Method Article

Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

DOI:

10.3791/61434

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October 31st, 2020

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1Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 2Department of Neuroscience, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 3Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS

In This Article

Summary

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Este protocolo mostra como empregar microscopia de super-resolução para estudar a co-localização de proteínas em culturas neuronais primárias.

Abstract

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Sinapses são os elementos funcionais dos neurônios e seus defeitos ou perdas são a base de várias doenças neurodegenerativas e neurológicas. Estudos de imagem são amplamente utilizados para investigar sua função e plasticidade em condições fisiológicas e patológicas. Devido ao seu tamanho e estrutura, estudos de localização de proteínas requerem técnicas de imagem de alta resolução. Neste protocolo, descrevemos um procedimento para estudar em neurônios primários a co-localização de proteínas-alvo com marcadores sinápticos em um nível de super-resolução utilizando microscopia de iluminação estruturada (SIM). SIM é uma técnica de iluminação de luz padronizada que dobra a resolução espacial da microscopia de campo largo, atingindo um detalhe de cerca de 100 nm. O protocolo indica os controles e configurações necessários para estudos robustos de co-localização e uma visão geral dos métodos estatísticos para analisar adequadamente os dados de imagem.

Introduction

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A compreensão e visão da sinapse mudou enormemente desde sua primeira descrição por1Foster e Sherrington em 18971 . Desde então, nosso conhecimento da comunicação neuronal e dos processos moleculares por trás dela tem crescido exponencialmente2. Tornou-se claro que as sinapses podem ser consideradas como um sistema de dois compartimentos: um compartimento pré-sináptico contendo vesículas para a liberação de neurotransmissores e um compartimento pós-sináptico com receptores3. Essa visão simplista, nos últimos vinte anos, evoluiu para uma complexa rede de proteínas necessárias para transdutor de tra....

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Protocol

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1. Culturas primárias

  1. Neurônios primários hipocampais de rato de cultura em tampas câmaras (como Ibidi μ-Slide 8 Bem ou Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) que correspondem ao requisito objetivo para #1,5 (0,17 mm) de espessura de deslizamento.
  2. Tampas de câmara de revestimento com 100 μL de poli-L-lisina (100 μg/mL).
  3. No dia seguinte, lave as tampas câmara duas vezes com soro fisco estéril tamponado (PBS).
  4. Para obter neurônios primários do camundongo, isole o hipocampi dos filhotes P1-P423.
  5. Coloque hipocampi dissecado em 10 mL de Mídia de Dissecção (Tabela 1) e deixe-os depositar ....

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Results

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Apresentamos aqui o fluxo de trabalho padrão para estudar a co-localização das proteínas neuronais. Primeiro calibramos o microscópio e, em seguida, realizamos a análise sim das amostras. Para calibrar o sistema, utilizamos microesferas fluorescentes de 0,1 μm de diâmetro. Ao obter imagens 3D-SIM super resolvidas das contas, os dados de imagem subjacentes são transformados em Fourier para recon converter-nas em uma representação de frequência espacial. Na Figura 2A,o padrão de flores distint.......

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Discussion

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Elucidar a estrutura e a composição da sinapse é crucial para a compreensão dos processos fisiológicos e patológicos que regulam a memória e a cognição. Enquanto no estado normal, as sinapses são os blocos de construção da memória, elas também estão por trás de distúrbios neurológicos complexos, como a doença de Alzheimer32. O protocolo descrito aqui serve para estudar a co-localização de proteínas neuronais com uma técnica de microscopia de super resolução chamada SIM. Utilizando um padrão partic.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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Os autores agradecem a Edoardo Micotti pela crítica construtiva ao manuscrito. Este estudo foi apoiado pela BrightFocus A2019296F, por Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), pela Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) e pela Rede de Treinamento Inovador Marie Skłodowska-Curie (JK).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Solução de azul de tripano a 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061Chemical
70 µ Filtro M Corning352350Equiment
AlexaThermo Fisher AnticorpoCientífico-Anticorpo
SENP1Santa Cruzsc-271360Anticorpo
B27 SuplementoLife Technologies17504044
Químico Albumina de soro bovino Merck5470Chemical
CaCl2Merck Life Science21115
Chemical Chambered Covers,Ibidi80826Equiment
DyLightThermo FisherScientific-Antibody
FBS (Hyclone)GIBCOSH3007002 (CHA1111L)Serum
Microesferas modificadas com carboxilato FluoSpheres, 0,1 μ m, amarelo– verde fluorescenteThermo Fisher ScientificF8803Equiment
GlicoseMerck Life ScienceG8769Chemical
GlutamaxGIBCO35050061Chemical
HEPESMerck Life ScienceH3537Chemical
L-Cystein Merck Ciências da Vida C6852-25gQuímico
MAP2MerckAB15452Anticorpo
MEM Life Technologies21575022Médio
MgClMerck Life ScienceM8266Chemical
NaOHVWR International1,091,371,000Microscópio
Super Resolução Medium N-SIMNikon-Instrument
PapainMerck Life Science& nbsp;P-3125
Paraformaldeído químico Thermo Fisher Scientific28908Caneta/Strep Químico
10xLife Technologies15140122
Químico tamponado com fosfato salino Gibco10010023Chemical
Poly-L lisinaSigmaP2636Montagem
Antifade de Vidro de Diamante ProLongThermo Fisher ScientificP36970Chemical
PSD95 NeuroMabK28/43Anticorpo
Cobertura redonda de lamínulaThermo12052712Equiment
SUMO1Abcamab32058Anticorpo
Sinaptofisina Merck S5768 anticorpo
Triton X-100MerckT8787Inibidor de
tripsina química Merck Ciências da Vida T9003-500MGQuímico
de 10888022 Life Technologies

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
  2. Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
  3. McAllister, A. K.

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