Métodos modificados para carregamento de placas de extração de DNA de alto rendimento reduzem o potencial de contaminação

Summary

Os métodos atuais de carregamento de placas de 96 poços para extrações de DNA podem ser propensos à contaminação. Detalhamos um novo método para carregar placas de 96 poços que reduz o risco de contaminação cruzada entre os poços. Nosso método ajudará outros pesquisadores a capitalizar a eficiência das técnicas de extração de DNA de alto rendimento e minimizar o risco de contaminação.

Abstract

Técnicas de sequenciamento de DNA de alto rendimento contribuíram substancialmente para avanços na nossa compreensão das relações entre comunidades microbianas, características de hospedagem e funções ecossistêmicas mais amplas. Com esse rápido aumento na amplitude e profundidade das capacidades de sequenciamento vieram métodos para extrair, amplificar, analisar e interpretar o DNA ambiental com sucesso com a máxima eficiência. Infelizmente, a realização de extrações de DNA rapidamente pode vir ao custo de aumentar o risco de contaminação entre as amostras. Em particular, extrações de alto rendimento que são baseadas em amostras contidas em uma placa de 96 poços oferecem um método relativamente rápido, em comparação com extrações de tubo único, mas também aumentam as oportunidades de contaminação cruzada bem-para-bem. Para minimizar o risco de contaminação cruzada entre as amostras, mantendo os benefícios das técnicas de extração de alto rendimento, desenvolvemos um novo método para carregar amostras ambientais em placas de 96 poços. Usamos filmes de vedação PCR perfurantes para cobrir cada placa enquanto carregamos amostras e adicionamos amostras primeiro aos tubos PCR antes de movê-las para poços; juntas, essas práticas reduzem o risco de deriva amostral e carregamento duplo não intencional de poços. O método descrito neste artigo fornece aos pesquisadores uma abordagem para maximizar as técnicas disponíveis de extração de alto rendimento, reduzindo o risco de contaminação cruzada inerente a placas de 96 poços. Fornecemos um esboço detalhado passo a passo de como passar da coleta de amostras para a extração de DNA, minimizando o risco de contaminação cruzada indesejada.

Introduction

Os recentes avanços no sequenciamento de alto rendimento das comunidades microbianas estão fornecendo profundidade de sequenciamento sem precedentes e, consequentemente, um vislumbre não precedente do funcionamento e da diversidade do microbioma da Terra¹. À medida que a capacidade de multiplex mais e mais amostras em uma única pista de sequenciamento aumenta, a extração de DNA de um único tubo tem o potencial de se tornar um passo limitante na geração de dados ecológicos. No entanto, novos métodos em extrações de DNA de alto rendimento prometem processar grandes quantidades de amostras ambientais com maior eficiência do que já foi possível^{anteriormente 2}. Esses métodos geralmente envolvem o uso de placas de 96 poços em vez de tubos únicos, aumentando assim o possível número de extrações que podem ocorrer simultaneamente. Assim, a praticidade e eficiência dos métodos de extração de alto rendimento são evidentes e foram implementadas para o processamento de amostras ambientais que vão desde o solo^3,,4 e tecidos vegetais^3,,5 até a matéria fecal humana².

Embora esses métodos possam acelerar drasticamente ao longo do processamento de amostras e extração de DNA, a etapa inicial de carregar o solo e outras amostras ecológicas em placas de 96 poços é suscetível à contaminação de amostras cruzadas. Esse tipo de contaminação bem-a-poço pode ocorrer durante as extrações de DNA^6,,7,,8, e os poços são particularmente vulneráveis nesta primeira etapa antes que as amostras sejam suspensas em uma solução tampão. McPherson et al.⁹ demonstram um método para carregar solos de rizosfera em placas de 96 poços usando funis e tampas de tiras PCR de 8 poços, mas embora seu método seja uma abordagem mais controlada para carregar placas, ainda fornece ampla oportunidade para contaminação de poços vizinhos ao carregar cada amostra. Além disso, os poços abertos permitem a chance de um pesquisador distraído colocar uma amostra no poço incorreto ou adicionar uma amostra em um poço que já foi carregado. Além disso, uma variedade de tipos de amostra se mostram inadequados para o carregamento com este método; amostras molhadas muitas vezes grudam nos funis e amostras secas 'saltam' entre poços devido à eletricidade estática.

Para reduzir as oportunidades de contaminação entre os poços na primeira etapa de extrações de DNA de alto rendimento, desenvolvemos uma nova abordagem para carregar amostras de solo em placas de 96 poços. Nossos métodos protegem os poços da exposição ambiental e nos impedem de carregar acidentalmente várias amostras em um poço (carregamento duplo). Acreditamos que o método relatado abaixo oferece a promessa de reduzir o potencial de contaminação e, como tal, fornece um meio mais controlado para carregar placas de 96 poços para extração subsequente de DNA.

Protocol

1. Banco de laboratório e preparação de ferramentas para carregar uma placa de 96 poços

1. Banco claro por neblina com 70% de etanol. Limpe e deixe o ar secar antes de pulverizar a parte superior do banco com 10% de alvejante. Limpe a parte de cima do banco seca.
2. Esterilizar micro-scoopula, espátula e tesoura cirúrgica (curvada) mergulhando em 95% de etanol e, em seguida, expor a uma chama. Mergulhe cada um em 10% de alvejante e deixe secar o ar antes de usar.
   NOTA: As ferramentas devem ser esterilizadas entre cada amostra.

2. Sub-amostragem e preparação da amostra

1. Esterilizar luvas utilizando etanol antes da sub-amostragem.
2. Homogeneize minuciosamente as amostras do solo antes da subamostra.
3. Utilizando ferramentas esterilizadas, carregue um tubo de centrífuga de 2 mL rotulado com amostra até aproximadamente metade do total.
4. Repita o passo 2.2 até que todas as 95 amostras tenham sido subamostradas em tubos de centrífugas de 2 mL rotulados. O poço⁹⁶ deve ser usado como uma extração em branco.
   NOTA: As etapas 2.3 e 2.4 são feitas para minimizar o espaço de armazenamento necessário e para evitar uma amostragem excessiva ou dupla.
5. Armazene tubos de subfíria de 2 mL no gelo até o carregamento da placa.
6. Etiqueta 96 tubos PCR de tampa plana de 200 μL A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. Coloque esses tubos em ordem em um rack de 96 poços.
7. Atribua um ID de amostra com uma localização de poço (A1\u2012H12) e grave-o.

3. Preparação da placa

1. Retire a tampa de borracha da placa de 96-bem(Figura 1A-1C) e coloque-a em um saco plástico estéril (ver Tabela de Materiais). Sele o saco plástico para evitar contaminação.
2. Cubra a placa de 96 poços com filme de vedação(Figura 1D-1E); por exemplo, use um filme de vedação perfurante pré-cortado (veja a tabela de materiais). Certifique-se de vedação rodando com um rolo de borracha.
   NOTA: Tapetes de silicone perfurados poderiam potencialmente oferecer uma opção reutilizável, desde que limpeza apropriada entre os usos, mas os tapetes de silicone que testamos facilmente se dividem ao longo dos piercings e não ofereceriam proteção igual a quaisquer placas seguintes.
3. Coloque a placa na geladeira (4 °C) para manter a calma.

4. Transferência de subamostras

NOTA: Veja a etapa 4.13 para modificações quando a amostra do solo for muito pequena.

1. Coloque 24 das subamostras de 2 mL em um bloco de gelo para armazenamento a frio.
2. Usando o nome da amostra e a folha de localização do poço, escolha o tubo PCR de tampa plana correto de 200 μL.
3. Pegue um tubo de subfísia de 2 mL e vórtice para ~5 s para garantir a homogeneização.
4. Utilizando as ferramentas esterilizadas de chama e alvejante carregam ~200 μL da primeira amostra no tubo PCR de tampa plana correta(Figura 1F).
5. Repetir as etapas 4.2\u20124.4 até que todas as 24 amostras tenham sido carregadas. Em seguida, passar para o passo 4.6.
6. Usando uma limpeza de papel alvejada, limpe a parte externa do tubo PCR de tampa plana de 200 μL.
7. Inverta o tubo e toque no banco para mover a amostra para cima do tubo. Com uma tesoura branqueada e esterilizada por chamas, corte a parte inferior do tubo PCR para criar uma abertura para que a amostra caia na placa de 96 poços(Figura 1G).
8. Localize o poço correto em uma placa de 96 poços e passe o tubo através da placa com a extremidade cortada voltada para cima até chegar tão bem. Incline a placa ligeiramente para facilitar a puncturação do filme de vedação perfurante pré-cortado, e somente quando o tubo estiver diretamente acima do bem correto inverta-o cuidadosamente para que a ponta de corte se encaixe no poço. Usando ferramentas esterilizadas, toque na parte superior do tubo PCR até que todo o solo tenha caído do tubo para o poço. Deixe o tubo dentro do poço com tampa fechada(Figura 1H-1J).
9. Remova um tubo PCR de 200 μL de tampa plana de cada vez e adicione 750 μL de solução de contas a esse poço(Figura 1K). Empurre o tubo PCR de tampa plana de 200 μL todo o caminho até o poço e marque a parte superior com sharpie para indicar que este poço foi carregado. Repita isso para cada amostra.
10. Uma vez adicionadas todas as 24 amostras e adicionadas soluções de contas, remova os tubos de subamostra de 2 mL e substitua por 24 tubos não amostrados.
11. Repetir as etapas 4.1\u20124.10 até que todos os 95 poços tenham sido carregados com amostra ou solução em branco e contas. Remova os tubos sem passá-los sobre poços abertos(Figura 1L).
12. Remova cuidadosamente o filme perfurado e substitua a tampa de borracha para proteger a placa até o início da extração(Figura 1M-1O).
13. Para quantidades muito pequenas de solo que também são de grãos finos, adicione 750 μL de solução de contas ao tubo de amostra e use uma ponta de pipeta de furo largo para transferir todo o conteúdo para o poço apropriado. Coloque o tubo PCR na abertura para evitar o carregamento duplo.
    NOTA: Tenha cuidado ao implementar esta modificação como material orgânico particulado ou pequenos fragmentos de rocha maiores do que o furo da ponta pipeta pode entupir a pipeta e dificultar a transferência da pasta amostral.
14. Conforme necessário congelar a -20 °C e armazenar placas carregadas com amostra e solução de contas até a extração planejada.

5. Comparação dos métodos de carregamento de placas

NOTA: Para verificar nosso novo método de carregamento de placas de extração de DNA de 96 poços, dividimos uma única placa de 96 poços em três seções. Utilizamos três métodos diferentes de carregamento de placas para comparar potencial para carregamento não intencional de solo e contaminação cruzada. Os três métodos utilizados foram os métodos descritos em McPherson et al.⁹, o protocolo padrão de carregamento¹⁰da Qiagen, e o protocolo que delineamos nesta publicação.

1. Carregando terra na placa
   1. Selá uma placa de 96 poços em três blocos de quatro colunas. Carregue cada bloco usando um dos três métodos mencionados acima.
   2. Coloque o solo em todos os outros poços para que a amostra e os poços em branco sejam escalonados. Este arranjo permite a oportunidade máxima de carregamento inadvertido de amostras e contaminação cruzada.
   3. Congele a placa de 96 poços a -20 °C até a extração do DNA.
2. Extração de DNA
   1. Extrair DNA de acordo com o protocolo de extração de placas de 96 poços do fabricante¹⁰.
   2. Armazene os extratos de DNA a -20 °C até uma análise mais aprofundada.
3. Quantificação do DNA em poços em branco
   1. Descongele extratos de DNA à temperatura ambiente, vórtice e gire para baixo usando um rotador de placas.
   2. Medir e registrar concentrações de DNA de poços em branco usando um espectrofotômetro.
   3. Use o teste pós-hoc de ANVOA e Tukey para analisar diferenças na concentração média de DNA em poços em branco.
      NOTA: Diferenças significativas foram relatadas em α = 0,05.

Results

Este novo método foi usado com sucesso para carregar placas de extração de DNA de 96 poços. A comparação dos métodos de carregamento de placas mostrou que nosso método tem a menor concentração de DNA nos poços em branco. A concentração de DNA nos poços em branco foi significativamente menor do que o método proposto pelo meu McPherson et al.⁹ (p < 0,05), embora as concentrações de DNA em nosso método não fossem estatisticamente diferentes do método padrão de Qiagen(Figura 2<...

Discussion

Este método reduz as oportunidades de contaminação cruzada bem--a-bem ao carregar placas de extração de amostras de alto rendimento e oferece um meio mais controlado para carregar placas de 96 poços além das estratégias de carregamento de placas existentes^9,,10. A contaminação entre poços pode ser mais difundida em extrações de placas de 96 poços do que em extrações de tubo único, especialmente quando automatizada^6,,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
2 mL tubos de centrífuga	Fisherbrand	05-408-129
200 µ L tubos de micro-PCR	Thermo Scientific	AB 2000
Kit de extração de DNA PowerSoil de 96 poços	Qiagen	12955-4	Usamos um kit de extração de solo, mas qualquer kit de formato de 96 poços funcionaria.
Bloco de gelo para tubos de centrífuga de 2 mL	Qualquer	Qualquer	bloco de gelo feito para tubos de 2 mL funcionará
Bloco de gelo para 200 µ L tubos de micro-PCR	Qualquer	Qualquer	bloco de gelo feito para 200 µ L tubos funcionarão
Micro scoopula	Qualquer	Qualquer
Filme de Vedação Perfurável Pré-cortado	Espátula Excel Scientific	XPS25
	Qualquer	Qualquer
Tesoura Cirúrgica	Qualquer	Qualquer