Validação farmacológica da inibição pré-pulso da resposta de sobressalto em larvas de peixe-zebra usando um sistema e software automatizados comerciais

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo que utiliza sistemas automatizados disponíveis comercialmente para validar farmacologicamente o ensaio de inibição pré-pulso (PPI) em larvas de peixe-zebra.

Resumo

Embora haja uma abundância de sistemas e softwares automatizados comerciais e padronizados para realizar o ensaio de inibição pré-pulso (PPI) em roedores, até onde sabemos, todos os ensaios de PPI realizados no peixe-zebra foram, até agora, feitos usando sistemas personalizados que estavam disponíveis apenas para grupos individuais. Isso tem apresentado desafios, particularmente no que diz respeito a questões de reprodutibilidade e padronização de dados. No presente trabalho, geramos um protocolo que utiliza sistemas automatizados disponíveis comercialmente para validar farmacologicamente o ensaio de IBP em larvas de peixe-zebra. Consistente com os achados publicados, fomos capazes de replicar os resultados de apomorfina, haloperidol e cetamina na resposta PPI de larvas de peixe-zebra 6 dias após a fertilização.

Introdução

A larva do peixe-zebra (Danio rerio) é uma candidata adequada para modelar doenças psiquiátricas, como a esquizofrenia (revisada por Gawel et ^al.1) devido às inúmeras vantagens que possui. Isso inclui um genoma totalmente sequenciado com 70% de homologia de sequência com ortólogos humanos², existência de ferramentas genéticas diretas e reversas para manipular o genoma e identificar a contribuição de um determinado gene para o desenvolvimento ou doença³ e a presença dos principais neurotransmissores humanos / roedores no cérebro do peixe-zebra⁴. Há disponibilidade de vários domínios neurofenotípicos no peixe-zebra, como ansiedade, aprendizado e memória³. A transparência óptica e a sensibilidade às principais classes de drogas neurotrópicas a tornam uma candidata ideal de escolha para manipulações farmacológicas e triagem fenotípica de drogas ^5,6.

Para realizar a triagem de drogas de alto rendimento, a automação e a presença de um endofenótipo robusto são muito importantes⁷. Por exemplo, uma variedade de técnicas de registro automático foram desenvolvidas para medir o comportamento das larvas do peixe-zebra, como tigmotaxia, resposta de sobressalto, resposta optocinética, resposta optomotora, habituação, captura de presas, comportamento de sono/vigília, comportamento locomotor e vários outros⁶. Embora alguns laboratórios desenvolvam sistemas personalizados para medições e análises automatizadas de alguns desses comportamentos, existem sistemas de imagem e software disponíveis comercialmente 8,9,10,11. A inibição de pré-pulso (PPI), uma forma de bloqueio sensório-motor em que a resposta de sobressalto é reduzida quando um estímulo fraco não surpreendente é apresentado brevemente antes do estímulo surpreendente, tem sido usado como um endofenótipo para estudar a esquizofrenia em modelos animais (revisado por^12,13). Além disso, a resposta acústica de sobressalto (ASR) e o IBP têm desempenhado papéis úteis no estudo da audição e da função auditiva em modelos animais, incluindo o peixe-zebra^14,15. A larva de peixe-zebra exibe um C-start característico em resposta a um estímulo surpreendente inesperado que é diminuído por um estímulo mais fraco chamado pré-pulso. O C-start tem sido descrito há muito tempo como um comportamento de fuga controlado por populações distintas de células neurais e foi completamente caracterizado nas larvas de peixe-zebra 15,16,17.

Há uma abundância de sistemas e softwares automatizados comerciais e padronizados para a realização do ensaio PPI em roedores 18,19,20. No entanto, até onde sabemos, todos os ensaios de PPI realizados no peixe-zebra até agora foram feitos usando sistemas personalizados que estão disponíveis apenas para os grupos individuais 15,16,21,22. Isso apresenta desafios para alcançar a reprodutibilidade e replicabilidade dos dados no que diz respeito à padronização²³.

Recentemente, um fornecedor conhecido na comunidade de peixe-zebra desenvolveu uma configuração incorporada com uma câmera rápida e complementos de gerador de PPI para realizar o ensaio de PPI em larvas de peixe-zebra²⁴. A câmera grava a 1000 quadros por segundo, o que permite a gravação de comportamentos de ação rápida, como o C-start, enquanto o gerador de PPI permite a entrega controlada pelo usuário de vários estímulos acústicos para evocar uma resposta de sobressalto²⁴. Aqui, combinamos o sistema acima mencionado com um pacote de software abrangente disponível comercialmente projetado para a análise automatizada de comportamentos complexos¹¹, para gerar um protocolo para a realização de ensaios de resposta PPI em larvas de peixe-zebra. Validamos farmacologicamente a resposta do IBP usando 1) apomorfina, um agonista da dopamina conhecido por causar déficits no IBP; 2) haloperidol, um antagonista da dopamina e antipsicótico conhecido por aumentar o IBP e 3) cetamina, um antagonista do receptor NMDA conhecido por modular o IBP.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo sistema de supervisão e aplicação da Administração de Animais Experimentais da Autoridade Norueguesa de Segurança Alimentar (FOTS-18/106800-1).

1. Criação de peixe-zebra

1. Estabelecer acasalamentos de unidades populacionais de peixe-zebra macho e fêmea adultas (Danio rerio) do tipo selvagem, mantidas em condições normais²⁵ da noite anterior. Aqui, a cepa Tupfel de barbatana longa (TL) é usada.
2. Remova as barreiras na manhã seguinte e deixe acasalar através da desova natural.
3. Colete os ovos dos tanques de acasalamento.
4. Remova os ovos não fertilizados e outros detritos, transfira os ovos para placas de Petri (n = 60) e levante-os em uma incubadora a 28 ° C em meio embrionário: 1,5 mM HEPES, pH 7,6, 17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgSO4 e 0,18 mM Ca(NO3)₂.
5. Renovar metade do meio embrionário e remover as larvas mortas diariamente até 6 dpf.
   NOTA: Todos os experimentos foram realizados em larvas individuais aos 6 dias pós-fertilização (dpf).

2. Agentes farmacológicos e pré-tratamento de larvas

1. Dissolva a apomorfina e a cetamina em meio E3 para fazer soluções estoque de 500 μM e 10 mM, respectivamente.
2. Dissolva o haloperidol em dimetilsulfóxido (DMSO) a 100% para fazer uma solução estoque de 10 mM. A concentração final de DMSO utilizada foi de 0,1%.
3. Use 0,1% de DMSO e meio E3 como controles do veículo.
4. Utilizar as seguintes concentrações finais de fármacos: 10 mg/mL de apomorfina, 1 mM de cetamina e 20 μM de haloperidol¹⁶.
5. Pré-exponha as larvas dos grupos apomorfina e cetamina por 10 min e os grupos de controle veicular haloperidol e DMSO por 20 min¹⁶.

3. Configuração antes do teste de comportamento

1. No dia do experimento, transfira as larvas e todos os materiais relevantes para a sala do experimento. Regular a sala experimental a uma temperatura de 27 ± 1 °C.
2. Certifique-se de que o ruído de fundo na câmara de teste seja o mais baixo possível, de preferência não superior a 45 dB de nível de pressão sonora (SPL).
   1. Instale o microfone do sonômetro do medidor de decibéis (dB) na câmara de teste (a abertura para instalação já está furada pelo fabricante).
   2. Para reduzir o ruído de fundo na sala, isole a câmara de teste com uma cabine de som personalizada (consulte a Figura 1B para obter uma visão geral da configuração).
3. Prepare uma placa de 96 poços para o teste de inibição pré-pulso.
   NOTA: A câmera de vídeo tem uma resolução de 2048 × 500 pixels, o que significa que apenas um máximo de 3 pistas (33 poços) podem ser fotografados por vez.
   1. Use uma placa de acrílico personalizada de formato de 96 poços para reduzir a interferência de sombras.
      NOTA: As medidas para a placa personalizada podem ser encontradas no seguinte site: https://zenodo.org/record/3739378#.XooyLW5uKas
4. Com o auxílio de uma pipeta de transferência, transferir 310 μL de solução/meio de exposição com uma larva para cada poço.
5. Calibre e meça a intensidade do estímulo usando o botão de volume do amplificador estéreo e um medidor de decibéis, respectivamente.
6. Registre a intensidade máxima do som na seção "referência de nível".

4. Parâmetros de estímulo e aquisição de vídeo

1. Ligue o computador, o amplifier sistema e o medidor de dB (consulte a Figura 1A para obter uma visão geral da configuração).
2. Use o botão de volume girando-o para o mínimo ou máximo para ajustar a intensidade do som.
   1. Verifique o nível de som com o medidor de dB a cada vez, o botão de volume é ajustado. Isso é importante para encontrar a intensidade sonora máxima e mínima que pode ser produzida pela configuração.
      NOTA: O medidor de dB calcula a saída RMS dB para o estímulo. O sistema gera o som dentro dos componentes sólidos da câmara de teste, mantendo a placa firme enquanto produz uma vibração no plano horizontal de todo o suporte da placa.
      1. Ajuste o botão de volume para o máximo, meça a intensidade do som com o medidor de dB e use este valor.
3. Na interface do gerador de PPI, defina os parâmetros: intervalo interestímulo representado como Delay; intervalo entre tentativas representado como tempo delta de aquisição; duração do pré-pulso etc.
   1. Para testes de pré-pulso sozinhos, certifique-se de que a "Amplitude" ou Duração do estímulo para os parâmetros de sobressalto sejam definidos como zero e vice-versa para ensaios de sobressalto sozinhos.
4. Para gerar uma lista de avaliação, selecione Adicionar > dar um nome à avaliação. Por exemplo, "Prepulse 50 dB sozinho".
   NOTA: Pode-se gerar quantos testes desejar, mas tome cuidado com o tamanho da lista, pois isso pode travar o programa.
   1. Intercale ensaios de pré-pulso com ensaios de pulso isolados em todos os experimentos de PPI usando uma ordem pseudoaleatória. Quando vários estímulos são apresentados em um experimento, um intervalo entre tentativas (ITI) de 30 s é usado.
      NOTA: Neste estudo, foram utilizados estímulos de sobressalto (pulso) de 100 ms de 660 Hz e estímulos de pré-pulso de 5 ms de 440 Hz. Para experimentos PPI, o intervalo entre estímulos (ISI) foi de 100 ms.
5. Para salvar o protocolo, selecione Arquivo > Salvar como.
6. Ajustar as condições de iluminação na câmara de ensaio do seguinte modo.
   1. Inicie a computação de medição USB, selecione saída analógica e vá para D/A OUT O (P13) para fazer alterações na iluminação. Um valor zero significa que não há luz, enquanto aumenta o valor D/A OUT O, aumenta a intensidade da luz na caixa. A intensidade de luz de 100 foi usada para todos os experimentos.
7. Configurar a câmera
   1. Inicie o software e aguarde o carregamento da câmera.
   2. Selecione Ajustes (encontrados no lado direito) e defina a taxa de quadros de aquisição para 1.000 e clique em aplicar para efetuar a alteração.
8. Aclimate as larvas a uma câmara de teste 100% iluminada por luz por 5 minutos antes do início dos experimentos.
9. Para iniciar um experimento, selecione o menu Experimento no gerador de PPI, clique em Executar e selecione o formato do poço (por exemplo, 33 poços).
   1. Certifique-se sempre de que o software da câmera seja iniciado com as configurações corretas antes de executar um experimento.
   2. Adquira um vídeo de 2 s para cada tentativa.
   3. Certifique-se de que a taxa de quadros de aquisição esteja definida em 1.000.

5. Rastreamento e análise automatizados da resposta acústica de sobressalto e PPI

1. Configuração do protocolo.
   1. Inicie o software de análise (consulte a Tabela de Materiais). Escolha Novo do modelo > Aplicar um modelo predefinido e, em seguida, percorra outros menus (detalhes abaixo).
      1. Escolha o arquivo de vídeo em Fonte de vídeo.
      2. Navegue pelo arquivo de vídeo. Defina o assunto como peixe > larvas de peixe-zebra > modelo de zona (sem modelo). Especifique Número de arenas em Arenas.
      3. Especifique Número de assuntos por arena (definido como 1) em Assuntos.
      4. Selecione Detecção de ponto central, ponto de nariz e base da cauda em Recursos rastreados (consulte a Figura 2A,B).
         NOTA: Isso é importante para calcular o ângulo do corpo da resposta C-start (consulte a Figura 2C).
      5. Clique em Nome > salvar como. As unidades usadas são mm, s, graus para distância, tempo e rotação, respectivamente.
         NOTA: Lembre-se de usar a mesma unidade para calibrar a balança.
   2. Escolha a configuração da Arena.
      1. Clique em Capturar imagem de fundo.
      2. Siga as etapas no menu à direita (em caso de dúvida, use o menu Ajuda ).
      3. Escolha a ferramenta de desenho de círculo para desenhar as arenas.
   3. Escolha Configurações de controle de avaliação > criar um novo nome >.
   4. Escolha Configurações de detecção, siga as etapas no menu à direita.
      1. Defina a taxa de amostragem para 25. Escolha configurações avançadas de detecção. Em Método, selecione subtração dinâmica, modelo avançado/peixe adulto, defina a cor do assunto em comparação com o plano de fundo como Mais escuro e mova o controle deslizante para definir o contraste da larva.
      2. Sob o contorno do sujeito, selecione erodir primeiro, depois dilatar e aumentar os valores de erosão e dilatação do contorno até que o animal seja completamente detectado.
   5. Salve o protocolo e use para análises subsequentes de vídeos PPI adquiridos.
2. Configuração da lista de avaliações.
   1. Escolha a lista de testes, defina variáveis independentes, como ID larval, tratamento, tipo de estímulo, etc. Selecione o caminho dos vídeos e defina uma lista de testes para aquisição em lote.
3. Configuração de aquisição.
   NOTA: Se uma lista de teste tiver sido gerada, pode-se realizar uma aquisição em lote dos vídeos.
   1. Se algumas faixas forem perdidas, use o editor de trilhas para ajustar os recursos rastreados.
   2. Exclua da análise os erros de rastreamento que permanecem não resolvidos após o uso do editor de trilhas.
   3. Defina o perfil de suavização da trilha para 1 mm para diminuir o ruído dos dados. Isso pode ser ajustado com base na atividade de fundo das larvas.
4. Configuração de análise.
   1. Para selecionar ensaios a serem analisados, escolha Perfis de dados e defina as trilhas com base na variável independente de interesse.
      NOTA: Se os componentes estiverem ocultos, clique no símbolo do olho no canto superior direito para exibir.
      1. Filtre partes dos ensaios a serem analisados (por exemplo, com base no tratamento ou no tipo de grupo de estímulo).
      2. Selecione parte das trilhas a serem analisadas (aninhamento). Para este estudo, os dados foram aninhados para faixas entre o início do estímulo e 100 ms após o início do estímulo.
      3. Lembre-se de conectar todos os filtros e caixas de aninhamento com linhas de seta para completar a instrução.
   2. Defina as variáveis dependentes a serem analisadas, selecione Perfis de análise e especifique as variáveis de interesse (foco em Corpo em variáveis dependentes).
      NOTA: Se os componentes estiverem ocultos, clique no símbolo do olho no canto superior direito para exibir.
      1. Clique duas vezes em Ângulo do corpo. Selecione a dobra absoluta. Percorra as configurações de teste e selecione máximo e clique em adicionar.
   3. Clique duas vezes no estado do ângulo do corpo. Defina o intervalo de média para 5 amostras. Defina o limite do ângulo de dobra. Para calcular estatísticas para dobrado, percorra Estatísticas de teste e selecione latência para primeiro > adicionar. Repita as etapas até que os limites variados sejam obtidos (entre 20–80° foi usado) e nomeie de acordo.
   4. Geração de estatísticas e gráficos.
      1. Escolha análise > resultados > estatísticas e gráficos e clique em calcular.
      2. Certifique-se de que os perfis de dados e análise estejam definidos para o modelo correto, pois vários modelos podem ser criados em cada seção.
   5. Exporte estatísticas de teste e grupo como arquivos de planilha para processamento e análise.

6. Análise dos dados

1. Abra o arquivo de planilha que contém as estatísticas do teste.
2. Selecione as colunas Ângulo do corpo, Grau máximo, Latência dobrada (dos vários limites do ângulo do corpo).
3. Considere cada mudança no ângulo do corpo ≥ 30° dentro de uma latência de corte de 50 ms após o início do estímulo como uma resposta positiva de início C (ou seja, um respondedor); aqueles com < ângulo corporal de 30° não respondem.
4. De forma binária, atribua 1 a uma larva que responde e 0 a larvas que não respondem para cada placa.
   1. Conte o número total de larvas respondedoras e não respondedoras para cada placa. Calcule os respondedores (%) em cada caso calculados como (número de larvas respondendo/número total de larvas) × 100. Exclua da análise as larvas que respondem menos de 30% ao estímulo de sobressalto¹⁶.
      NOTA: Qualquer intensidade de estímulo capaz de provocar uma resposta C-start em igual ou superior a 70% das larvas é considerada um estímulo de sobressalto adequado¹⁶.
5. Calcule %PPI como 100 × (porcentagem respondendo ao estímulo de sobressalto − porcentagem respondendo ao pré-pulso + sequência de sobressalto)/ (porcentagem respondendo ao estímulo de sobressalto)¹⁶.

7. Análise estatística

1. Apresente os dados como média ± desvio padrão, DP (consulte a Tabela de Materiais para software estatístico).
2. Determine os efeitos de intensidades de pré-pulso variáveis na resposta larval usando ANOVA unidirecional seguida de um teste post-hoc de Tukey.
3. Use ANOVA de duas vias seguida pelo teste post-hoc de Holm-Sidak para determinar os efeitos do tratamento medicamentoso na resposta % do IBP com intensidades pré-pulso variadas.

Resultados

Três experimentos foram realizados para validar o protocolo de combinação de múltiplos sistemas para analisar a inibição pré-pulso da resposta acústica de sobressalto no peixe-zebra larval. Primeiro, foi testada a capacidade de fornecer estímulos acústicos com precisão e capturar a resposta das larvas ao estímulo de sobressalto. Em seguida, foi validar a capacidade de atenuar a resposta de sobressalto quando um estímulo pré-pulso é apresentado. Finalmente, foi estabelecida a capacidade de detectar a modulação farmacológica da inibição pré-pulso da resposta de sobressalto pelas drogas apomorfina, haloperidol e cetamina.

Resposta larval do peixe-zebra a estímulos acústicos de sobressalto
Trabalhos anteriores demonstraram que as larvas de peixe-zebra exibem um início C característico quando apresentadas a estímulos acústicos surpreendentes¹⁶. A capacidade de incitar e capturar o comportamento das larvas aos estímulos de sobressalto foi testada. Observou-se que as larvas registradas exibiam a resposta C-start (Figura 2). Um estímulo de 70 dB re (100 ms, 660 Hz, Figura Suplementar 1A) foi forte o suficiente para provocar resposta em ≥70% das larvas (Figura 3A). Quando apresentado repetidamente 30 vezes em um intervalo inter-tentativa de 30 s, o estímulo de 70 dB re não resultou em habituação larval (N = 3 repetições; 16 larvas/replicação), como mostrado na Figura 3B.

Pré-pulso diminui resposta de sobressalto de larvas de peixe-zebra a estímulos acústicos
Uma infinidade de evidências mostra que os estímulos de pré-pulso modulam a resposta larval a um estímulo de sobressalto 15,21,22,26. Um paradigma de dois pulsos foi usado, onde um estímulo fraco chamado pré-pulso precedeu o estímulo indutor de sobressalto chamado pulso. Os estímulos de pré-pulso usados foram 20, 17 ou 14 dB menores do que o estímulo de pulso que foi definido em 70 dB re. O pré-pulso (5 ms, 440 Hz) foi sempre apresentado 100 ms antes do início do pulso (Figura Suplementar 1B). Cada estímulo pré-pulso testado reduziu significativamente a resposta larval ao pulso. Na Figura 4 a resposta larval (em %) aos estímulos acústicos de sobressalto é mostrada para 6 dpf TL em meio E3, N = 6 (16 larvas/grupo). A porcentagem de larvas que responderam ao estímulo de sobressalto (pulso) foi de 79,86 ± 9,772. Como esperado, quando o estímulo de sobressalto foi precedido por um pré-pulso de 50, 53 ou 56 dB, a resposta larval diminuiu para 40,87% ± 11,30%, 39,58% ± 7,345% e 29,17% ± 9,350%, respectivamente. A análise Anova unidirecional revelou uma diferença estatística no efeito do estímulo nas larvas (F (3, 48) = 57,23, P < 0,0001) com o teste de comparações múltiplas de Tukey revelando significância estatística entre os grupos com intervalo de confiança de 95%.

Modulação farmacológica da inibição do pré-pulso
Estudos anteriores mostraram que as drogas dopaminérgicas, apomorfina e haloperidol, bem como a droga glutamatérgica, cetamina, modularam significativamente a inibição do pré-pulso em larvas, assim como em seus equivalentes de mamíferos e roedores¹⁶. As concentrações para validação da configuração foram selecionadas com base nesses estudos. O intervalo interestímulo (ISI) para todos os experimentos farmacológicos foi de 100 ms.

Efeito da apomorfina na inibição do pré-pulso
Na Figura 5, as larvas pré-tratadas com 10 mg/mL de apomorfina por 10 min apresentaram uma redução geral na % PPI em comparação com as larvas de controle E3 (ANOVA de duas vias, não RM (fatores: tratamento e intensidades de pré-pulso; tratamento: F (1, 34) = 16,21, p = 0,0003; intensidade de pré-pulso: F (2, 34) = 8,674, P = 0,0009, isso mostrou uma interação não significativa: F (2, 34) = 2,514, p = 0,0959). Para investigar as diferenças com mais detalhes, o teste post-hoc de Holm-Sidak revelou diferenças significativas na resposta de sobressalto entre o controle E3 e as larvas tratadas com apomorfina nas intensidades de pré-pulso 53 (p = 0,0126) e 56 (p = 0,0044), mas não a 50 dB (p = 0,5813).

Efeito do haloperidol na inibição do pré-pulso
A Figura 6 mostra um aumento geral no %PPI em larvas pré-tratadas por 20 min com 20 μM de haloperidol em comparação com aquelas em meio E3 (ANOVA de duas vias, não RM (fatores: tratamento e intensidades de pré-pulso; tratamento: F (1, 32) = 20,75, p < 0,0001; intensidade de pré-pulso: F (2, 32) = 3,147, p = 0,0565, sem interação significativa: F (2, 32) = 0,7455, p = 0,4826). Pelo teste post-hoc de Holm-Sidak, observou-se presença de significância estatística apenas nas intensidades de pré-pulso 53 (p = 0,00489 e 56 (p = 0,0348), mas não em 50 dB (p = 0,067).

Efeito da cetamina na inibição pré-pulso
A Figura 7 mostra que, em diferentes intensidades de estímulo pré-pulso, houve diferenças na resposta de sobressalto entre as larvas controle E3 e aquelas pré-tratadas por 10 min em 1,0 mM de cetamina (ANOVA de duas vias, não RM (fatores: tratamento e intensidades de pré-pulso; tratamento: F (1, 35) = 25,46, p < 0,0001; intensidade de pré-pulso: F (2, 35) = 6,018, p = 0,0057, sem interação significativa: F (2, 35) = 0,8450, p = 0,4381). O teste post-hoc de Holm-Sidak mostrou significância apenas nas intensidades de pré-pulso de 50 (p = 0,0039) e 53 (p = 0,0027), mas não em 56 dB (p = 0,0802).

Figura 1: Aparelho de teste. (A) Visão geral da configuração do equipamento. (B) Isolamento interno do equipamento de configuração para minimizar o ruído de fundo durante os experimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise da resposta acústica de sobressalto das larvas de peixe-zebra. (A) Característica C-start exibida por 6 larvas de peixe-zebra a 6 dpf. (B) Imagem representativa das três características rastreadas sobrepostas a uma larva de 6 dpf: ponto central (vermelho), ponta do nariz (ciano) e base da cauda (roxo). (C) Imagem representativa do ângulo de curvatura absoluto exibido por uma larva do tipo selvagem TL de 6 dpf. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Determinação do limiar acústico de sobressalto. (A) Uma intensidade de estímulo de 70 dB (representada por linhas tracejadas vermelhas) é capaz de provocar uma resposta C-start em >70% das larvas (N = 33; 6 dpf TL). (B) As larvas não se habituam ao estímulo de 70 dB re apresentado 30 vezes (tentativas) em um intervalo inter-tentativas de 30 s (N = 3 repetições; 16 larvas/replicação). Os dados são apresentados como ± média S.D. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Diminuição da resposta larval induzida pelo pré-pulso (%). Estímulos pré-pulso a 20, 17 e 14 dB abaixo do estímulo de reinício de 70 dB causam uma redução no número de larvas de TL do tipo selvagem que respondem ao C-start. Todos os dados representados como média ± DP, N = 5 (16 larvas/grupo), **** p < 0,0001, significativamente diferente do estímulo de sobressalto pelo teste post-hoc de Tukey após ANOVA de uma via. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Déficits induzidos por apomorfina em %PPI. Todos os dados são apresentados como ± média DP, N = 4\u20125 (16 larvas/grupo), diferença estatisticamente significativa pelo teste post-hoc de Holm-Sidak após ANOVA de duas vias. *p = 0,0126, grupo tratado com E3 ctl/apomorfina a 53 dB; **p = 0,0044, grupo tratado com E3 ctl/apomorfina a 56 dB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Aumento induzido pelo haloperidol em %PPI. Todos os dados são apresentados como média ± DP, N = 4\u20125 (16 larvas/grupo), diferença estatisticamente significativa pelo teste post-hoc de Holm-Sidak após Anova de duas vias. **p = 0,0048, grupo tratado com DMSO ctl/apomorfina a 53 dB; *p = 0,0348, grupo tratado com DMSO ctl/apomorfina a 56 dB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Aumento induzido por cetamina em %PPI. Todos os dados representados como média ± DP, N = 4\u20125 (16 larvas/grupo), diferença estatisticamente significativa pelo teste post-hoc de Holm-Sidak após Anova de duas vias **p = 0,0039, grupo tratado com E3 ctl/apomorfina a 50 dB, **p = 0,0027, grupo tratado com E3 ctl/apomorfina a 53 dB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo Suplementar 1: Vídeo representativo de larvas exibindo um C-start em resposta a um estímulo acústico de sobressalto de 70 dB. Clique aqui para baixar este vídeo.

Figura suplementar 1: Exemplos representativos de condições de estímulo geradas usando o gerador de PPI. (A) Ensaio de estímulo isolado, (B) ensaio de inibição pré-pulso (pré-pulso + pulso), (C) ensaio sem estímulo para medir o ângulo de curvatura basal limiar de larvas não estimuladas. Clique aqui para baixar esta figura.

Discussão

É essencial validar qualquer novo sistema de ensaio comportamental com o objetivo de melhorar e refinar os protocolos de pesquisa neurocomportamental. Na presente investigação, foi avaliada a capacidade de dois sistemas e softwares disponíveis comercialmente para induzir uma resposta acústica de sobressalto em larvas de peixe-zebra e para detectar e quantificar a modulação farmacológica previamente descrita de tais comportamentos.

Uma série de modificações e solução de problemas foram realizadas para otimizar a configuração. O software padrão para análise das respostas C-start era tal que a análise prosseguia automaticamente após a aquisição dos dados de cada experimento (22 tentativas / placa constituíam um experimento). Isso reduziu o número de placas que podiam ser executadas por dia, reduzindo assim o rendimento (5 placas por dia). Para evitar essa limitação, houve a necessidade de desacoplar o software de análise do processo de coleta de dados, o que aumentou o rendimento para uma média de 10 placas por dia. Assim, a decisão de recorrer a um software de análise independente para análise não ao vivo provou ser bem-sucedida e mais eficiente. Para evitar a interferência de sombras ou outros detritos que introduzem ruído nos dados, recomenda-se encher completamente os poços com meio, remover todas as bolhas e evitar partículas de alimentos ou similares que possam ser confundidas com larvas, gerando ruído nos dados. Após a calibração dos estímulos sonoros, a intensidade máxima alcançável pelo sistema amplificador capturada pelo medidor de dB foi de 85 dB re, enquanto o ruído de fundo inicial na câmara de teste foi de 60 dB re. Isso resultou em uma janela estreita de dB para operar. Portanto, era fundamental manter o ruído de fundo o mínimo possível. Para conseguir isso, o material acústico parafon (ver Tabela de Materiais) foi usado para construir uma camada adicional de isolamento ao redor da câmara de teste e uma camada extra de isolamento usando um feixe de cabine vocal (ver Tabela de Materiais). Com essas camadas de isolamento, o ruído de fundo dentro da câmara de teste foi reduzido com sucesso dos 60 dB iniciais para 45 dB re.

Atualmente, uma vantagem dessa configuração é que todos os componentes estão disponíveis comercialmente e, como tal, não se limitam a apenas alguns laboratórios. Indivíduos com conhecimento limitado em linguagem de codificação podem usá-lo, pois o protocolo é bastante fácil de entender e seguir. Por exemplo, usando o sistema PPI, foi possível fornecer pulsos e pré-pulsos em intervalos variados entre estímulos e entre tentativas, bem como capturar respostas larvais a tais estímulos. Uma vez que esses comportamentos foram capturados, eles puderam ser classificados usando o software de análise em respondedores e não respondedores. O grupo de resposta foi categorizado como larvas que exibiram um C-start de 30° ou mais com uma latência de <50 ms. Além disso, a resposta do IBP é modulada por drogas que têm como alvo a sinalização dopaminérgica e glutamatérgica (revisada por Geyer e colegas²⁷). Consistente com estudos anteriores, a apomorfina, um agonista não seletivo do receptor de dopamina, reduziu a inibição pré-pulso da resposta de sobressalto em larvas de peixe-zebra, enquanto o haloperidol, um antagonista da dopamina, aumentou a resposta. Em larvas de peixe-zebra, a cetamina demonstrou modular o PPI diferencialmente com base na duração do ISI¹⁶. No estudo acima mencionado, o IBP larval foi aumentado em 30 ms, mas suprimido em 500 ms ISI quando pré-tratado com cetamina. Embora este estudo não tenha usado ISI variável, a observação de que a cetamina aumentou o IBP em um ISI de 100 ms o torna comparável aos dados do estudo anterior quando um ISI de 30 ms foi usado. O estudo demonstrou que, combinando esses sistemas disponíveis comercialmente, é possível realizar o ensaio de IBP e detectar de forma confiável alterações induzidas farmacologicamente na resposta de IBP das larvas de peixe-zebra. Uma limitação do sistema é que a característica de ponta do nariz rastreada pelo software de análise sempre cai em um dos olhos das larvas, criando assim um ângulo de linha de base. Para superar isso, é necessário sempre determinar o ângulo de curvatura da linha de base das larvas não estimuladas, que foi encontrado em ~ 30 ° para as larvas usadas neste estudo. Assim, formando a base para a escolha de 30 ° como o limiar do que foi considerado uma resposta positiva de C-start em larvas assustadas. Se esses pontos forem levados em consideração, deve ser possível realizar o ensaio de IBP em qualquer laboratório com acesso ao equipamento de configuração. Este artigo não se concentrou em categorizar a cinemática da resposta de sobressalto em latência curta e latência longa, conforme relatado anteriormente¹⁶, devido ao escopo da variabilidade da latência. Assim, apenas as respostas C-start <50 ms após o início do estímulo foram usadas¹⁵.

Diferenças de tensão foram relatadas para influenciar o comportamento do peixe-zebra em vários ensaios^{28 , 29 , 30 , 31} bem como influenciar a sensibilidade auditiva³² . Portanto, é essencial determinar o ângulo de curvatura da linha de base de cada deformação testada. Como as sensibilidades auditivas também podem ser diferentes, é crucial determinar as respostas de sobressalto basais, a intensidade sonora mais adequada como estímulo de pré-pulso ou sobressalto para cada tensão e em que duração o estímulo é apresentado. O ISI é outro parâmetro que deve ser cuidadosamente considerado, pois alguns medicamentos podem aumentar ou reduzir o IBP com base no intervalo entre o pré-pulso e o início do estímulo de sobressalto¹⁶. A expectativa é que os laboratórios interessados em estudar a função cognitiva, distúrbios neuropsiquiátricos e audição (função auditiva) considerem essa configuração e protocolo de IBP úteis na triagem de seus modelos farmacológicos e/ou genéticos. Este protocolo também fornece uma base para triagem de alto rendimento de bibliotecas compostas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agonista	Sigma Aldrich	A4393	dB DO AGONISTA DA DOPAMINA
	PCE INSTRUMENTS	PCE-MSM 4	Para medir a intensidade do estímulo
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	Para dissolver solutos orgânicos
Amplificador Dynavox	Dynavox	CS-PA1 MK	Para fornecer estímulos acústicos
EthoVision XT	Noldus, Países Baixos	EthoVision XT, versão 14	Software de rastreamento automatizado
GraphPad Prism	Software GraphPad	Versão 8	Software de análise estatística
Haloperidol	Sigma Aldrich	H1512	Antagonista da dopamina
	Cetamina Sigma Aldrich	Y0000450	antagonista do receptor NMDA
parofon materiais acústicos	Paroc	8528308	Ajuda a reduzir o ruído de fundo no gabinete de teste
t.akustik Vocal Booth Bundle	Thormann, Alemanha	458543	Ajuda a reduzir o ruído de fundo no gabinete de teste
ZebraBox Revo com complementos PPI	ViewPoint, França	ZebraBox Revo com complementos PPI	Inclui hardware e software