Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Summary

Aqui, são descritos quatro métodos para a geração de organoides testiculares testiculares de células testiculares neonatais primárias, ou seja, matriz extracelular (ECM) e ambientes de cultura 2D e 3D livres de ECM. Essas técnicas possuem múltiplas aplicações de pesquisa e são especialmente úteis para estudar desenvolvimento testicular e fisiologia in vitro.

Abstract

Organoides testiculares fornecem uma ferramenta para estudar desenvolvimento testicular, espermatogênese e endocrinologia in vitro. Vários métodos foram desenvolvidos para criar organoides testiculares. Muitos desses métodos dependem da matriz extracelular (ECM) para promover a montagem de novos tecidos, no entanto, há diferenças entre métodos em termos de morfologia biomimética e função dos tecidos. Além disso, há poucas comparações diretas de métodos publicados. Aqui, uma comparação direta é feita estudando diferenças nos protocolos de geração organoide, com resultados fornecidos. São descritos quatro métodos de geração arquetípica: (1) cultura ECM 2D, (2) ECM 2D, (3) 3D ECM livre e (4) cultura ECM 3D. Foram utilizados três benchmarks primários para avaliar a geração organoide testicular. São células de automontagem celular, inclusão de grandes tipos celulares (sertoli, Leydig, germes e células peritubulares) e arquitetura de tecido compartimentalizada adequadamente. Dos quatro ambientes testados, culturas 2D ECM e 3D sem ECM geraram organoides com morfologias internas mais semelhantes aos testículos nativos, incluindo a compartimentação de novo dos tipos de células tubulares versus intersticiais, o desenvolvimento de estruturas semelhantes a túbulos e uma função endócrina estabelecida a longo prazo. Todos os métodos estudados utilizaram suspensões de células testiculares murinas não variadas e utilizaram recursos culturais comumente acessíveis. Essas técnicas de geração organoide testicular fornecem um kit de ferramentas altamente acessível e reprodutível para iniciativas de pesquisa sobre organogênese testicular e fisiologia in vitro.

Introduction

Organoides testiculares são uma técnica pioneira para estudar desenvolvimento testicular, espermatogênese e fisiologia in vitro^1,2,,3,4. Vários métodos têm sido explorados para a geração organoide; estes incluem uma variedade de sistemas de cultura extracelular (ECM) e sem ECM, tanto em orientações bidimensionais (2D) quanto tridimensionais (3D). Diferentes métodos de geração podem promover estratégias distintas de montagem celular; isso resulta em um alto nível de variabilidade morfológica e funcional entre modelos organoides publicados. O ....

Protocol

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade northwestern, e todos os procedimentos foram realizados sob protocolos aprovados pela IACUC.

1. Preparação de soluções enzimáticas de dissociação de tecidos

1. Use duas soluções enzimáticas diferentes (Solução 1 e Solução 2), ambas feitas utilizando uma solução média de cultura basal (BM).
2. Para preparar bm, adicione soro e penicilina-estreptomicina ao mínimo essencial de concentrações médias para finais de 10% e 1% respectivamente (ver Tabela de Materiais para reagentes especí....

Results

A geração organoide foi considerada sem sucesso se as células testiculares não se auto-montarem dentro de 72 h de cultura, no entanto, todos os métodos aqui apresentados se reúnem dentro de 24 horas quando se utiliza células murinas juvenis (5 dpp). Falha na geração de construções biológicas apresentada como continuação de células livremente suspensas (coluna 0 h na Figura 1) mesmo após cultura estendida (72 h). Na ausência de auto-montagem tecidual, quaisquer aglomerados celulares aparentes.......

Discussion

Com a conclusão deste protocolo de geração organoide, o usuário terá quatro técnicas de cultura diferentes disponíveis para a montagem de construtos testiculares e organoides em ambientes livres de ECM ou ECM. É importante ressaltar que todos os quatro métodos permitem ao pesquisador observar não invasivamente a automontagem organoide ao longo do tempo através de imagens de lapso de tempo ou gravação de vídeo, e coletar mídias não invasivamente condicionadas para análise de hormônios e citocinas secretados, sem perturbar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtros Estéreis de Mídia de 0.22 um	Millipore Sigma	scgpu05re	Para meios filtrantes estéreis
3β Anticorpo primário HSD	Cosmo Bio Co	K0607	Marcador de células Leydig, diluição 1:500
AlexaFluor 568 α-Mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21202	Anticorpo secundário marcado com fluorescência
AlexaFluor 568 α-Rabbit	Thermo Fisher Scientific	A10042	Anticorpo secundário marcado com fluorescência
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific	11-095-080	Base do meio de cultura
Colagenase I	Worthington Bio	LS004197	Para solução de dissociação 1
Matriz de membrana Corning Matrigel,	354234 Corning		Matriz extracelular usada para fundição de géis de cultura ECM 2D e 3D
Contador de células Countess Contador de células	Thermo Fisher Scientific	C10227	Contador de células autmatadas (máquina de hemacitômetro)
Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess	Thermo Fisher Scientific	C10228	Hemacytometer slide para uso com contador automatizado Countess
DDX4 anticorpo primário	Abcam	138540	Marcador de espermatogônia, diluição 1:500
Desoxirribonuclease I (2,280 u/mgDW)	Worthington Bio	LS002140	Para solução de dissociação 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl	Thermo Fisher Scientific	14040182	Para reconstituir Hialuronidase
Dulbecco's Fosfato Tampolado Salino + Ca / + Mg	Thermo Fisher Scientific	14040117	PBS
Embryo Grade H2O	MIllipore Sigma	W1503	Para reconstituir Collagenase I
Soro Bovino Fetal	Thermo Fisher Scientific	16000044	Para sequenciar soluções de dissocação enzimática
Folículo hormônio estimulante	Abcam	ab51888	Para cultura organoide de longo prazo
Gonadotrofina coriônica humana	Millipore Sigma	C1063	Para cultura organoide de longo prazo
Hialuronidase, de testículos bovinos	Millipore Sigma	H4272	Para solução de dissociação 2
de imunoabsorção enzimática de inibina B	Ansh Labs	AL-107	Kit ELISA de
inibina BSubstituição de Soro KnockOut	Thermo Fisher Scientific	10828-028	Fonte de soro para meios basais
MicroTissues 3D Placa de Petri micro-moldes esferoides (matriz 24-35, 5x7)	Millipore Sigma	Z764051	Para fabricação de organoides 3D ECM-Free
Nunc, Sistema de Slides de Câmara Lab Tek II, 4-well	Thermo Fisher Scientific	12-565-7	Para cultura 2D sem ECM, e 2D, 3D ECM
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15-140-122	Antibiótico para mídia
Richard-Allan Scientific; Histogel, gel de processamento de espécimes	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	Para auxiliar na incorporação de parafina
SOX9 anticorpo primário	Millipore Sigma	AB5535	Sertoli Marker, diluição 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Criador)	Teklad Global	2920	Ração para ratos sem fitoestrogênios
Tedklad Global Mouse Chow (Manutenção)	Teklad Global	2916	Alimento para ratos sem fitoestrogênios
Ensaio de imunoabsorção enzimática de testosterona	Calbiotech	TE373S	Kit ELISA de testosterona
Solução azul de tripano, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	para contagem de células
&alfa;SMA anticorpo primário	Millipore Sigma	A2547	marcador peritubular, diluição de 1:500
β Anticorpo primário de catenina	BD Biosciences	610154	marcador de citoplasma de Sertoli, diluição 1:100