Este protocolo descreve a gravação intracelular in vivo de motoneurons lombares de rato com estimulação simultânea de corrente trans-espinhal. O método permite medir as propriedades da membrana e registrar disparos rítmicos de motoneurons antes, durante e depois da polarização anodal ou catódal da medula espinhal.
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Artigo de método
In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O registro intracelular de motoneurons espinhais in vivo fornece um "padrão-ouro" para determinar as características eletrofisiológicas das células na rede espinhal intacta e contém vantagens significativas em relação às técnicas clássicas de gravação in vitro ou extracelular. Uma vantagem das gravações intracelulares in vivo é que esse método pode ser realizado em animais adultos com um sistema nervoso totalmente maduro, e, portanto, muitos mecanismos fisiológicos observados podem ser traduzidos para aplicações práticas. Neste artigo metodológico, descrevemos esse procedimento combinado com a estimulação de corrente constante aplicada externamente, que imita processos de polarização ocorridos dentro das redes neuronais espinhais. A estimulação de corrente direta trans-espinhal (TSDCS) é um método inovador cada vez mais utilizado como intervenção neuromodulatória na reabilitação após várias lesões neurológicas, bem como em esportes. A influência do TSDCS no sistema nervoso permanece mal compreendida e os mecanismos fisiológicos por trás de suas ações são amplamente desconhecidos. A aplicação do tsDCS simultaneamente com gravações intracelulares permite observar diretamente as alterações das propriedades da membrana motoneuron e características do disparo rítmico em resposta à polarização da rede neuronal espinhal, o que é crucial para a compreensão das ações do TSDCS. Além disso, quando o protocolo apresentado inclui a identificação do motoneuron no que diz respeito a um músculo inervado e sua função (flexor versus extensor), bem como o tipo fisiológico (rápido versus lento) proporciona uma oportunidade de investigar seletivamente a influência do TSDCS em componentes identificados de circuitos espinhais, que parecem ser diferentemente afetados pela polarização. O procedimento apresentado foca na preparação cirúrgica para gravações intracelulares e estimulação com ênfase nas etapas necessárias para alcançar a estabilidade da preparação e a reprodutibilidade dos resultados. Os detalhes da metodologia da aplicação anodal ou cathodal tsDCS são discutidos enquanto prestam atenção às questões práticas e de segurança.
Introdução
A estimulação da corrente direta trans-espinhal (tsDCS) está ganhando reconhecimento como um método potente para modificar a excitabilidade do circuito espinhal na saúde e na doença1,,2,3. Nesta técnica, é passada uma corrente constante entre um eletrodo ativo localizado acima dos segmentos espinhais selecionados, com um eletrodo de referência localizado ventrally ou mais rostrally4. Vários estudos já confirmaram que o TSDCS pode ser usado no gerenciamento de certas condições patológicas, como dor neuropática5, espasticidade
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Protocolo
Todos os procedimentos ligados a este protocolo foram aceitos pelas autoridades competentes (por exemplo, Comitê de Ética Local) e seguem as regras nacionais e internacionais sobre bem-estar e gestão animal.
NOTA: Cada participante envolvido no procedimento deve ser devidamente treinado em procedimentos cirúrgicos básicos e tem que ter uma licença válida para a realização de experimentos em animais.
1. Anestesia e premeditação
- Anestesiar um rato com injeções intraperitoneais de pentobarbital de sódio (uma dose inicial de 60 mg·kg-1 para ratos Wistar machos de 6 meses de idade pesando 400\u201....
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Resultados
Parâmetros de potencial de ação e várias propriedades de membrana podem ser calculados com base em gravações intracelulares quando condições estáveis de penetração celular são garantidas. A Figura 1A apresenta um potencial típico de ação ortodrómica evocado pela estimulação intracelular, que atende a todos os critérios de inclusão de dados (o potencial de membrana de repouso de pelo menos -50 mV, e a amplitude de pico superior a 50 mV, com uma superação positiva). Os parâmetros potenciais de.......
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Discussão
Se realizada corretamente, a parte cirúrgica do protocolo descrito deve ser concluída dentro de aproximadamente três horas. Deve-se tomar cuidado especial na manutenção de condições fisiológicas estáveis de um animal durante a cirurgia, em especial a temperatura corporal e a profundidade da anestesia. Além de considerações éticas óbvias, a falta de anestesia adequada pode resultar em movimentos excessivos de membros durante a dissecção nervosa ou laminectomia e levar a danos à preparação ou a um término prematuro do expe.......
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Divulgações
Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência nº 2017/25/B/NZ7/00373. Os autores gostariam de reconhecer o trabalho de Hanna Drzymała-Celichowska e Włodzimierz Mrówczyński, que contribuíram para a coleta e análise dos resultados apresentados neste artigo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Durgs e soluções | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351-NaHCO3 | |
| Merck | |||
| 106329-Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/ | Valeant-Bloqueador neuromuscular | |
| Pentobarbital sódico | Biowet Pu?awy Sp. z o.o-Agente | anestésico principal | |
| Citrato de | Chempur | 6100-05-06-Tetraspan | |
| Braun-HES solution | |||
| Equipamento cirúrgico | - | - | -21 |
| Lâmina | FST | 10021-00 | Lâmina |
| de bisturiCauterizador | FST | 18010-00-Tubos | |
| torácicos | Mila | CT1215-Dumont | |
| #4 Fórceps | FST | 11241-30 | Fórceps muscular |
| Dumont #5 Fórceps | FST | 11254-20 | Fórceps |
| Dura Dumont #5F Fórceps | FST | 11255-20 | Fórceps |
| nervoso Dumont #5SF Fórceps | FST | 11252-00 | Pia fórceps |
| Fórceps | FST | 11008-13 | Fórceps sem corte |
| Fórceps | FST | 11053-10 | Fórceps de pele |
| Hemostat | FST | 13013-14-Rongeur | |
| FST | 16021-14 | Para laminectomia | |
| Tesoura | FST | 15000-08 | Tesoura de veia |
| Tesoura | FST | 15002-08 | Tesoura dura |
| Tesoura | FST | 14184-09 | para corte de traqueia |
| Tesoura | FST | 104075-11 | Tesoura muscular |
| Tesoura FST | 14002-13 | Tesoura de pele | |
| Tubo traqueal | - | Cateter de veia feito sob medida | |
| Vygon | 1261.201-Vessel | ||
| cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Braçadeira | de vaso FST | 18320-11 | Para fixação de veias |
| Sonda de dilatação de vaso | FST | 10160-13 | Para dissecção de veias |
| Materiais de sustentação | - | - | |
| -Espuma de gel | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Agente hemostático |
| Sutura de seda 4.0 | FST | sutura 18020-40-Silk | |
| 6,0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Dispositivos moleculares | Axoclamp 2B | descontinuados | Amplificador intracelular/modelo novo Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gás analisador |
| Grass S-88 | A-M Systems | descontinuado | Estimulador de corrente constante |
| Sistemas de manta homeotérmica com sonda flexível | Aparelho Harvard | 507222F | Sistema de aquecimento |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Amplificador extracelular |
| Microdrive | - | Feito sob medida / substituição IVM / Scientifica | |
| P-1000 Microeletrodo | extrator Sutter Instruments | P-1000 | Extrator de microeletrodos |
| SAR-830 / AP Ventilador para animais pequenos | CWE | 12-02100 | |
| Quadro de suporte | do | Base padrão de laboratório personalizado / substituição 51601 / | |
| Grampos espinhais | - | Adaptador espinhal de rato personalizado / substituição 51695 / | |
| Estimulador DC TP-1 | WiNUE | - | estimulador tsDCS |
| Diversos | -- | - | |
| 1B150-4 capilares de vidro | WPI | 1B150-4 | Para produção de microeletrodos |
| Algodão | --- | ||
| tubulação flexível | - | - | Para conexão |
| de respirador e analisador de CO2MicroFil | WPI | MF28G67-5 | Para enchimento de micropipetas Fio |
| de prata | - | Para eletrodos nervosos |
Referências
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90(2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A.
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Reimpressões e permissões
