Methylation Specific Multiplex Droplet PCR usando dispositivo gerador de gotícula de polímero para diagnósticos hematológicos

Summary

Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem de glóbulos brancos (WBC) através da quantificação dos padrões de metilação de DNA. Este protocolo apresenta um método de reação em cadeia de polimerase de gotícula multiplex (mdPCR) usando um dispositivo microfluido baseado em elastômero termoplástico (TPE) para geração de gotículas permitindo quantificação de alvo específica e multiplex específica da contagem diferencial WBC.

Abstract

Um fluxo de trabalho de gotícula multiplexada PCR (mdPCR) e um protocolo detalhado para determinar a contagem diferencial de células brancas baseadas em epigenética (WBC) são descritos, juntamente com um dispositivo de geração de gotículas microfluida (TPE) termoplástico. Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem WBC que é de importante valor prognóstico em diferentes doenças. Isso é conseguido através da quantificação dos padrões de metilação de DNA de regiões específicas ricas em CG no genoma (CpG loci). Neste artigo, o DNA tratado por bisulfita de células mononucleares de sangue periféricos (PBMCs) é encapsulado em gotículas com reagentes mdPCR, incluindo primers e sondas fluorescentes de hidrólise específicas para loci de CpG que se correlacionam com sub-populações WBC. A abordagem multiplex permite o interrogatório de muitos locis de CpG sem a necessidade de reações mdPCR separadas, permitindo uma determinação paramétrica mais precisa das subsépas WBC usando análise epigenética de locais de metilação. Essa quantificação precisa pode ser estendida a diferentes aplicações e destaca os benefícios para o diagnóstico clínico e prognóstico subsequente.

Introduction

A análise da composição dos glóbulos brancos (WBCs) está entre os exames laboratoriais mais solicitados em diagnósticos hematológicos. A contagem diferencial de leucócitos serve como um indicador para um espectro de doenças, incluindo infecção, inflamação, anemia e leucemia, e está sendo investigada como um biomarcador prognóstico precoce para várias outras condições também. O padrão-ouro na subtipagem WBC envolve a imunostenção e/ou citometria de fluxo, ambos que requerem anticorpos fluorescentes caros e propensos à instabilidade e são muitas vezes altamente dependentes da proficiência do operador na preparação da amostra. Além disso, este método é aplicável apenas a....

Protocol

Todos os experimentos realizados neste estudo envolvendo amostras humanas foram aprovados pelo Conselho de Ética do NRC e foram feitos de acordo com as políticas do NRC que regem os sujeitos humanos que seguem as diretrizes de pesquisa aplicáveis e estão em conformidade com as leis em Québec, Canadá.

1. Preparação celular

1. Descongele as células mononucleares de sangue periféricos congelados (PBMCs) imediatamente colocando o criovial em um banho de água a 37 °C por 5 min.
2. Inverta o criovial duas vezes para resususpensar suavemente as células e usando uma pipeta de 1 mL transfira a suspensão da célula em um tubo cônico de 1....

Results

O dispositivo gerador de gotícula microfluida baseado em TPE foi fabricado usando o protocolo descrito, conforme mostrado na Figura 1. Uma máscara de transparência foi usada na fotolitografia para obter o mestre de silício (Si). A litografia suave foi realizada para obter uma réplica inversa do Mestre Si, que foi então usada para fabricar o molde epóxi. O precursor epóxi foi derramado no PDMS e curado para cruzar e endurecer. Este molde, representando a réplica exata do mestre Si foi mais re.......

Discussion

O protocolo experimental apresentado e os métodos permitem o mdPCR interno usando um gerador de gotícula TPE fabricado, um cicloviário térmico e microscópio de fluorescência. O dispositivo fabricado usando tpe macio para ligação TPE oferece propriedades de superfície hidrofóbica que são uniformes em todas as paredes do canal, de tal forma que o dispositivo final não requer qualquer tratamento de superfície para uso subsequente como gerador de gotículas. Este material tem sido rotineiramente empregado em plataformas de po.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201	tubo
RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroSurfactante	Fluoro-surfactante
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, Reino Unido		Câmera
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		Usado para análise
Nikon, Japão		10x objetiva
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
Fisher, Canadá
Vitrocom, NJ, EUA	5015 e 5010	Tubo
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, Japão	LC-L1V5	DEL Fonte
Dolomita	3200063	Tubo fluídico descartável
	3200302	Tubo fluídico
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		Microscópio
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schä rding, Áustria
Zymo Research, Irvine, CA	D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, Suíça		SU-8 fotorresistente
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Alemanha
Imagem J		Usado para avaliar o diâmetro
Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, EUA		Lâmpada
Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC	DE1010
Hexpol TPE, Å må l, Suécia		Elastômero termoplástico (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Japão		Usado para aquisição
3M, St Paul, MN		Óleo
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	Coloração azul fluorescente de células vivas (DAPI)
IDEX Saúde & Ciência, Oak Harbor, WA	P-881	PEEK acessórios
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, USA	ARV 310
Ihc world, Maryland, EUA	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA	2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Alemanha
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	484431
Bio-Rad, Mississauga, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON
Nikon, Melville, NY			invertido
Nikon, Japão
Loctite	AA 352