e dispense 200 μL de BM fresco ao redor, mas não dentro do recesso central da placa 3D Petri. Além disso, colete qualquer BM restante de dentro do recesso central de semeadura de células da inserção de microwell.
    6. Dispense a suspensão de célula única (4,66 células/mL em 60 μL de BM) no recesso central da placa de Petri 3D agarose. Triturar suavemente para cima e para baixo para misturar células e garantir uma única suspensão celular no início da cultura.
    7. Coloque em uma incubadora umidificada de 35 °C para cultura. No dia seguinte, remova os 200 μL de BM ao redor da pastilha de microwell, e substitua por 1 mL de BM fresco. Isso trará o nível líquido acima do plano da inserção, submergindo toda a cultura.
    8. Lentamente e cuidadosamente remova/adicione mídia de fora da placa 3D Petri agarose. Os organoides deveriam ter compactado durante a noite, permitindo que eles descansassem na parte inferior e permitindo que as mudanças na mídia deixassem os organoides imperturbáveis.
  4. Para a cultura 3D ECM, prepare uma suspensão única celular combinando, em partes iguais, a suspensão celular em BM com ECM frio e pré-descongelado (concentração final = 2,8 x 106 células/mL).
    1. Dispense imediatamente a mistura célula-ECM em um slide de câmara de 4 poços, garantindo que a mistura cubra toda a parte inferior da placa.
    2. Coloque os slides da câmara a 35 °C em uma incubadora e deixe seu conteúdo polimerizar. Isso deve levar pelo menos 30 min. Após a polimerização, adicione 500 μL de BM no topo da cultura.
      NOTA: As células deveriam ter se agrupado para formar pequenos agregados 3D dentro das primeiras 24 horas de cultura.

4. Manutenção organoide

  1. Cultura todos os tipos de modelo organoide a 35 °C. Para todos os tipos de cultura trocam metade de suas mídias com BM fresco a cada 2 dias. Para garantir que os organoides não sejam coletados acidentalmente durante a troca de meio, colete sempre a mídia lentamente de um canto da placa de slides da câmara, e de um ponto externo fora das placas 3D Petri. Todas as mídias podem ser armazenadas a -20 °C para uso com imunoensaios ou outras análises posteriores (ou seja, quantificação de hormônios reprodutivos secretos ou citocinas).
  2. Após 7 dias na cultura, use BM contendo hormônio estimulante folículo (concentração final de 20 mIU/mL) e gonadotropina coriônica humana (concentração final 4,5 UI/mL). Isso se aplica a todos os tipos de cultura organoide.
  3. Imagem rotineira de todas as culturas organoides (ou seja, imagem de lapso de tempo) para caracterizar a formação organoide e quantificar métricas de auto-montagem, desenvolvimento e crescimento ao longo do tempo.

5. Coleta organoide

NOTA: Todos os organoides podem ser corrigidos com 4% de paraformaldeído em PBS para imunolabelação a jusante e análises histológicas. Fixar por 2h em temperatura ambiente com rotação, ou durante a noite a 4 °C.

  1. Para culturas livres de ECM 2D, primeiro enxágue a amostra com PBS fresco e, em seguida, adicione fixativo diretamente em cima dos construtos aderidos.
  2. Para métodos de cultura ECM (2D e 3D), enxágue uma vez com PBS e, em seguida, adicione fixativo diretamente na parte superior da amostra ECM-organóide (para fixar o gel ECM e organoides juntos), ou, alternativamente, pipetar suavemente os organoides para cima e para baixo para libertá-los do ECM circundante, e transferir para um tubo separado para fixação.
  3. Para a cultura 3D livre de ECM, pipeta suavemente os organoides para cima e para baixo dentro do recesso central da placa 3D Petri agarose; isso vai lavar os organoides facilitando sua fácil coleta com uma pipeta. Em seguida, transfira organoides para um tubo separado para fixação.
  4. Antes de transformar em parafina, incorpore muitos organoides (≥ 20) dentro de um pequeno volume (~ 30 μL) de gel de processamento de tecidos; isso ajuda a orientar e concentrar organoides em uma pequena área dentro de blocos de parafina, facilitando a observação ao se seccionamento e identificação visual mais fácil dentro de seções de parafina.
    NOTA: Os organoides podem ser desafiadores para identificar após a incorporação da parafina e a secção em cima de um microtome.

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Resultados

A geração organoide foi considerada sem sucesso se as células testiculares não se auto-montarem dentro de 72 h de cultura, no entanto, todos os métodos aqui apresentados se reúnem dentro de 24 horas quando se utiliza células murinas juvenis (5 dpp). Falha na geração de construções biológicas apresentada como continuação de células livremente suspensas (coluna 0 h na Figura 1) mesmo após cultura estendida (72 h). Na ausência de auto-montagem tecidual, quaisquer aglomerados celulares aparentes...

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Discussão

Com a conclusão deste protocolo de geração organoide, o usuário terá quatro técnicas de cultura diferentes disponíveis para a montagem de construtos testiculares e organoides em ambientes livres de ECM ou ECM. É importante ressaltar que todos os quatro métodos permitem ao pesquisador observar não invasivamente a automontagem organoide ao longo do tempo através de imagens de lapso de tempo ou gravação de vídeo, e coletar mídias não invasivamente condicionadas para análise de hormônios e citocinas secretados, sem perturbar...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (NICHD) F31 HD089693, instituto nacional de ciências da saúde ambiental / Centro Nacional de Promoção de Ciências Translacionais (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 e 4UH3ES029073-03, e o Professor Memorial Thomas J. Watkin.

Os autores gostariam de agradecer a Eric W. Roth por sua ajuda com a microscopia eletrônica de transmissão. Este trabalho fez uso da instalação BioCryo do NUANCE Center da Northwestern University, que recebeu apoio do Recurso Experimental de Nanotecnologia Macia e Híbrida (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); o programa MRSEC (NSF DMR-1720139) no Centro de Pesquisa de Materiais; o Instituto Internacional de Nanotecnologia (IIN); e o Estado de Illinois, através do IIN. Também fez uso do equipamento CryoCluster, que recebeu apoio do programa de ressonância magnética (NSF DMR-1229693). Os gráficos na Figura 1 foram projetados usando BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtros Estéreis de Mídia de 0.22 umMillipore Sigmascgpu05rePara meios filtrantes estéreis
3β Anticorpo primário HSDCosmo Bio CoK0607Marcador de células Leydig, diluição 1:500
AlexaFluor 568 α-MouseThermo Fisher ScientificA-21202Anticorpo secundário marcado com fluorescência
AlexaFluor 568 α-RabbitThermo Fisher ScientificA10042Anticorpo secundário marcado com fluorescência
Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific11-095-080Base do meio de cultura
Colagenase IWorthington BioLS004197Para solução de dissociação 1
Matriz de membrana Corning Matrigel,354234 CorningMatriz extracelular usada para fundição de géis de cultura ECM 2D e 3D
Contador de células Countess Contador de célulasThermo Fisher ScientificC10227Contador de células autmatadas (máquina de hemacitômetro)
Lâminas de Câmara de Contagem de Células CountessThermo Fisher ScientificC10228Hemacytometer slide para uso com contador automatizado Countess
DDX4 anticorpo primárioAbcam138540Marcador de espermatogônia, diluição 1:500
Desoxirribonuclease I (2,280 u/mgDW)Worthington BioLS002140Para solução de dissociação 1
DPBS 1X, + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182Para reconstituir Hialuronidase
Dulbecco's Fosfato Tampolado Salino + Ca / + MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embryo Grade H2OMIllipore SigmaW1503Para reconstituir Collagenase I
Soro Bovino FetalThermo Fisher Scientific16000044Para sequenciar soluções de dissocação enzimática
Folículo hormônio estimulanteAbcamab51888Para cultura organoide de longo prazo
Gonadotrofina coriônica humanaMillipore SigmaC1063Para cultura organoide de longo prazo
Hialuronidase, de testículos bovinosMillipore SigmaH4272Para solução de dissociação 2
de imunoabsorção enzimática de inibina BAnsh LabsAL-107Kit ELISA de
inibina BSubstituição de Soro KnockOutThermo Fisher Scientific10828-028Fonte de soro para meios basais
MicroTissues 3D Placa de Petri micro-moldes esferoides (matriz 24-35, 5x7)Millipore SigmaZ764051Para fabricação de organoides 3D ECM-Free
Nunc, Sistema de Slides de Câmara Lab Tek II, 4-wellThermo Fisher Scientific12-565-7Para cultura 2D sem ECM, e 2D, 3D ECM
Penicilina/EstreptomicinaThermo Fisher Scientific15-140-122Antibiótico para mídia
Richard-Allan Scientific; Histogel, gel de processamento de espécimesThermo Fisher ScientificHG-4000-012Para auxiliar na incorporação de parafina
SOX9 anticorpo primárioMillipore SigmaAB5535Sertoli Marker, diluição 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Criador)Teklad Global2920Ração para ratos sem fitoestrogênios
Tedklad Global Mouse Chow (Manutenção)Teklad Global2916Alimento para ratos sem fitoestrogênios
Ensaio de imunoabsorção enzimática de testosteronaCalbiotechTE373SKit ELISA de testosterona
Solução azul de tripano, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061para contagem de células
&alfa;SMA anticorpo primárioMillipore SigmaA2547marcador peritubular, diluição de 1:500
β Anticorpo primário de cateninaBD Biosciences610154marcador de citoplasma de Sertoli, diluição 1:100
sem LDEV Ensaio

Referências

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