Uso de neurônios hipocampais primários para estudar a montagem de segmentos iniciais de Axon

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para estudar quantitativamente a montagem e estrutura dos segmentos iniciais de axônio (AIS) de neurônios hipocampais que carecem de AIS pré-montada devido à ausência de um anquilírin-G gigante.

Resumo

Os segmentos iniciais do axônio neuronal (AIS) são locais de iniciação de potenciais de ação e têm sido extensivamente estudados para sua estrutura molecular, montagem e plasticidade dependente da atividade. Ankyrin-G gigante, o principal organizador do AIS, associa-se diretamente com os canais de adesão de tensão de tensão de membrana (VSVG) e canais de potássio (KCNQ2/3), bem como neurofascina de 186 kDa, uma molécula de adesão celular L1CAM. Ankyrin-G gigante também se liga e recruta moléculas citoplasmáticas de AIS, incluindo beta-4-spectrin, e as proteínas de ligação de microtúbulos, EB1/EB3 e Ndel1. Anquilo-G gigante é suficiente para resgatar a formação de AIS em neurônios deficientes de ankyrin-G. Ankyrin-G também inclui um isoform menor de 190 kDa localizado em espinhos dendráticos em vez da AIS, que é incapaz de atingir a AIS ou resgatar o AIS em neurônios deficientes de ankyrin-G. Aqui, descrevemos um protocolo usando neurônios hipocampais cultivados de camundongos ANK3-E22/23-flox, que, quando transfectados com Cre-BFP exibem perda de toda a isóforme de ankyrina-G e prejudicam a formação de AIS. Combinado um sistema de co-cultura Banker glia/neuron modificado, desenvolvemos um método para transfetar neurônios anquilino-G nulos com um plasmídeo ankyrin-G-GFP de 480 kDa, o que é suficiente para resgatar a formação de AIS. Utilizamos ainda um método de quantificação, desenvolvido por Salzer e colegas para lidar com a variação da distância AIS dos corpos de células neuronais que ocorre nas culturas de neurônios hipocampais. Este protocolo permite estudos quantitativos da montagem de novo e comportamento dinâmico da AIS.

Introdução

O segmento inicial do axônio está localizado no axônio proximal na maioria dos neurônios vertebrados. Funcionalmente, a AIS é onde os potenciais de ação são iniciados devido à alta densidade de canais de sódio fechados por tensão nesta região. AIS de alguns neurônios excitatórios também são alvo de interneurônios inibitórios através da formação de sinapses GABAérgicas^1,2,3. Portanto, a AIS é um local crítico para integrar a sinalização celular e modular a excitabilidade dos neurônios. A IS tem normalmente 20-60 μm de comprimento e está localizada dentro de 20 μm do corpo celu....

Protocolo

NOTA: Este método de cultura de neurônios hipocampais de camundongos pós-natal ank3-E22/23^f/f é adaptado do sistema de cocultura glia/neurônio de Gary Banker. Por isso, é fundamental realizar todas as etapas após a dissecção em um capô limpo usando ferramentas esterilizadas. Este protocolo leva até 1 mês. O fluxo de trabalho é exibido na Figura 3. O protocolo segue as diretrizes animais da Universidade Duke.

1. Preparação de tampas e pratos de revestimento neuronal

1. Pelo menos uma semana antes do dia da cultura, a carga cobre as manchas no rack de deslizamento de tampas e mergulhá-l....

Resultados

Um conjunto completo de experimentos deve incluir apenas a transfecção cre-BFP como controle negativo, Cre-BFP mais 480 kDa co-transfecção ankyrin-G como controle positivo e uma condição não transfectada como controle técnico. No controle somente do Cre-BFP, os neurônios transfectados não possuem o acúmulo de marcadores AIS, incluindo ankyrin-G (ankG), beta4-spectrin (β4), neurofascina (Nf) e canais de sódio fechados de tensão (VSVG)(Figura 4A)¹⁶. Em contraste, os neu.......

Discussão

A montagem da AIS é organizada por 480 kDa ankyrin-G. No entanto, ankyrin-G tem isóformes mais curtos que podem atingir a AIS de neurônios tipo selvagem, o que pode levar à dificuldade de interpretação das análises estrutura-função do conjunto AIS. Aqui apresentamos um método utilizando neurônios de camundongos ANK3-E22/23-flox que permite o estudo da montagem de novo da AIS. Transfeciando com Cre-BFP em 3 div, eliminamos todas as isoformas endógenas de ankyrin-G. Também poderíamos co-transfeito 480 kDa.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10xHBSS	Thermo Fisher Scientific	14065-056
18mm lamínula (1.5D)	Fisher Scientific	12-545-84-1D
190kDa anquirina-G-GFP	Addgene	#31059
2.5% Tripsina sem fenol vermelho	Thermo Fisher Scientific	14065-056
480kDa anquirina-G-GFP	feito em laboratório	Fornecer mediante solicitação
Camundongos ANK3-E22/23f/f JAX		Nº de estoque: 029797	B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
Suplemento sem soro B27	Thermo Fisher Scientific	A3582801
Ácido bórico	Sigma-Aldrich	B6768
Filtro de células com malha de 70 mm	BD Biosciences	352350
Suporte para coloração de lamínula de cerâmica	Thomas Scientific	8542E40
Cre-BFP	Addgene	#128174
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995073
GlutaMAX-I suplemento	Thermo Fisher Scientific	A1286001
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668030
MEM com Earle' s sais e L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	11095-080
Meio Neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103-049
Ácido nítrico 70%	Sigma-Aldrich	225711
Opti-MEM I Meio Soro Reduzido	Thermo Fisher Scientific	31985062
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122
Cloridrato de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	26124-78-7
Hidróxido de potássio	Sigma-Aldrich	1310-58-3