Avaliando a expressão do complexo de histocompatibilidade maior classe I em neurônios hipocampais murinos primários por citometria de fluxo

Summary

Este protocolo descreve um método para a criação de neurônios hipocampais primários do cérebro de camundongos embrionários. A expressão do maior complexo de histocompatibilidade classe I na superfície extracelular dos neurônios cultivados é então avaliada pela análise citométrica de fluxo.

Abstract

O aumento das evidências sustenta a hipótese de que as interações neuroilógicas impactam a função do sistema nervoso em condições homeostáticas e patológicas. Uma função bem estudada do complexo de histocompatibilidade principal classe I (MHCI) é a apresentação de peptídeos derivados de células ao sistema imunológico adaptativo, particularmente em resposta à infecção. Mais recentemente, foi demonstrado que a expressão de moléculas de MHCI em neurônios pode modular mudanças dependentes da atividade na conectividade sináptica durante o desenvolvimento normal e distúrbios neurológicos. A importância dessas funções para a saúde cerebral sustenta a necessidade de um ensaio sensível que detecte prontamente a expressão MHCI nos neurônios. Aqui descrevemos um método para a cultura primária dos neurônios hipocampais murinos e, em seguida, a avaliação da expressão MHCI por análise citométrica de fluxo. O hipocampo murino é microdissectado de filhotes de camundongos pré-natais no dia 18. O tecido é dissociado em uma única suspensão celular usando técnicas enzimáticas e mecânicas, então cultivadas em uma mídia livre de soro que limita o crescimento de células não neuronais. Após 7 dias in vitro, a expressão MHCI é estimulada pelo tratamento de células cultivadas farmacologicamente com beta interferon. As moléculas de MHCI são rotuladas in situ com um anticorpo fluorescente marcado, em seguida, as células são não enzimaticamente dissociadas em uma única suspensão celular. Para confirmar a identidade neuronal, as células são fixadas com paraformaldeído, permeabilizado e rotulado com um anticorpo fluorescente marcado que reconhece o antígeno nuclear neuronal NeuN. A expressão MHCI é então quantificada em neurônios por análise citométrica de fluxo. Culturas neuronais podem ser facilmente manipuladas por modificações genéticas ou intervenções farmacológicas para testar hipóteses específicas. Com pequenas modificações, esses métodos podem ser usados para cultivar outras populações neuronais ou para avaliar a expressão de outras proteínas de interesse.

Introduction

O sistema nervoso central (SNC) já foi considerado desprovido de vigilância imunológica, chamado de "imuno privilegiado¹". Agora está claro que esse privilégio não equivale à ausência absoluta de componentes imunológicos, mas sim, uma regulação especializada que funciona para limitar os danos associados à imunopatologia¹. De fato, a comunicação entre o SNC e o sistema imunológico é uma conversa contínua que é necessária para o desenvolvimento saudável do cérebro e resposta às infecções^2,3.

As principais moléculas de complexo de histocompatibilidade classe I (MHCI) são proteínas transmembranas poligênicas e polimórficas mais conhecidas por sua função na apresentação de peptídeos antigênicos às células CD8⁺ T durante a infecção⁴. Os complexos clássicos de MHCI consistem em uma cadeia de α transmembrana e uma cadeia de luz extracelular, chamada β2-microglobulina. A cadeia de α contém um sulco polimórfico que une um peptídeo antigênico para apresentação⁵. A expressão adequada do MHCI na membrana extracelular requer ação coordenada de acompanhantes moleculares no retículo endoplasmático para garantir a dobra adequada da cadeia de α e β2-microglobulina, juntamente com o carregamento de um ligante de peptídeo de alta afinidade⁵. Somente uma vez montados os complexos MHCI, eles são exportados do ânticulo endoplasmático para a membrana plasmática⁶. Após o engajamento do receptor de células T cognato com o complexo MHCI carregado de peptídeo, as células CD8⁺ T mediam a matança celular liberando grânulos líticos contendo perforina e granzymes ou induzindo apoptose através do receptor Fas de ligação na membrana celular alvo⁷. Além disso, as células CD8⁺ T produzem citocinas, como o interferon gama (IFNγ) e o fator de necrose tumoral alfa (TNFα), que podem ativar mecanismos antivirais em células infectadas sem efeitos citópicos^8,9. Para muitos vírus neurotrópicos, as células CD8⁺ T são necessárias para limpar a infecção do CNS^10,11,12.

Pensava-se anteriormente que os neurônios expressam MHCI apenas sob condições de dano, infecção viral ou com estimulação de citocina in vitro. Recentemente, pesquisas identificaram um papel para a expressão neuronal do MHCI na remodelagem sináptica e plasticidade^13,14. Embora os mecanismos precisos subjacentes à regulação da sinapse não sejam bem compreendidos, os dados indicam que o nível de expressão do MHCI é regulado pela atividade sináptica^15,16. Uma hipótese afirma que os neurônios expressam receptor b (PirB) em pares de imunoglobulina, que liga o MHCI transynapticamente^13,17. Essa interação inicia uma cascata de sinalização da PirB que se opõe a caminhos envolvidos na remodelação sináptica, reforçando e estabilizando assim a conexão sináptica^17,18,19. Na ausência de atividade neuronal, a expressão MHCI diminui¹⁴, e a perda de MHCI resulta em eliminação de sinapse defeituosa e circuitos sinápticos desorganizados^20,21.

O ensaio aqui descrito, que foi adaptado de Chevalier et al.^9,utiliza análise citométrica de fluxo para avaliar quantitativamente a expressão proteica extracelular do MHCI nas culturas primárias dos neurônios hipocampais murine. Este protocolo ilustra as técnicas iniciais para microdisstar tecido hipocampal de filhotes de camundongos embrionários. Em seguida, detalha processos para dissociação enzimática e mecânica do tecido em uma única suspensão celular e métodos para manter as culturas in vitro. Como eles não se dividem, uma vez que estão na cultura, os neurônios devem ser banhados em um prato e densidade adequado para o seu ponto final experimental. Em seguida, ele descreve etapas para induzir a expressão MHCI com interferon beta (IFNβ), imunolabeling para MHCI e marcador de núcleos neuronais NeuN, e analisar células por citometria de fluxo. Por fim, descreve procedimentos para avaliar os dados de citometria de fluxo para identificar neurônios soropositivos e quantificar o nível da expressão MHCI. Também são observados neste protocolo pequenos ajustes que podem ser feitos para cultivar neurônios corticais, além ou em vez de neurônios hipocampais. Este protocolo pode ser facilmente modificado para testar hipóteses específicas usando variações genéticas ou tratamentos farmacológicos.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais laboratoriais dos Institutos Nacionais de Saúde e de acordo com os Princípios Orientadores Internacionais de Pesquisa Biomédica Envolvendo Animais. O protocolo foi aprovado pela Universidade da Carolina do Norte no Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Charlotte (Protocolo #19-020).

1. Preparando-se para a cultura

NOTA: Estes procedimentos devem ser feitos em condições estéreis em um armário de biossegurança designado pela cultura tecidual. Consulte a Tabela 1 para obter mídias e soluções.

1. Esterilizar todas as ferramentas de dissecção autoclaving em sacos de esterilização auto-vedação.
2. Prepare os estoques de poli-d-lysine para tratar 12 pratos culturais.
   1. Dissolver a poli-D-lysina em 1x tampão de borate a uma concentração de 100 μg/mL (10x concentrada). Armazene aproximadamente 1 mL a -20 °C até que seja necessário.
   2. Diluir 10x concentrado poli-D-lysine em dPBS a 10 μg/mL (1x) e esterilizar filtro.
   3. Trate placas de cultura de 12 poços com 0,5 mL por poço de 1x poli-D-lysine em temperatura ambiente por pelo menos 1 h ou durante a noite para uso no dia seguinte. Certifique-se de que o volume de poli-d-lysine é suficiente para cobrir totalmente a parte inferior da área cultural.
   4. Pouco antes do uso, remova a poli-D-lysine da placa de cultura, enxágue 3x em água estéril e mantenha em água estéril até estar pronto para as células da placa. Remova todos os traços de líquido por uma aspiração completa antes de células de revestimento.
3. Prepare a mídia de crescimento de neurônios e o buffer FACS. Filtrar esterilizar e armazenar a 4 °C até usar. A mídia de crescimento de neurônios pode ser mantida por aproximadamente 2 wks; O buffer FACS pode ser mantido por aproximadamente 4 wks.

2. Dissecando hipocampo embrionário

NOTA: Este procedimento pode ser realizado no banco, pois requer o uso de um microscópio estéreo para a remoção de meninges e microdisseção do hipocampo. Adere à técnica asséptica rigorosa para minimizar a contaminação potencial.

1. Eutanize um rato fêmea C57BL/6J grávida no dia 18 em uma câmara de CO_2.
2. Pulverize a pele abdominal e a pele com 70% de EtOH, depois belisque a pele com fórceps teciduais e faça pequena incisão com uma tesoura cirúrgica. Inciso o peritônio para expor as vísceras e útero.
3. Segure o útero com fórceps padrão padrão, levante-se da cavidade, e corte a conexão com o mesomário com uma tesoura fina. Transfira o útero com embriões para um prato de cultura plástica estéril de 100 mm colocado no gelo.
4. Usando tesouras finas e fórceps finos, corte cuidadosamente o útero e remova os sacos embrionários para liberar embriões. Transfira embriões para um novo prato de cultura plástica estéril de 100 mm contendo dPBS colocados no gelo.
5. Decapitar filhotes embrionários usando tesouras finas, e transferir cabeças para um novo prato de cultura plástica estéril de 100 mm contendo meio Hibernate-E colocado no gelo.
6. Para remover o cérebro, segure a cabeça com um par de fórceps finos em uma mão. Usando Dumont curvado #7 fórceps em outra mão, insira a ponta dos fórceps na base do crânio e belisque o osso e a pele sobrelada movendo-se anteriormente ao longo da linha média sem perfurar o cérebro.
7. Usando fórceps curvos, retire a pele e o crânio para expor o cérebro. Varrer os fórceps curvos sob o cérebro da lâmpada olfativa exposta ao cerebelo para levantar o cérebro do crânio. Transfira o cérebro para um novo prato de cultura plástica estéril de 100 mm contendo meio Hibernate-E colocado no gelo. Repita para cada cérebro.
   NOTA: Todos os cérebros podem ser coletados em um único prato de cultura, a menos que seja necessário ser separado para fins específicos do experimento.
8. Sob um microscópio de dissecção estéreo, trabalhando com um cérebro de cada vez e dois pares de fórceps estéreis de Dumont #5, beliscar lâmpadas olfativas e retirar meninges. A remoção minuciosa das meninges é necessária para evitar a contaminação cultural por outras células e permitir uma dissecção adicional.
9. Uma vez que as meninges são devidamente removidas, o lado superior do córtex abre lateralmente, o que exporá o hipocampo. Usando o #5 obúps Dumont, belisque o hipocampo longe do córtex anexado, e transfira cuidadosamente hipocampo isolado para um tubo cônico estéril de 15 mL contendo 5 mL de meio Hibernate-E no gelo.
10. Repita a dissecção para ambos os hemisférios cerebrais para cada filhote de rato embrionário e combine todos os hipocampi em um único tubo cônico de 15 mL, a menos que seja necessário separadamente para fins específicos do experimento.
    1. Para cultivar neurônios corticais, o córtex pode ser separado do subcórtex e processado de forma idêntica aos neurônios hipocampais.
       NOTA: Neste momento, o protocolo pode ser pausado. Armazene cérebros ou hipocampi dissecado em meio Hibernate-E suplementado com B27 (2%) a 4 °C por até 1 mês, embora o atraso prolongado possa comprometer o número de células viáveis.

3. Dissociar e culminar neurônios hipocampais

NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis em um armário de biossegurança designado pela cultura tecidual.

1. Prepare 0,5 mL de solução de dissociação de papain por embrião para dissociação hipocampal. O volume da solução de dissociação necessária variará dependendo do número de cérebros embrionários sendo dissecados.
   NOTA: Para a cultura do neurônio cortical, prepare 1,0 mL de solução de papain por embrião.
   1. Dissolva 20 μL de suspensão de papain por 1 mL do meio Hibernado E por vórtice por aproximadamente 3 minutos.
   2. Depois que papain for dissolvido, adicione 1 μL de DNase I por 1 mL da solução. Não vórtice a solução depois que o DNase I tiver sido adicionado, pois isso pode desativar a enzima.
2. Centrífuga tubo cônico de 15 mL contendo tecido hipocampal (passo 2.10) a 1.000 x g por 5 min. Remova o supernatante e adicione a solução papain. Resuspend o tecido invertendo várias vezes. Incubar a 37 °C por 30 min, invertendo para resuspensar o tecido a cada 10 minutos.
   1. Se cultivar neurônios corticais, transfira todos os cortices para um novo prato de cultura estéril de 100 mm, aspirar cuidadosamente a mídia da placa, e moído tecido com tesoura fina ou lâmina de barbear. Adicione a solução de papain ao prato de cultura e transfira tecido cortical com solução de papain para tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta de transferência estéril. Incubar tecido e solução enzimápica a 37 °C por 30 minutos, agitando a cada 10 minutos.
3. Durante a incubação de 30 minutos, prepare 3 pipetas pasteur de vidro polido de fogo: 1 totalmente aberto, 1 meio aberto e 1 quarto aberto.
4. Após a incubação de 30 minutos, centrifugar o tubo cônico de 15 mL contendo tecidos cerebrais digeridos a 125 x g por 10 min. Remova a solução enzimácula e substitua por um volume igual de médio hibernado E fresco.
5. Usando pipeta Pasteur totalmente aberta, triturar o tecido 10x. Deixe o tecido se contentar com 2 minutos, depois transfira a suspensão da célula supernaca para um tubo cônico estéril de 50 mL. Adicione um volume igual de hibernar e médio de volta ao tecido.
6. Usando pipeta Pasteur semiaberta, tecido triturado 10x. Deixe o tecido se contentar com 2 minutos, depois transfira a suspensão de células supernacas para o mesmo tubo cônico de 50 mL como na etapa anterior. Adicione um volume igual de hibernar e médio de volta ao tecido.
7. Usando pipeta Pasteur aberta de trimestre, tecido triturado 10x. Deixe o tecido se contentar com 2 minutos, depois transfira a suspensão de células supernacas novamente para os mesmos 50 mL cônicos como nas etapas anteriores. Descarte qualquer tecido que não tenha dissociado.
8. Centrifugar o tubo cônico de 50 mL contendo o supernascedor da suspensão celular a 125 x g por 5 min. Se ainda não estiver pronto, lave placas revestidas de poli-D com água estéril e remova todos os traços de líquido por aspiração completa durante a centrifugação.
9. Após a centrifugação, descarte o supernasal e resuspenque a pelota celular em 5 mL de Neuron Growth Media. Conte células vivas usando azul trypan e hemócito.
   1. Se a cultura de neurônios corticais, adicione pelo menos 10 mL de Mídia de Crescimento de Neurônios para células menos densas e uma contagem mais precisa.
10. Células diluídas com mídia de crescimento de neurônios para uma densidade final de revestimento de 5 x 10⁵ células viáveis por ml e adicionar 1 mL de suspensão celular diluída a cada poço de uma placa de 12 poços. Mantenha os neurônios a 37 °C com 5% de CO₂.
    NOTA: Normalmente, o hipocampi de 1 cérebro de camundongo embrionário, ou seja, 2 hipocampi, produzem aproximadamente 1 x¹⁰⁶ células viáveis. Este número é fornecido apenas para fins de planejamento de experimentos e não deve ser considerado uma substituição para a contagem de células para cada cultura.
11. Mude a mídia de crescimento no dia seguinte à cultura, removendo metade do volume de mídia de cada poço, ou seja, 0,5 mL, e adicione um volume igual de mídia fresca ao lado do poço para evitar interromper as células cultivadas. Completam meias mudanças de mídia duas vezes por semana para a vida útil da cultura.

4. Avaliar a expressão do MHCI por citometria de fluxo

1. Prepare o tratamento diluindo interferon beta (IFNβ) ou um volume igual de diluente na Mídia de Crescimento de Neurônios. Uma vez que a mudança de mídia será uma mudança de meio volume, prepare a mídia de tratamento com 2x IFNβ concentrado. ou seja, para tratar 3 poços de uma placa de 12 poços com 100 U/mL de IFNβ, prepare 1,5 mL com 200 U/mL IFNβ ou igual volume de DILuente IFNβ para controles tratados com mídia.
2. Remova 0,5 mL de cada poço de neurônios e adicione 0,5 mL de Mídia de Crescimento de Neurônios com ou sem IFNβ a cada poço. Incubar em condições normais de crescimento (37 °C, 5% DE CO₂) para 6-72 h, dependendo das condições experimentais e otimização do sinal.
3. Após o tempo de tratamento, remova todos os meios de comunicação cultural e lave suavemente uma vez na mídia neurobásal fria sem suplementos (B27, L-glutamina, Pen-Strep).
4. Adicione 0,5 mL de mídia neurobásal fria não suplementada contendo 1 μg/mL de bloco Fc e 1 μg/mL de anticorpo anti-MHCI conjugado fluorescente para cada poço. Incubar a 4 °C protegido da luz por 45 min.
5. Remova a mídia contendo anticorpos e lave cuidadosamente uma vez em dPBS frios. Adicione 0,5 mL de tampão de dissociação celular sem enzimas à temperatura ambiente a cada poço e agitar para desalojar células. Cuidado com a dissociação usando microscópio de cultura de tecido invertido.
6. Uma vez que as células são separadas do prato de cultura, adicione 0,5 mL de tampão FACS a cada poço, triturar células para dispersar aglomerados e transferir o volume total de cada poço para tubos individuais de microcentrifuuge de 1,7 mL.
7. Centrifugar a 1.000 x g por 5 min. Remova o supernasciente, resuspenque a pelota da célula em 100 μL de tampão FACS e transfira o volume total de cada tubo para poços individuais de uma placa de fundo U de 96 poços.
8. Adicione 100 μL de reagente fixativo a cada poço. Triturar várias vezes para evitar que as células se aglomeram e incubam por 15 minutos à temperatura ambiente protegidas da luz.
9. Centrifugar a 500 x g por 5 min. Remova o supernatante e resuspend em 200 μl de tampão FACS.
10. Centrifugar a 500 x g por 5 min. Remova o supernaspe e resuspend em 100 μL de reagente de permeabilização contendo anticorpo anti-NeuN conjugado fluorescente (diluição 1:100) para cada poço. Misture bem, depois incubar à temperatura ambiente protegido da luz com balanço por 20 minutos.
11. Após a incubação, centrífuga a 500 x g por 5 min. Remova o supernatante e resuspende em 100 μL de tampão FACS. Repita 2x.
12. Após a lavagem final, resuspend as células em 100 μL de 2% paraformaldeído diluído no buffer FACS. Misture bem para evitar que as células se despresem. Armazene a 4 °C protegido da luz até estar pronto para ler em um cítmetro de fluxo. Leia amostras o mais rápido possível, dentro de uma semana.

5. Quantificar e avaliar dados

1. Meça os controles de compensação para cada corante fluorescente e corrija quaisquer sobreposições espectrais. Os controles de compensação ideais incluem neurônios cultivados que estão manchados, manchados apenas com anti-MHCI, e manchados apenas com anti-NeuN.
2. Se possível, registos de 100.000 eventos para cada amostra (pelo menos 10.000) e salve como arquivos FCS.
3. Para analisar os dados, utilizando o software de análise apropriado, configure portões sequenciais, como descrito na Figura 1A-C para selecionar neurônios neun positivos.
   1. Plot SSC-A (log) vs FSC-A (linear). Desenhe um portão na população celular (P1) para eliminar detritos celulares da análise.
   2. Dentro da população celular P1, plot FSC-H (linear) vs FSC-A (linear). Desenhe um portão sobre a população de células únicas.
   3. Dentro da população de células únicas, plote SSC-A (log) vs NeuN (log). Desenhe um portão sobre a população neutra positiva usando células manchadas não manchadas ou somente MHCI como guia.
   4. Plote um histograma de fluorescência MHCI com eventos celulares normalizados para o modo no eixo y. Usando neurônios manchados não manchados ou somente neun como guia, desenhe um portão horizontal para quantificar a porcentagem de neurônios positivos para MHCI.
   5. Exporte as células por cento positivas para MHCI, bem como a intensidade mediana da fluorescência (IMFI) para MHCI na população neun-positiva para avaliação estatística e desenho gráfico.

Results

Utilizando o procedimento aqui apresentado, o tecido hipocampal foi dissecado a partir de filhotes de camundongos pré-natais no dia 18. O tecido foi dissociado em uma única suspensão celular usando métodos enzimáticos e mecânicos, então cultivado em 12 placas de poços que foram pré-tratados com poli-D-lysina. Após 7 dias in vitro, as células foram tratadas com 100 U/mL de IFNβ ou mídia apenas por 72 h, o que estimulou a expressão de MHCI. Os neurônios foram manchados in situ para MHCI antes de serem dissociados não enzimaticamente em uma única suspensão celular. Os neurônios foram fixos e permeabilizados, depois manchados intracelularmente para o marcador neun de núcleos neuronais. As amostras foram avaliadas por citometria de fluxo e os dados foram analisados por meio de software associado. Os neurônios foram identificados por meio de gating sequencial dos eventos totais para excluir detritos celulares e dobras(Figura 1A,B). Os neurônios foram definitivamente identificados pela NeuN-positividade (Figura 1C). As células NeuN⁺ foram ainda analisadas para a positividade do MHCI, plotando células em um histograma com o número de células normalizadas para o modo no eixo y e fluorescência MHCI no eixo x. Um portão MHCI⁺ foi desenhado no ponto em que os picos positivos e negativos divergiram(Figura 1D). A partir disso, os neurônios por cento positivos para a coloração de MHCI(Figura 1E) e a intensidade mediana da fluorescência (IME; Figura 1F) foram calculados. Os resultados mostram que o tratamento IFNβ aumentou significativamente o percentual de neurônios positivos para a coloração extracelular de MHCI, bem como o nível de expressão, conforme indicado pelo FIM. A análise estatística e a representação gráfica foram feitas utilizando-se software estatístico comercialmente disponível.

Figura 1: Estratégia de gating representativa e quantificação de MHCI.
Os neurônios hipocampais primários foram tratados apenas com 100 U/mL de IFNβ ou mídia. Após 72 h, os neurônios foram manchados extracelularmente com MHCI conjugado pelo Pacífico Azul (1 μg/mL H2-K^b),e então rotulados intracelularmente com NeuN conjugado por PE (diluição de 1:100). A fluorescência celular foi avaliada por citometria de fluxo, e os dados foram analisados. (A) O total de eventos foi traçado como SSC-A (log) vs FSC-A (linear), e as células (P1) foram fechadas para excluir detritos. (B) Dentro da população P1, as células foram traçadas como FSC-H (linear) vs FSC-A (linear) para portão da população de células únicas. (C) Dentro da população de células únicas, as células foram plotadas SSC-A (log) vs NeuN-PE (log). As células NeuN⁺ foram fechadas para identificar neurônios. (D) Dentro da população de neurônios, as células foram traçadas em um histograma com MHCI-PacBlu no eixo x e os números de células normalizados para o modo no eixo y. Um portão horizontal foi desenhado para quantificar a porcentagem de neurônios positivos para a coloração do MHCI. (E) Quantificação de percentual MHCI⁺ de células NeuN⁺ somente em mídia e neurônios tratados com IFNβ. (F) Quantificação da intensidade mediana da fluorescência (MFI) de MHCI em neun⁺ células em neurônios de mídia (preto) e ifnβ-tratado (vermelho). A significância estatística foi calculada pelo teste t não pago. **, P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Mídia de crescimento de neurônios (50 ml)
Reagente	Concentração Final	Concentração de Estoque	Por 50 ml
Suplemento B27	2%	100%	1,0 ml
L-glutamina	2 mM	200 mM	0,5 ml
Penicilina-Estreptomicina	100 U/ml	10.000 U/ml	0,5 ml
Mídia neurobásal			48,0 ml
Tampão FACS (500 ml)
Reagente	Concentração Final	Concentração de Estoque	Por 500 ml
Soro bovino fetal	2%	100%	10 ml
Edta	1 mM	500 mM	1 ml
dPBS			489 ml
Solução de Dissociação de Papain
Reagente	Concentração Final	Concentração de Estoque	Por 1 ml
Suspensão de Papain	20 U/ml	1000 U/ml	0.020 ml
DNase I	2,5 U/ml	2500 U/ml	0,001 ml
Hibernar-E			1,0 ml
Nota: O volume da Solução de Dissociação papain necessária variará dependendo do número de cérebros embrionários sendo dissecados. Prepare 0,5 ml por cérebro para neurônios hipocampais ou 1,0 ml por cérebro para neurônios corticais.
Nota: Prepare a solução de dissociação com a suspensão de papain em Hibernate-E por cerca de 3 minutos. Depois que papain é completamente dissolvido, adicione DNase I. Não vórtice DNase I.

Tabela 1: Mídia e soluções.

Discussion

Este protocolo descreve a dissecção e cultura dos neurônios hipocampais primários de filhotes de camundongos pré-natais no dia 18. O uso de neurônios primários cultivados a partir de roedores é uma das metodologias mais fundamentais desenvolvidas na neurobiologia moderna²². Embora as linhas celulares imortalizadas possam modelar certos aspectos dos neurônios, sua natureza como células derivadas do tumor, falha no desenvolvimento de axônios definidos e a divisão celular contínua levanta dúvidas se eles recapitulam fielmente propriedades de neurônios pós-místicos in vivo²³. Outra alternativa aos neurônios primários é o uso de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (HiPSCs). A tecnologia para o uso de HiPSCs, especialmente aqueles derivados do paciente, avançou rapidamente nos últimos anos²⁴. No entanto, ainda há limitações para trabalhar com HiPSCs, incluindo variabilidade entre linhas celulares, falta de maturidade funcional e diferenças nos perfis epigenéticos²⁵. Embora também existam limitações para trabalhar com o modelo reducionista dos neurônios primários de roedores, os neurônios cultivados retêm a natureza pós-mitótica dos neurônios in vivo. Além disso, as extensas ferramentas de biologia molecular e modificações genéticas disponíveis para camundongos favorecem o uso de neurônios primários sobre HiPSCs para muitas aplicações, e estudos de camundongos podem ser facilmente traduzidos para o organismo in vivo mais complexo sem perder o sistema genético experimental. Por essas razões, muitos pesquisadores usam neurônios de roedores primários para verificar aspectos-chave, se não a maior parte, de suas pesquisas.

Para certos ensaios, os neurônios podem ser analisados diretamente após o isolamento do ex vivo cerebral. Isso é particularmente desejável para experimentos envolvendo camundongos adultos que podem ser submetidos a condições experimentais específicas ou que podem depender de interações de múltiplos tipos de células; no entanto, existem várias questões que limitam o tipo de análises que podem ser feitas. É tecnicamente desafiador preparar uma única suspensão celular de neurônios do cérebro de camundongos adultos porque os neurônios são exclusivamente interconectados e envoltos pela^{mielina 26}. Métodos não enzimáticos de trituração tecidual são ineficientes em dissociar o tecido e causar morte celular, enquanto preparações enzimáticas muitas vezes cortam antígenos da superfície^{celular 27}. Além disso, enquanto a mielina está em grande parte ausente de camundongos embrionários, ela compreende cerca de 20% do cérebro adulto, podendo prejudicar o isolamento celular viável e impedir a análise de citometria de fluxo²⁸. Muitas das técnicas que foram desenvolvidas, em última análise, tiram neurônios de seu citosol e deixam corpos celulares pequenos e arredondados que consistem principalmente em núcleos²⁹. Embora isso seja aceitável para algumas análises, isso não é apropriado para quantificar a expressão de proteína citoplasmática ou extracelular. Além disso, o sistema de cultura celular reducionista permite testar questões mecanicistas específicas em uma escala de tempo mais curta do que é frequentemente possível com um sistema in vivo.

Também descritos neste protocolo estão métodos para estimular a expressão MHCI farmacologicamente com IFNβ, e a quantificação da expressão MHCI extracelular por citometria de fluxo. A estimulação por IFNβ é um controle positivo útil para testar outras condições experimentais, mas pode-se notar que ifnγ e ácido kainic também podem estimular a expressão MHCI nos neurônios^9,30, enquanto a tetrodotoxina diminui a expressão MHCI¹⁴. Métodos anteriores para detecção da expressão MHCI contaram com hibridização in situ e análise imunohistoquímica^14,15,20,31. Embora ensaios baseados em mRNA, como hibridização in situ e qRT-PCR, possam determinar a localização espostetorial, especificidade do tipo celular e níveis de transcrição genética, esses ensaios não podem avaliar a tradução ou o transporte de proteínas para a membrana plasmática. A análise imunohistoquímica e ocidental pode determinar diferenças na expressão proteica e na localização potencialmente celular, mas pode ser difícil quantificar com precisão. Além disso, muitos anticorpos MHCI reconhecem a estrutura terciária do complexo, e são altamente sensíveis às alterações conformais. Assim, as condições de permeabilização ou desnaturação resultam na perda da imunoreatividade MHCI³². O método aqui apresentado utiliza imunostaining in situ para MHCI, que permite o reconhecimento da proteína pelo anticorpo em sua conformação nativa, seguido por métodos de fixação e permeabilização.

Com pequenas modificações, os métodos aqui descritos podem ser usados para cultivar outras populações neuronais ou para avaliar a expressão de outras proteínas extracelulares de interesse. Observados neste protocolo são modificações fáceis que podem ser feitas para cultivar neurônios corticais, mas os métodos descritos aqui também podem ser usados para cultivar outras populações neuronais, como os neurônios^{estriais 33}. Além disso, embora este protocolo especigue a imunostenção de MHCI e NeuN, outros marcadores celulares podem ser identificados de forma semelhante. Em geral, marcadores extracelulares podem ser tratados como MHCI e marcadores intracelulares podem ser tratados como NeuN. No entanto, deve-se notar que durante a etapa de dissociação celular, as projeções axonais são cortadas da soma. Como a estratégia de gating definida aqui examina detritos celulares e se concentra no marcador de núcleos neuronais NeuN, proteínas que são expressas exclusivamente em projeções axonais podem não ser detectadas.

Até recentemente, pensava-se que os neurônios expressavam MHCI apenas em resposta a danos, infecções ou estimulação de citocina in vitro, a fim de engajar células CD8⁺ T citotóxias⁹. Novas pesquisas elucidaram outra função do MHCI na regulação de conexões sinápticas durante o desenvolvimento¹³. O protocolo descrito aqui usa IFNβ para estimular a expressão MHCI em neurônios cultivados pelo tipo selvagem, mas métodos semelhantes podem ser usados com uma variedade de estímulos celulares ou modificações genéticas para testar hipóteses específicas. Este método permitirá aos pesquisadores investigar os mecanismos moleculares que regulam a expressão do MHCI, o que melhorará a compreensão do papel dicotos do MHCI nessas duas funções celulares distintas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Fisher	05-408-129	Suprimentos de laboratório
Placa de cultura estéril de 100 mm	Fisher	FB012924	Suprimentos de cultura de tecidos
Tubos de centrífuga de 15 ml Genesee		21-103	Suprimentos de laboratório
Tubo de centrífuga de 50 ml	Genesee	21-108	Suprimentos de laboratório
500 mM EDTA	Invitrogen	AM9260G	FACS Buffer Reagent
70% Etanol	Fisher	BP82031Gal	Suprimentos de cultura de tecidos
96 poços placa de fundo em U	Genesee	25-221	Suprimentos de citometria de fluxo
B27	Gibco	17504044	Reagente de cultura de neurônios
Tampão de borato	Thermo Scientific	28341	Suprimentos de cultura de tecidos
Vidro de borosilicato Pipeta Pasteur	Fisher	13 678 20C	Suprimentos de Laboratório
Tampão de Dissociação Celular	Gibco	13 151 014	Suprimentos de Citometria de Fluxo
DNase I	Thermo	90083	Reagente de Solução de Dissociação
dPBS	Gibco	14190-235 Suprimentos para	Cultura de Tecidos
Dumont # 5 Fórceps	de Ciências Finas	91150-20 Ferramenta de	Dissecção
Dumont # 7 Fórceps	Fine Science Tools	91197-00	Ferramenta de Dissecção
Soro Bovino Fetal	Gibco	26140079	Suprimentos de Cultura de Tecidos
Fórceps Fino	de Ciências Finas	91113-10 Ferramenta de	Dissecção
Tesoura Fina	Ferramentas de Ciências Finas	91460-11 Ferramenta de	Dissecção
Kit de Permeabilização de Células Fixas e Perm	Invitrogen	GAS003	Suprimentos de citometria de fluxo
Glutamax	Gibco	35050061	Reagente de cultura de neurônios
Hibernate-E Medium	Gibco	A1247601	Reagente de cultura de neurônios
Bolsas de esterilização de selagem instantânea	Fisher	181254	Suprimentos de cultura de tecidos
Interferon Beta	PBL Ciência do ensaio	12405-1 Suprimentos de	citometria de fluxo
Anticorpo anti-NeuN-PE Milli-Mark, clone A60	MilliporeSigma	FCMAB317PE	anticorpo de citometria de fluxo
Mídia neurobasal	Gibco	21103049	reagente de cultura de neurônios
Pacific Blue anti-rato H-2Kb Anticorpo	BioLegend	116513	citometria de fluxo
	Reagente
de solução de dissociação de LS003126 WorthingtonCiências de	Microscopia Eletrônica	15714	Fixador
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122	Reagente de Cultura de Neurônios
Poli-D-Lisina	Sigma	P7280	Reagente de Cultura de Neurônios
Padrão Fórceps	Fine Science Tools	91100-12 Ferramenta de
Dissecção Microscópio de dissecção estéreo	Swift	M29TZ-SM99CL-BTW1	Ferramenta de Dissecção
Tesoura Cirúrgica	Ferramentas de Ciências Finas	91401-10	Ferramenta de Dissecção
Pipetas	de Transferência Corning	357575	Suprimentos de Laboratório
Anticorpo TruStain FcX (anti-mouse CD16 / 32)	BioLegend	101319	Citometria de Fluxo Anticorpo
Trypan Blue	Sigma	T8154-100ML	Suprimentos de cultura de tecidos