É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Uso de neurônios hipocampais primários para estudar a montagem de segmentos iniciais de Axon

4.8K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/61411

⸱

12 de fevereiro de 2021

 , 
1School of Basic Medical Sciences, Xi'an Jiaotong University, 2Department of Cell Biology, Duke University, 3Department of Biochemistry, Duke University

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para estudar quantitativamente a montagem e estrutura dos segmentos iniciais de axônio (AIS) de neurônios hipocampais que carecem de AIS pré-montada devido à ausência de um anquilírin-G gigante.

Resumo

Os segmentos iniciais do axônio neuronal (AIS) são locais de iniciação de potenciais de ação e têm sido extensivamente estudados para sua estrutura molecular, montagem e plasticidade dependente da atividade. Ankyrin-G gigante, o principal organizador do AIS, associa-se diretamente com os canais de adesão de tensão de tensão de membrana (VSVG) e canais de potássio (KCNQ2/3), bem como neurofascina de 186 kDa, uma molécula de adesão celular L1CAM. Ankyrin-G gigante também se liga e recruta moléculas citoplasmáticas de AIS, incluindo beta-4-spectrin, e as proteínas de ligação de microtúbulos, EB1/EB3 e Ndel1. Anquilo-G gigante é suficiente para resgatar a formação de AIS em neurônios deficientes de ankyrin-G. Ankyrin-G também inclui um isoform menor de 190 kDa localizado em espinhos dendráticos em vez da AIS, que é incapaz de atingir a AIS ou resgatar o AIS em neurônios deficientes de ankyrin-G. Aqui, descrevemos um protocolo usando neurônios hipocampais cultivados de camundongos ANK3-E22/23-flox, que, quando transfectados com Cre-BFP exibem perda de toda a isóforme de ankyrina-G e prejudicam a formação de AIS. Combinado um sistema de co-cultura Banker glia/neuron modificado, desenvolvemos um método para transfetar neurônios anquilino-G nulos com um plasmídeo ankyrin-G-GFP de 480 kDa, o que é suficiente para resgatar a formação de AIS. Utilizamos ainda um método de quantificação, desenvolvido por Salzer e colegas para lidar com a variação da distância AIS dos corpos de células neuronais que ocorre nas culturas de neurônios hipocampais. Este protocolo permite estudos quantitativos da montagem de novo e comportamento dinâmico da AIS.

Introdução

O segmento inicial do axônio está localizado no axônio proximal na maioria dos neurônios vertebrados. Funcionalmente, a AIS é onde os potenciais de ação são iniciados devido à alta densidade de canais de sódio fechados por tensão nesta região. AIS de alguns neurônios excitatórios também são alvo de interneurônios inibitórios através da formação de sinapses GABAérgicas1,2,3. Portanto, a AIS é um local crítico para integrar a sinalização celular e modular a excitabilidade dos neurônios. A IS tem normalmente 20-60 μm de comprimento e está localizada dentro de 20 μm do corpo celular. O comprimento e a posição da AIS variam em neurônios entre regiões cerebrais, bem como em diferentes estágios de desenvolvimento do mesmo neurônio4,5. Evidências acumuladas sugerem que a composição e a posição da AIS são dinâmicas na resposta à mudança da atividade neuronal4,5,6,7.

480 kDa ankyrin-G é o principal organizador da AIS. 480 kDa ankyrin-G é uma proteína adaptadora associada à membrana que se liga diretamente aos canais de sódio fechados de tensão, bem como outras proteínas AIS importantes, incluindo beta4-spectrina, KCNQ2/3 canais que modulam a atividade do canal de sódio8,9e 186 kDa neurofascina, uma L1CAM que direciona as sínteses GABAergic para o AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G compartilha domínios de ankyrina canônica encontrados na pequena isoforma ankyrin-G de 190 kDa (se repete ANK, domínio vinculante de espectros, domínio regulatório), mas são distinguidos por uma exon gigante que é encontrada apenas em vertebrados e é expressa especificamente em neurônios(Figura 1A)11,12. O domínio específico do neurônio ankyrin-G de 480 kDa (NSD) é necessário para a formação AIS12. O ankyrin-G de 190 kDa não promove a montagem AIS ou o alvo AIS em neurônios ankyrin-G-null12. No entanto, 190 kDa ankyrin-G está concentrado na AIS contendo 480 kDa ankyrin-G12. Esta habilidade do ankyrin-G de 190 kDa para atingir a AIS pré-montada de neurônios do tipo selvagem tem sido uma fonte de confusão na literatura e retardou a apreciação das funções especializadas críticas do ankyrin-G de 480 kDa na montagem AIS. Portanto, é fundamental estudar a montagem da AIS em neurônios anquilo-G-nulos que carecem de uma AIS pré-montada.

Aqui, apresentamos um método para estudar a montagem e estrutura do AIS utilizando neurônios hipocampais cultivados de camundongos ANK3-E22/23-flox que elimina todas as isoformas de ankyrin-G13 (Figura 1B). Ao transfetar neurônios com uma construção Cre-BFP antes da AIS ser montada, geramos neurônios deficientes ankyrin-G completamente sem uma AIS (Figura 1B, Figura 2). A montagem da AIS é totalmente resgatada após a co-transfecção de 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid com um plasmídeo Cre-BFP. Este método fornece uma maneira de estudar a montagem AIS em um ambiente AIS não pré-montado. Também modificamos o sistema de cocultura glia-neurônio de Gary Banker sem o uso de antibióticos, previamente projetado para o dia 18 neurônios embrionários, para aplicação aos neurônios do camundongo pós-natal e adaptamos um método de quantitação AIS para medições médias de AIS de múltiplos neurônios para normalizar a variação de AIS14,15.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

NOTA: Este método de cultura de neurônios hipocampais de camundongos pós-natal ank3-E22/23f/f é adaptado do sistema de cocultura glia/neurônio de Gary Banker. Por isso, é fundamental realizar todas as etapas após a dissecção em um capô limpo usando ferramentas esterilizadas. Este protocolo leva até 1 mês. O fluxo de trabalho é exibido na Figura 3. O protocolo segue as diretrizes animais da Universidade Duke.

1. Preparação de tampas e pratos de revestimento neuronal

  1. Pelo menos uma semana antes do dia da cultura, a carga cobre as manchas no rack de deslizamento de tampas e mergulhá-lo em ácido nítrico (70% W/W) durante a noite (pode ser estendido por dias).
  2. Lave as tampas tratadas com ácido nítrico com água destilada em um shaker de baixa velocidade em um frasco de vidro 2 vezes, 1 hora cada.
  3. Incubar tampas em KOH saturado dissolvido em 100% etanol durante a noite. Adicione KOH ao etanol até que ele não seja mais dissolvido.
  4. Repita o passo de lavagem com água destilada. As tampas de enxágüe com 100% de etanol uma vez por 10 minutos.
  5. Transferir tampas do rack para um béquer de vidro. Cubra o béquer com papel alumínio. Asse assar tampas em forno de 225 °C durante a noite para esterilizar as tampas. (As manchas podem ser armazenadas no béquer por semanas).
  6. Coloque as tampas em uma placa de Petri e, em seguida, aplique 3-4 pontos de cera no deslizamento de cobertura para servir como pés. Use uma pipeta Pasteur para mergulhar em cera fervida em uma garrafa de vidro. Em seguida, toque rapidamente no deslizamento de cobertura para criar um ponto. Uma placa de Petri de 60 mm pode conter 4 tampas. Uma placa de Petri de 10 mm pode conter ~10 tampas.
  7. 2 dias antes do dia da cultura, as tampas do casaco (o lado com os pontos de cera) com filtro esterilizado 1 mg/mL de poli-l-lisina em 0,1 M de ácido bórico (pH 8,5) por um mínimo de 6 horas e enxágüe com água 2 vezes, 1 hora cada vez. Os coverlips permanecem na mesma placa de Petri.
  8. Adicione meio de revestimento (MEM suplementado com glicose 0,6% (wt/vol) e 10% (vol/vol) serum de cavalo) às placas lentamente sem deslizamentos perturbadores. Coloque placas na incubadora até o dia da cultura para os neurônios de sementes.

2. Preparando pratos alimentador de células glia (2 semanas antes do dia da cultura)

  1. Disseque o córtex de um cérebro de camundongos pós-natal de 1 dia e retire as meninges.
  2. Pique o tecido do córtex o mais fino possível com uma tesoura limpa em uma placa de Petri limpa em um banco limpo.
  3. Transfira o tecido picado em 12 mL de HBSS e adicione 1,5 mL de trippsina de 2,5% e 1% (wt/vol) DNase. Incubar em um banho de água de 37 °C por 15 minutos, gire a cada 5 minutos. Tecido bem digerido fica pegajoso e forma um grande aglomerado. Triturar 10-15 vezes com uma pipeta de 10 mL para quebrar o tecido e obter melhor digestão.
  4. Triturar o tecido bem digerido 10-15 vezes com uma pipeta de 5 mL até que a maioria dos pedaços desapareça e o meio fique nublado. Passe por um coador de células para remover os pedaços restantes e adicione 15 mL de glia média (Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com glicose (0,6% wt/vol), 10% (vol/vol) serum de cavalo e penicilina-estreptomicina (1x) para parar a digestão.
  5. Centrifugar as células a 120 x g por 5 minutos e aspirar o supernasce. Resuspend a pelota celular com glia fresca média e semente em pratos de cultura celular (cerca de 105 células/cm2).
  6. Substitua o meio por meio glia fresco no dia seguinte para remover células nãoectadas.
  7. Alimente os pratos glia a cada 3-4 dias com meio glia fresco. Bata o frasco 5-10 vezes com uma mão para desalojar células frouxamente ligadas antes de mudar de meio.
  8. Após 10 dias de cultura, as células glia devem ser quase confluentes. Desprender células glia com 0,25% de trippsin-EDTA e sementes cerca de 105 células em um novo prato de cultura celular de 60 mm. As células remanescentes podem ser congeladas para uso futuro.
  9. 3 dias antes do dia da cultura, mude o meio de cultura média glia para o neurônio (Neurobasal-A Medium com 1x GlutaMAX-I e 1x suplemento B27).

3. Cultura de neurônios hipocampais

NOTA: Todas as etapas são realizadas em temperatura ambiente.

  1. Disseque 6-8 hipocampi de filhotes pós-natais de 1 dia de idade de ratos ANK3-E22/23f/f com meio HBSS em uma placa de Petri na sala temperada. Pique o hipocampi com uma tesoura de dissecção em pedaços menores. Transfira hipocampi da placa de Petri para um tubo de 15 mL.
  2. Lave hipocampi 2x com 5 mL de HBSS no tubo. Deixe o hipocampi em 4,5 mL de 1x HBSS após a lavagem.
  3. Adicione 0,5 mL de trippsina de 2,5% em 4,5 mL de HBSS e incubar em um banho de água de 37 °C por 15 minutos. Inverta o tubo a cada 5 minutos. Hipocampi bem digerido deve ficar pegajoso e formar um aglomerado. Se necessário, amplie a digestão por mais 5 minutos.
  4. Lave o hipocampi com HBSS 3 vezes por 5 minutos cada. Não use um vácuo para remover o HBSS. É muito fácil remover o hipocampi.
  5. Adicione 2 mL de HBSS após a lavagem e pipeta o hipocampi para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur 15 vezes.
  6. Triturar o tecido com uma pipeta Pasteur polida com fogo (o diâmetro do aberto é reduzido pela metade) 10 vezes. Não vá além de 10 vezes, mesmo que ainda haja pedaços restantes. A sobressalagem mata neurônios.
  7. Descanse o tubo por 5 minutos até que todos os pedaços fiquem no fundo. Use suavemente uma ponta de pipeta de 1 mL para transferir o supernasciante contendo os neurônios dissociados para pratos de revestimento (105 células/60 mm de prato). Adicione-o diretamente ao meio de chapeamento pré-incubado e agite a placa suavemente.
  8. Repita o passo 3.6-3.7 com os pedaços restantes até que a maioria dos pedaços tenham desaparecido.
  9. 2-4 horas após a semeadura, verifique os pratos de revestimento com um microscópio leve. A maioria dos neurônios deveria ter ligado ao deslizamento. As células anexadas são redondas e brilhantes. Deslizes de flip usando uma ponta fina fórceps para os pratos alimentador de células glia com meio de cultura neuronal pré-condicionado com os pontos de cera de lado voltados para baixo.
  10. Os neurônios podem crescer nos pratos alimentador de células glia por até 1 mês. Alimentar neurônios a cada 7 dias com 1 mL de meio de cultura neuronal fresca.
  11. Passo opcional: 1 semana após a semeadura, adicione citose arabinoside (1-β-D-arabinofuranosylcytosine) a uma concentração final de 5 μM para conter a proliferação glial.

4. Interrupção da AIS por Nocaute de Ankyrin-G em estágio anterior do desenvolvimento de neurônios

  1. Em 3 div (dia in vitro),vire as tampas com pontos de cera de lado voltados para um prato alimentador de células glia com meio de cultura neuronal condicionada.
  2. Misture 0,25 μg de DNA Cre-BFP com 0,5 μg de DNA ankyrin-G-GFP (WT/mutante) em um tubo de 1,7 mL para transfectar 4 tampas (~ 2:1 proporção do número de cópia de DNA). Adicione 100 μL de meio de cultura (por exemplo, Opti-MEM), misture e descanse em um rack. Se apenas o Cre-BFP for transfeinado, a espinha dorsal plasmida GFP é usada para corresponder à quantidade total de DNA.
  3. Misture 3 μL de reagente de transfecção (por exemplo, Lipofectamina 2000) (~ 3 vezes de DNA) com 100 μL de cultura média em um novo tubo de 1,7 mL. Incubar por 5 minutos na RT.
  4. Misture 100 μL de solução de DNA a partir da etapa 4.2 com 100 μL de reagente de transfecção a partir da etapa 4.3. Descanse por 5-10 minutos em um rack.
  5. Adicione 50 μL de mistura de DNA a partir da etapa 4.4 em cima de cada mancha de cobertura, inserindo a ponta logo abaixo do meio sem tocar nas tampas. Pipeta lentamente para evitar a propagação da mistura de DNA.
  6. Leve lentamente o prato de volta para a incubadora e incubar por 30-45 minutos.
  7. Vire as tampas de volta para o prato alimentador de glia caseiro com pontos de cera de lado voltado para baixo e coloque o prato de volta para a incubadora.

5. Quantificação do segmento inicial do axônio

  1. Fixar neurônios em 7-10 div e manchar com marcador AIS seguindo o protocolo padrão de imunocitoquímica para a proteína de interessante.
  2. Colete imagens fluorescentes com microscopia desejada.
    1. Pegue seções da série Z para coletar o sinal de toda a AIS. Mantenha a mesma profundidade Z para todas as fotos.
    2. Ajuste a intensidade do laser para atingir o melhor alcance dinâmico de intensidade de pixel.
    3. Certifique-se de que todas as fotos AIS sejam tiradas na mesma configuração de microscópio.
    4. Verifique sempre o sinal de Cre-BFP.
  3. Quantificação AIS
    1. Imagem aberta com Fiji (https://fiji.sc).
    2. Gere projeção máxima de imagens da série Z.
    3. Subtraia o sinal de fundo de deslizamento de tampas vazio da imagem.
    4. Desenhe uma linha ao longo da AIS. A largura da linha deve cobrir totalmente o AIS. Inicie a linha antes que o sinal AIS seja levantado acima do plano de fundo e pare depois que ele cair para o fundo.
    5. Meça a intensidade média do pixel sozinha a linha e exporte para uma planilha (~10-15 AISs são necessárias).
    6. Gere a curva média de intensidade da AIS usando o script MATLAB adaptado de Berger et al.15.
    7. Para cada experimento, inclua apenas cre e Cre mais wildtype 480 kDa neurônios transfectados como controles negativos e positivos para garantir que o nocaute da AIS seja eficiência e o resgate seja bem sucedido.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Um conjunto completo de experimentos deve incluir apenas a transfecção cre-BFP como controle negativo, Cre-BFP mais 480 kDa co-transfecção ankyrin-G como controle positivo e uma condição não transfectada como controle técnico. No controle somente do Cre-BFP, os neurônios transfectados não possuem o acúmulo de marcadores AIS, incluindo ankyrin-G (ankG), beta4-spectrin (β4), neurofascina (Nf) e canais de sódio fechados de tensão (VSVG)(Figura 4A)16. Em contraste, os neu...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A montagem da AIS é organizada por 480 kDa ankyrin-G. No entanto, ankyrin-G tem isóformes mais curtos que podem atingir a AIS de neurônios tipo selvagem, o que pode levar à dificuldade de interpretação das análises estrutura-função do conjunto AIS. Aqui apresentamos um método utilizando neurônios de camundongos ANK3-E22/23-flox que permite o estudo da montagem de novo da AIS. Transfeciando com Cre-BFP em 3 div, eliminamos todas as isoformas endógenas de ankyrin-G. Também poderíamos co-transfeito 480 kDa...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Gary Banker por sugestão sobre o protocolo de cultura neuronal. Este trabalho é apoiado pelo Howard Hughes Medical Institute, uma bolsa do NIH, e um professor dotado de George Barth Geller (V.B.).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10xHBSSThermo Fisher Scientific14065-056
18mm lamínula (1.5D)Fisher Scientific12-545-84-1D
190kDa anquirina-G-GFPAddgene#31059
2.5% Tripsina sem fenol vermelhoThermo Fisher Scientific14065-056
480kDa anquirina-G-GFPfeito em laboratórioFornecer mediante solicitação
Camundongos ANK3-E22/23f/f JAXNº de estoque: 029797B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
Suplemento sem soro B27Thermo Fisher ScientificA3582801
Ácido bóricoSigma-AldrichB6768
Filtro de células com malha de 70 mmBD Biosciences352350
Suporte para coloração de lamínula de cerâmicaThomas Scientific8542E40
Cre-BFPAddgene#128174
D-GlucoseSigma-AldrichG7021
DMEMThermo Fisher Scientific11995073
GlutaMAX-I suplementoThermo Fisher ScientificA1286001
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668030
MEM com Earle' s sais e L-glutaminaThermo Fisher Scientific11095-080
Meio NeurobasalThermo Fisher Scientific21103-049
Ácido nítrico 70%Sigma-Aldrich225711
Opti-MEM I Meio Soro ReduzidoThermo Fisher Scientific31985062
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122
Cloridrato de poli-L-lisinaSigma-Aldrich26124-78-7
Hidróxido de potássioSigma-Aldrich1310-58-3

Referências

  1. Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
  2. Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
  3. Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
  4. Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332(2017).
  5. Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
  6. Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
  7. Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
  8. Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
  9. Cooper, E. C. Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
  10. Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
  11. Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
  12. Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
  13. Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  15. Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
  16. Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Segmento Inicial do Ax nioAnquirina GCultura CelularTransfec oMicroscopia de Fluoresc nciaQuantifica o de ImagensLocaliza o ProteicaDiferencia o NeuronalMontagem do AIS
Uso de neurônios hipocampais primários para estudar a montagem de segmentos iniciais de Axon
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.