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Artigo de método

Injeção de andaimes biomaterial de hidrogel no cérebro após o derrame

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DOI:

10.3791/61450

⸱

1 de outubro de 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Neurology, University of California Los Angeles, 3Department of Neurology, Duke University, 4Department of Dermatology, Duke University

Neste artigo

Resumo

O AVC é um problema global com opções mínimas de tratamento e nenhuma terapia clínica atual para regenerar o tecido cerebral perdido. Aqui descrevemos métodos para criar um derrame fototrombótico preciso no córtex motor de roedores e posterior injeção de biomateriais de hidrogel para estudar seus efeitos na regeneração tecidual após o acidente vascular cerebral.

Resumo

O AVC é a principal causa de incapacidade e a quinta principal causa de morte nos Estados Unidos. Aproximadamente 87% de todos os derrames são derrames isquêmicos e são definidos como o bloqueio repentino de um vaso que fornece sangue ao cérebro. Poucos minutos após o bloqueio, as células começam a morrer e resultam em danos irreparáveis aos tecidos. Os tratamentos terapêuticos atuais se concentram na remoção do coágulo ou na lise para permitir a reperfusão e prevenir danos cerebrais mais graves. Embora a plasticidade cerebral transitória possa salvar parte do tecido danificado ao longo do tempo, frações significativas de pacientes são deixadas com déficits neurológicos que nunca se resolverão. Faltam opções terapêuticas para tratar déficits neurológicos causados pelo AVC, enfatizando a necessidade de desenvolver novas estratégias para tratar essa crescente população de pacientes. Os biomateriais injetáveis estão sendo projetados para melhorar a plasticidade cerebral e melhorar o reparo endógeno através da entrega de agentes ativos ou células-tronco. Um método para testar essas abordagens é utilizar um modelo de curso de roedor, injetar o biomaterial no núcleo do traçado e avaliar o reparo. Saber a localização precisa do núcleo do avc é imperativo para o tratamento preciso após o derrame, portanto, um modelo de derrame que resulte em um local previsível de derrame é preferível para evitar a necessidade de imagem antes da injeção. O protocolo a seguir abordará como induzir um derrame fototrombótico, como injetar um hidrogel de forma controlada e precisa, e como extrair e criosecção do cérebro enquanto mantém o bioma material intacto. Além disso, vamos destacar como esses mesmos materiais de hidrogel podem ser usados para a co-entrega de células-tronco. Este protocolo pode ser generalizado para o uso de outros biomateriais injetáveis no núcleo do traçado.

Introdução

O AVC é a principal causa de incapacidade e a quinta principal causa de morte nos Estados Unidos1. Aproximadamente 87% de todos os derrames são isquêmicos, enquanto a maioria dos 13% restantes são hemorrágicos2. Um derrame isquêmico é definido como o bloqueio do fluxo sanguíneo em uma artéria para o tecido circundante. Essa oclusão resulta em privação de oxigênio e necrose subsequente que muitas vezes leva à incapacidade permanente em pacientes sobreviventes. Embora tenha havido uma diminuição na taxa de mortalidade por acidente vascular cerebral3, espera-se que sua prevalência aumente para 3,4 milhões de pessoas até 20304. Esse aumento de sobreviventes com deficiência e consequente carga econômica levou a um impulso para a pesquisa de derrame que se concentra em mecanismos de reparação neural. Após o AVC há um período inflamatório que leva à formação de uma cicatriz que impede a expansão da região necrótica. A região em torno do núcleo necrosado é chamada de "peri-infarto" e há fortes evidências de que a plasticidade nesta região, que inclui o aumento da angiogênese, neurogênese e broto axonal, está diretamente ligada à recuperação observada em modelos animais e humanos5. Como não existem modelos in vitro que possam replicar adequadamente as interações complexas após o AVC, os modelos animais são essenciais para a pesquisa de avc.

Existem vários modelos in vivo que podem ser usados para produzir derrame isquêmico. Um dos modelos mais comuns utilizados em camundongos é a oclusão da artéria cerebral média, ou MCAo, através da oclusão distal ou proximal (via filamento intra-arterial). O modelo proximal, também conhecido como filamento MCAo (fMCAo), normalmente resulta em grandes derrames isquêmicos que abrangem entre 5% e 50% do hemisfério cerebral, dependentes do número de fatores6. Nesses modelos, uma sutura ou filamento é avançada da artéria carótida interna para a base da artéria cerebral média (MCA) e mantida no lugar por um período específico de tempo. Este método de oclusão, que pode ser feito temporário ou permanente, produz um infarto centrado no estriado e pode ou não envolver o córtex6. O tamanho resultante do acidente vascular cerebral é altamente variável, e técnicas de imagem, como doppler laser, são necessárias para confirmar a eficácia do procedimento em cada rato. A oclusão de filamento intra-arterial ou intra-luminal que dura mais de 30 minutos produz traços na extremidade maior da faixa de tamanho. Alguns investigadores se concentraram em tempos de oclusão de filamentos mais curtos, que requerem foco experimental substancial e validação laboratorial7. Os modelos de Filamento MCAo em camundongos seguem estágios semelhantes de morte celular, progressão isquêmica e formação de uma região peri-infarto, como visto em casos de derrame humano; no entanto, os derrames maiores se assemelham mais ao estado da doença de infartos cerebrais malignos, que são menos comuns, menos tratáveis derrames humanos6. Enquanto isso, a oclusão distal da MCA requer uma cirurgia mais envolvida e craniectomia. Neste modelo, a parte distal do MCA que corre ao longo da superfície do cérebro é diretamente ocluída com uma gravata de sutura ou cauterização. Em algumas variações da técnica, as artérias carótidas são unilateralmente ou transitoriamente ocluídas bilateralmente. Um benefício do MCAo distal é que ele produz um curso de base cortical que é menos variável em tamanho do que o modelo de filamento. No entanto, o modelo distal produz uma produção comportamental mais pobre devido à transeção da artéria carótida externa (ECA), que também é uma preocupação com o FMCAo6.

Um modelo alternativo de avc que é conhecido por ser menos invasivo é o modelo fototrombótico (PT). O modelo PT resulta em um local bem definido de isquemia e está associado a uma alta taxa de sobrevivência8. A técnica conta com um corante fotosensitivo injetado intraperitoneally que permite a fotoper oxidação intravascular simplesmente irradiando o tecido desejado com uma luz ou laser9. Após a excitação, forma-se radicais de oxigênio que causam danos endoteliais, que ativam a agregação de plaquetas e a formação de coágulos na área irradiada8,9. O controle rigoroso sobre o tamanho e a localização do traçado, bem como a alta reprodutibilidade do modelo PT, torna-o ideal para estudar biomateriais. Embora a precisão seja possível usando um laser e coordenadas estereotaxas, existem algumas desvantagens que podem tornar este modelo menos ideal para poucos estudos. Ao contrário do modelo fMCAo, o modelo de traçado PT não pode ser reperrido. Portanto, materiais para investigar agentes neuroprotetores específicos para danos após a reperfusão ou os mecanismos após a reperfusão não seriam úteis aqui8. Além disso, devido ao insulto microvascular do modelo PT, é vista penumbra isquêmica relativamente pequena. Em vez disso, ocorre o edema vasogênico local, que não é característico do AVC humano, tornando este modelo indesejável para estudos de drogas pré-cínicas focados na área peri-infarto6,8.

O objetivo geral das estratégias de biomateriais no AVC é entregar agentes bioativos ou atuar como uma matriz extracelular substituta para o crescimento do tecido cerebral. Uma estratégia que vamos explorar usando nossos métodos é entregar hidrogel diretamente no núcleo do avc, em oposição ao tecido peri-infarto onde muitas terapias celulares atuais são fornecidas10. A justificativa para essa abordagem é que o parto no tecido necrosado encontrado no núcleo evitará interromper o tecido saudável ou em recuperação do ambiente. Assumimos que a difusão de quaisquer agentes ativos incluídos no bioma material será capaz de atingir o peri-infarto do núcleo, especialmente porque descobrimos que a entrega de biomateriais de hidrogel reduz a espessura da cicatrizgliaria 11. Isso é importante, uma vez que a região peri-infarto tem sido mostrada para exibir neuroplasticidade após o AVC, tornando-se um alvo atraente. Além disso, a entrega de uma matriz substituta ao núcleo do avc pode ser carregada com12 ou13 fatores angiogênicos para orientar a formação de novos tecidos, bem como células para o parto14. A entrega celular é muito aprimorada usando uma matriz porque protege as células das duras forças de injeção e do ambiente local presentes durante a entrega, além de incentivar a diferenciação e o enxerto15.

Esses biomateriais terapêuticos injetáveis têm relevância clínica nas aplicações do AVC, pois atualmente não existem terapias médicas que estimulem a recuperação neuronal após o AVC. Os circuitos neurais subjacentes envolvidos na recuperação estão no tecido cerebral adjacente ao núcleo do traçado16,enquanto o próprio núcleo do derrame é desprovido de tecido neural viável. Prevemos que a entrega de um biomamaterial no núcleo do avc necrosado tem potencial para estimular o tecido adjacente em direção a processos regenerativos através de uma série de mecanismos mencionados anteriormente, incluindo a liberação de fatores de crescimento13,estimulação do tecido em crescimento e promoção da recuperação do desenvolvimento do tecido cerebral11,12, alteração das respostas imunes17, e entrega de terapêuticas derivadas de células-tronco14, 18. No entanto, para estudar efetivamente a possibilidade dessas aplicações, é necessário um método consistente e reprodutível para induzir derrame e injetar biomateriais. O modelo de traçado PT utiliza técnicas que oferecem controle preciso sobre a orientação e localização do curso. Um laser ligado ao dispositivo estereotaxic guia orientações, e bombas ligadas aos dispositivos estereotaxicos controlam a taxa de injeção do material sem a necessidade de formas adicionais de imagem. Por isso, optamos por descrever os métodos para a realização de um AVC PT nos córtex motor de camundongos e para injetar biomateriais no núcleo do curso. Aqui, usamos hidrogéis de partículas recadas microporosas (MAP) como o biomamaterial para injeção sem células adicionadas ou fatores de crescimento. Além disso, explicamos como recuperar com sucesso o cérebro com biomaterial intacto, e discutimos ensaios de imunoquímica usados para analisar o resultado do derrame com e sem injeção de biomateriais.

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Protocolo

Os experimentos foram realizados de acordo com o IUCAC na Duke University e na University of California Los Angeles. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57Bl/6J masculinos de 8 a 12 semanas. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso a alimentos e ad libitum de água. Os protocolos de analgesia e sedação são descritos como aprovados pelo IUCAC, mas podem diferir dos protocolos utilizados em outros laboratórios.

Os animais podem ser prematuramente eutanizados se experimentarem inquietação excessiva, vocalização (indicando dor incontrolável), autotraímento, mobilidade reduzida ou prejudicada, sinais físicos de infecção dérmica, perda de apetite e/ou perda de peso superior a 10%-15% como resultado da cirurgia de sobrevivência. Não há efeitos adversos antecipados da injeção do gel, pois é composto por um polímero que ocorre naturalmente dentro do cérebro. Os animais devem ser monitorados diariamente, incluindo fins de semana e feriados, e ressarcidos a cada dois dias. Estudos do nosso laboratório e de outros não encontraram déficits no preparo, perda de peso corporal ou sinais/sintomas de abstinência ou estresse crônico em camundongos após esses pequenos derrames corticais ou subcorticais. Se os animais apresentarem algum sinal de infecção local na cabeça, eles devem ser eutanizados. Os animais também devem ser monitorados por mau preparo, condição de ferimentos e evidências de luta entre animais (feridas nas costas). Se houver evidências de luta ou desamscência de feridas, os animais devem primeiro ser tratados após o contato com os veterinários. Isso muitas vezes envolve antibiótico na água e/ou aplicação de antibióticos tópicos locais. Se essas medidas não produzirem cura, os animais devem ser eutanatizados.

1. Preparação de materiais e instrumentos

  1. Prepare o corante fototrombótico antes da cirurgia. Pese 15 mg de Rose Bengala em um tubo de microcentrifus de 2 mL.
    ATENÇÃO: Rose Bengala pode causar sérios danos oculares/irritação.
    1. Dissolva a Bengala Rosa em 1,5 mL de PBS filtrado estéril para fazer uma concentração de trabalho de 10 mg/mL.
    2. Vórtice do tubo até que nenhum aglomerado seja visível, indicando que o corante se dissolveu completamente, depois cubra em papel alumínio até que use mais.
      NOTA: A quantidade de corante necessária dependerá do número de ratos. O corante é injetado intraperitoneally IP a uma concentração de 10 μL/g, por exemplo, 200 μL para um mouse de 20 g.
  2. Ligue a almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo do rato durante a anestesia (37 °C).
  3. Prepare tesouras autoclavadas, fórceps, algodão, pomada ocular veterinária, cola cirúrgica ou material de sutura, um marcador cirúrgico azul ou preto, e álcool estéril e lenços de iodo beta. Prepare a broca óssea com cabeças de broca esterilizadas.
  4. Ligue a esterilização das contas a 160 °C para permitir a esterilização de instrumentos entre a cirurgia dos camundongos. Reserve um tubo cônico de 50 mL de solução salina estéril ou 1x PBS para posterior utilização na manutenção de uma área de operação hidratada.
  5. Conecte o laser ao dispositivo estereotaxico. Usando óculos de segurança a laser, meça o poder do laser (mW).
    ATENÇÃO: Use óculos de segurança a laser sempre que o laser estiver ligado no procedimento.
    1. Ajuste a corrente no console a laser, seguindo as instruções de fabricação a laser, até que a saída de energia a laser leia 10 mW, e defina a corrente como um pré-definido no console de tela inicial. Em seguida, ajuste a corrente novamente para estabelecer outro pré-definido onde a potência de saída do laser lê 40 mW. Agora desligue o laser até que use mais.
      NOTA: Os 10 mW serão usados para orientar o laser antes de ser utilizado.
  6. Prepare uma gaiola limpa para ratos após a cirurgia. Em seguida, coloque o rato na câmara de indução com uma concentração isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo pare e sua respiração chegue a uma taxa lenta e constante.
  7. Uma vez dormindo, pese o rato para determinar quanto corante Rose Bengala injetar. Em seguida, transfira e fixe o mouse para o dispositivo estereotaxico com uma concentração de isoflurane de manutenção de 1,5%.
    NOTA: O aumento das concentrações de isoflurane pode dilatar os vasos e evitar oclusão suficiente ou derrames consistentemente dimensionados entre camundongos.
  8. Aplique pomada ocular veterinária em ambos os olhos.
    NOTA: Observe a respiração e a temperatura durante todo o procedimento e belisque os dedo dos dedo ocasionalmente para garantir que o mouse não possa sentir nada.

2. Traço fototrombótico modelo9

  1. Raspe a pele da cabeça do rato e prepare asepticamente a área usando um lenço de álcool seguido de uma limpeza beta de iodo. Repita três vezes.
    NOTA: Se necessário, use um lenço de álcool extra no final para limpar todo o iodo beta, pois causa irritação na pele que leva os ratos a coçar o crânio após a cirurgia.
  2. Usando uma tesoura de pequeno funcionamento, faça uma incisão lateral entre as orelhas até os olhos, cerca de 1-2 cm. Faça isso puxando a pele para cima com fórceps para criar uma tenda, cortando uma vez para baixo, em seguida, inserindo a tesoura na abertura e criando uma incisão contínua da linha média.
  3. Separe a pele e pressione levemente os ossos parietal com os fórceps para localizar o bregma. Marque o bregma com um ponto usando o marcador cirúrgico.
    NOTA: O movimento do fragmento ósseo destaca a borda frontal dos ossos parietais. O bregma é o ponto central em que os fragmentos ósseos frontal e pariário se encontram(Figura 1A).
  4. Usando óculos de segurança laser, mova o laser sobre o crânio do mouse, fixando o dispositivo estereotaxico em um ângulo de 90°. Selecione o pré-configurado de 10 mW e ligue o laser.
    1. Ajuste o eixo x e y do laser até que ele esteja diretamente sobre o bregma. Reinicie o x e o y no console de exibição digital e, em seguida, mova o laser 1,8 mm à esquerda do bregma. Agora traga o laser o mais perto possível do crânio sem deixá-lo tocar o crânio.
    2. Mova o laser para 2,2 mm à esquerda da bregma para garantir que ele possa se mover sem quaisquer obstruções. Desligue o laser.
  5. Injete a quantidade apropriada de corante rose bengala intraperitoneally (IP) usando uma agulha descartável de 29 G. Inicie imediatamente um temporizador de 7 minutos para permitir que o corante circule sistemicamente. Selecione o pré-definido por 40 mW sem ligar o laser.
    NOTA: Uma vez confortável com o procedimento, o corante pode ser injetado antes da preparação asséptica do mouse e terminado antes que os 7 minutos acabem para economizar tempo.
  6. Ligue o laser (40 mW) quando o temporizador de 7 minutos explodir, enquanto usa óculos de segurança a laser, e defina um temporizador de 10 minutos.
    1. Depois de 10 min, mova o laser para 2,2 mm à esquerda da bregma sem desligá-lo, e afina mais 10 minutos de temporizador.
    2. Uma vez que o segundo temporizador de 10 minutos tenha desligado, mude o laser de volta para 10 mW e mova o laser para 2,0 mm à esquerda do bregma. Marque este lugar com o marcador cirúrgico. Em seguida, desligue o laser.
    3. Levante o laser e desbloqueie-o do ângulo de 90° para que ele possa ser removido do mouse. Neste ponto, aplique o soro fisiológico estéril ou PBS com algodão se a área cirúrgica estiver seca.
  7. Perfurar em pequenas rajadas na marca de 2,0 mm perpendicular à superfície do crânio.
    NOTA: Tenha cuidado para perfurar lentamente para evitar perfurar muito profundamente e atingir o cérebro. Haverá uma leve queda/mudança na resistência uma vez que a broca tenha atravessado o crânio, e a perfuração pode causar sangramento.
    1. Use algodão para absorver qualquer excesso de sangue. É típico ver algum sangue de artérias cortadas no crânio após a perfuração – sangue excessivo significa que a broca atingiu o cérebro. Se isso acontecer, grave o identificador do mouse e siga em frente.
  8. Coloque uma pequena limpeza ao lado do mouse. Usando os fórceps, puxe a pele para perto para se preparar para a colagem.
    NOTA: A sutura pode ser feita aqui em vez disso. A sutura normalmente requer apenas 3 suturas.
    1. Usando os fórceps, pegue os dois lados da pele e puxe-os juntos e para cima. Desarme-se em gotas grandes de cola cirúrgica na extremidade da ponta na limpeza antes de aplicar no mouse.
    2. Aplique a cola cirúrgica com moderação e segure a pele junto com fórceps por 10 s. Continue até que não haja aberturas visíveis.
      NOTA: A cola sai rapidamente – não aperte a garrafa. Evite colar a pele no crânio ou colocar cola no olho.
  9. Depois de colar, ou suturar, coloque o rato na nova gaiola para se recuperar da anestesia. Leva de 5 a 10 minutos para o animal se recuperar, e ajuda a descansar metade da gaiola em uma almofada de aquecimento.

3. Operação de traçado falso

  1. Realize todos os procedimentos de forma idêntica à operação descrita acima na seção 2, exceto injetar 1x PBS ou soro fisiológico em vez de corante rose bengala.

4. Injeção de hidrogel ou outros biomateriais

  1. Realize a injeção de biomateriais em um momento definido pelo usuário. Neste experimento foram realizadas injeções entre 5 e 7 dias após o derrame. 2 - 6 μL de hidrogel são injetados (definido pelo usuário).
    1. Ligue a almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo do rato durante a anestesia (37 °C).
    2. Prepare tesouras autoclavadas, fórceps, algodão, pomada ocular veterinária, cola cirúrgica ou material de sutura, e álcool estéril e lenços beta iodo. Prepare a broca óssea com cabeças de broca estéreis e as seringas Hamilton de vidro de 25 μL com agulhas metálicas de 30 G.
    3. Ligue a esterilização das contas a 160 °C para permitir a esterilização de instrumentos entre camundongos.
    4. Conecte as bombas de injeção ao dispositivo estereotaxico. Defina a vazão para 1 μL/min e ajuste o volume para 4 μL.
    5. Prepare uma gaiola limpa para os ratos depois da cirurgia.
  2. Coloque o rato na câmara de indução com uma concentração isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo pare e sua respiração chegue a uma taxa lenta e constante.
    1. Uma vez dormindo, transfira e fixe o mouse para o dispositivo estereotaxico com uma concentração de isoflurane de manutenção de 1,5%.
    2. Aplique a pomada ocular veterinária em ambos os olhos.
    3. Raspe qualquer pele que possa ter recreado da cabeça do rato, e prepare aseticamente a área usando um lenço de álcool seguido de uma limpeza beta de iodo. Repita três vezes.
      NOTA: Se necessário, use um lenço de álcool extra no final para limpar todo o iodo beta, pois causa irritação na pele e leva os ratos a coçar o crânio após a cirurgia.
  3. Usando a tesoura pequena e/ou fórceps, reabra a pele acima do cérebro. Use algodão com soro fisiológico estéril ou PBS para limpar quaisquer detritos do crânio. Um círculo branco-amarelo (o traçado, Figura 1B) e o orifício de rebarba da broca serão visíveis. Se o tecido morto não for visível, provavelmente não ocorreu nenhum derrame. Se o orifício da rebarba não estiver centrado acima do traçado, refira-se para centralizar.
  4. Oriente a bomba de injeção sobre o mouse e bloqueie a 90°. Limpe a seringa com solução salina estéril ou PBS antes de recarregar o material.
    1. Uma vez limpo, desmonte a seringa de vidro para que não haja agulha. Encarregar a seringa usando uma pipeta de deslocamento positivo de 25 μL com o 10 μL de hidrogel (ou outro biomaterial aqui com ou sem células).
    2. Usando o êmbolo da seringa, empurre o gel até a frente da seringa. Em seguida, remonte a seringa e continue empurrando até que o gel exale visivelmente da agulha.
  5. Coloque a seringa na bomba. A parte de trás da bomba pode precisar ser ajustada para que a seringa se encaixe. Faça isso ajustando a taxa de fluxo para 30 μL/min, selecione Retirada ou Inje, dependendo da direção que precisa mover e pressione Iniciar. Aperte Stop quando a parte de trás da bomba estiver no local correto.
    1. Enrosque a parte de trás da bomba para que a seringa esteja segura. Se os ajustes foram feitos anteriormente, certifique-se de que a taxa de fluxo seja fixada para 1 μL/min e esteja definida para injetar.
  6. Mova a bomba na direção x e y para orientá-la sobre o orifício. Mova a bomba para baixo na direção z até que a agulha da seringa toque a parte superior do orifício.
  7. Reinicie o z no console de exibição digital. Em seguida, mova a seringa para baixo na direção z 0,750 mm. Se a seringa se curva ou há resistência, o crânio ou curado ou não foi completamente perfurado e precisa ser re perfurado.
  8. Pressione Inicie o console da bomba para injetar 4 - 6 μL do hidrogel a uma taxa de 1 μL/min.
  9. Defina um temporizador de 5 minutos quando a bomba parar de injetar para permitir que o gel comece a se cruzar.
  10. Depois de 5 minutos, puxe lentamente a seringa girando o z nob. Observe para ver se algum material é acidentalmente puxado ou vazando do buraco. Desbloqueie a bomba e mova-a para longe do rato quando a agulha estiver longe o suficiente do crânio.
  11. Usando fórceps, cola cirúrgica ou suturas, feche a pele acima da cabeça. Coloque o mouse na gaiola limpa e observe sua recuperação. Deve levar cerca de 5 a 10 minutos para o rato se recuperar da anestesia.

5. Perfusão e coleta de amostras

  1. Anestesiar o rato usando isoflurano.
  2. Fixar o animal na posição supina e abrir a cavidade abdominal com um corte mediano. Opcionalmente, aperte a aorta abdominal descendente para usar menos fixação e PBS.
  3. Abra o diafragma e mova as laterais da caixa torácica para abrir a cavidade torácica. Insira uma cânula de perfusão no ventrículo esquerdo e corte uma abertura no átrio direito. Comece a perfundir lentamente com 10-20 mL de PBS ou até que o líquido seja semi-claro.
  4. Uma vez claro, mude para 4% PFA para outros 10 – 20 mL. Desempinar as armas permite que eles contraam à medida que o PFA infunde. Assim que pararem de se mover, esperem mais 30.
  5. Decapitar o animal e puxar a pele para expor o crânio. Usando fórceps finos e bruscos, remova cuidadosamente os pedaços do crânio para expor o cérebro. Cuidados especiais devem ser tomados ao remover o crânio acima do local do derrame. Uma pequena tesoura cirúrgica pode ser usada aqui para ajudar a cortar o crânio. O maior desafio é gel ficar preso ao crânio e sair do cérebro quando o crânio é removido.
  6. Uma vez que o cérebro é destacado, coloque em 10 - 15 mL de 4% PFA durante a noite (não mais do que 24 horas).
  7. Mova os cérebros da PFA para 30% de sacarose no dia seguinte. O cérebro está pronto para a crioseção uma vez que afunda até o fundo (cerca de 2 a 3 dias). Ele também pode ser deixado para armazenamento neste momento.

6. Criosectioning e coloração

  1. Tire o cérebro da sacarose e coloque em uma lâmina de vidro. Corte uma pequena parte da parte de trás do cérebro com uma lâmina de barbear para criar uma porção plana para ser montada em um mandril.
    1. Coloque um montão de composto de temperatura de corte ideal (OCT) no mandril e, em seguida, coloque o cérebro, lado plano para baixo, sobre o mandril no OCT. Coloque este espécime em gelo seco até congelar ou no criostat no bloco de congelamento.
      NOTA: O OCT pode ser adicionado para abranger totalmente o cérebro para ajudar a evitar que o material se separe do cérebro durante a secção.
  2. Corte os cérebros em série em um criostat a -20 °C a 30 μm de espessura em 10 lâminas revestidas de gelatina. Tome cuidado ao seção garantindo não perder o hidrogel. Se essa parte for difícil, coloque algum OCT na parte superior do cérebro sobre o gel(Figura 3). Armazene a -80 °C até que use mais.
  3. Tire lâminas do -80 °C e coloque em uma bandeja de coloração para permitir que elas sequem. Slides que não foram congelados, mas apenas seccionados também podem ser manchados imediatamente.
  4. Usando uma caneta hidrofóbica, desenhe um círculo em torno das fatias cerebrais no escorregador. Uma vez seco, reidratar as fatias cerebrais com PBS filtrado de 1x e coloque em um agitador à temperatura ambiente por 15 minutos. Isso leva cerca de 1 mL de tampão por slide com 9 - 12 seções cerebrais.
  5. Lave os slides com PBS filtrado de 1x por 5 minutos à temperatura ambiente, repita três vezes.
  6. Bloqueie slides por 30 minutos a uma hora com soro de burro de 10% em 0,01% PBS-Triton X à temperatura ambiente na dançarina do ventre. Isso leva cerca de 200 μL por slide.
  7. Incubar o anticorpo primário em 10% de soro de burro com 0,01% PBS-Triton X durante a noite a 4°C em um shaker. Teste os anticorpos primários primeiro para determinar as concentrações corretas. Aqui foram utilizados GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (Figura 4).
  8. Lave slides com PBS filtrado de 1x no dia seguinte por 5 minutos em temperatura ambiente, repita três vezes.
  9. Incubar com anticorpo secundário em 10% de soro de burro em 0,01% PBS-Triton X e DAPI por 2 h no agitador de laboratório à temperatura ambiente. 1:1.000 foi usado para todos os secundários e DAPI.
  10. Lave os slides por 5 minutos com PBS filtrado de 1x.
  11. Deixe que as seções sequem à temperatura ambiente no escuro. Isso pode levar de 20 min a 4 h; colocar os slides em um desiccator pode acelerar o processo.
  12. Desidratar slides em concentrações ascendentes de álcool (1 min por solução) de 50%, 70%, 95%, 100% e 100%.
  13. Desonera no primeiro banho de xileno por 1 min, depois segundo banho de xileno por 5 minutos.
  14. Retire rapidamente os slides um por um e adicione o meio de montagem enquanto as seções cerebrais estão molhadas com xileno. Adicione rapidamente uma mancha de vidro por cima. Use um deslizamento de tampa que seja de comprimento e espessura corretos necessários para o slide e microscópio utilizados para imagens, respectivamente.
  15. Livre-se de qualquer bolha sob o deslizamento, pressionando suavemente com uma ponta de pipeta em um movimento externo do centro do slide. Deixe que o DPX seque por 4h a noite no escuro à temperatura ambiente.
  16. Use uma lâmina de barbear para raspar qualquer meio de montagem seco que derramou sobre os slides. Limpe os slides com o limpador de lentes. Slides agora podem ser imagens com microscopia de fluorescência.
    NOTA: É melhor armazenar o slide no escuro ou a 4 °C até que a imagem esteja terminada.

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Resultados

O objetivo deste método era demonstrar como injetar biomateriais no cérebro após o derrame. Um modelo fototrombótico com bengala rosa e um laser de 520 nm foi utilizado para orientação controlada da lesão do derrame tanto no tamanho quanto na localização. Cinco dias após o derrame, o infarto pôde ser visualizado durante a cirurgia(Figura 1B) e por TTC e imagens de lâminas manchadas de IHC(Figura 2). Um aumento no diâmetro do laser com uma lente 2x leva a um aume...

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Discussão

Aqui demonstramos um modelo de derrame facilmente reprodutível, minimamente invasivo e permanente e descrevemos como injetar um biomamaterial no infarto cinco dias após o derrame. O uso do corante fototrombotico Rose Bengala e um laser collimado de 520 nm conectado ao dispositivo estereotaxico nos dá a capacidade de posicionar o curso no córtex motor do mouse com precisão aprimorada. Cinco dias após o derrame, a localização do infarto é visível pelo olho no centro da irradiação, 2,0 mm medio-lateral para o bregma. O hidr...

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Divulgações

Os autores declaram que a TS é fundadora da Tempo Therapeutics, que busca comercializar hidrogéis MAP.

Agradecimentos

Gostamos de reconhecer os Institutos Nacionais de Saúde e o Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC para financiamento (R01NS079691).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Soro de cabra normal a 10%VWR100504-028Para bloquear o tampão
Almofada de álcool de 2 camadas, Estéril, MédioMedlineMDS090735
25uL Seringa Hamilton 702RN, sem agulhade 14824663Fishcer Scientificusadas para injetar biomateriais
25uL Pipeta de deslocamento positivoGilsonM-25
2x Expansor de feixe, 400-650nmThorlabsGBE02-AExpansor de feixe de laser
Plataforma de estágio ajustávelKopf Instruments901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 anticorpo, coelhoAbcam ab113435
Anti-Iba1 Anticorpo, cabraabcam ab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Conjuntos de coleta de sangue. 25G, 12"Medsupply367294Para perfusões
BKF12- Folha de alumínio preta foscaThorlabsBKF12Para cobrir qualquer coisa que seja reflexiva ao usar o laser.
Tesoura Mini Bone Iris - 3-1/2"Instrumentos cirúrgicos Sklar64-2035
C57BL/6 RatosJackson Laboratory0006648-12 semanas de idade
Montagem de gaiola RobThorlabsER3-P43" de comprimento, diâmetro 6mm, pacote com 4 - para anexar laser a esterotax
Fresas de Aço Carbono -0.5mm DiâmetroFerramentas de Ciência Fina19007-05Para criar buracos de rebarba
Sulfato de potássio de cromo (III) dodecahidratadoVWREM1.01036.0250
Controlador compacto para lasers pigtailedThorlabsCLD1010LP
CotonetesVWR89031-288
CP 25 pontas de pipetaGilsonF148012
Burro anti-cabra IgG H& L (488)abcamab150129
Burro Anti-coelho IgG H& L (647)abcamab150075
Burro Anti-rato IgG H& L (555)abcamab150154
EMS DPX MountantElecron Microscopy Sciences13512Solução de montagem para lâminas
EMS Gelatina em pó Tipo A 300 BloomElectron Microscopy Sciences16564Para lâminas de revestimento de gelatina
EMS Paraformaldeído, GranularVWR100504-162Para fazer 45 PFA
ESD Worstation kitElmstatWSKK5324SBNecessidade de configurar a
placa de parede de bancada de fibra a laser, Thorlabs HCA3 sem roscaNecessidade de conectar o laser ao eixo Kopf
FiberPortThorlabsPAF-X-5-AFC / APC & APC, f = 4,6 mm, 350-700 nm, diâmetro 0,75 mm
Tesouras finas - retas / afiadas-contundentes / 10 cmFerramentas de Belas Ciências14028-10
GFAP Anticorpo, ratoThermo Fisher Scientific13-0300
Kopf InstrumentsHP-4M
ImmEdge Hydrophobic BarrierPen Vector LaboratoriesH-4000Para coloração de lâminas
Centro de Anestesia Multipaciente Integrado IMPAC6-VetEquip901808
Almofadas de Preparação de IodoMedx FlexívelMED MDS093917H
Jewlers Fórceps #5GFS produtos químicos46085
Óculos de Segurança a LaserThorlabsLG10BLentes Âmbar, 35% Luz visível (versões do Google disponíveis também)
M27-1084 Poderoso LED Pescoço de GansoDuplo United ScopeLED-11C
Medical USP GradeOxygen AirgasOX USP250
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-gradeIntefra MiltexV96-118
Mini Cord/Cordless Small Animal TrimmerHarvard aparatus72-6110
Mini-bomba de fluxo variávelThomas Scientific70730-064Bomba para perfusões
Cérebro de rato Matrizes, fatias coronais, 1mmKent ScientificRBMA-200cPara fatias TTC
Suporte de cabeça de anestesia de gás de rato CaixaKopf Instruments923-B
Nanojet Cabeçalho de bombaChemxy10051 Chemxy 10051Anexe ao dispositivo estereotáxico para injeção de biomaterial
Barras de ouvido não rompidas 60ºKopf Instruments922
PBS buffer pH 7.4VWR97062 338
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G PinThorlabsLP520-MF100
Lâminas de vidro de carga positivaHaretaAHS90-WH
Medidor de energiaThorlabsPM100DUsado para medir sua saída de laser mW
Pomada Veterinária PuralubeDr. Foster Smith9N-76855
Sonda Retalpara Mouse kopf InstrumentsRet-3-ISO
Rose Bengal Dye 95%Sigma-Aldrich330000-5G
Eixo Modificado 8-32 furo roscado 1/2" profundidadeKopf Instruments1770-02Para conectar o laser ao dispositivo estereotáxico
Sensor de potência de fotodiodo finoThorlabsS130VCUsado com energia de energia medidor
SM1-Threaed 30 mm Placa de gaiola 0,35" de espessura 2Thorlabsde retenção CP02Para conectar expansor de laser
Seringa de insulina Sol-M U-100 com marcações de 1/2 unidade 0,5 mLVWR10002-726Para injetar rosa bengala
Sistema de coloração de slides StainTraySimport ScientificM920-2Para coloração de lâminas
Dispositivo estereotáxicoKopf Instruments940Instrumento Estereotáxico para Pequenos Animais
Student Adson Fórceps -1x2 dentesFine Science Tools91127-12
Pinça Fina para Estudantes - hastes retas/largasFine Science Tools91113-10
Kopf InstrumentsTCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compostoVWR25608-930
Triton X-100VWR97063-864
Grampo de suporte superiorKopf Instruments1770-cPara conectar o laser ao dispositivo estereotáxico
Vetbond Tissue Adhessive 3mLSanta Cruz Biotechnologysc-361931
Vogue Professional My ManicuristBargin Source6400Para Fresas
VWR Bead SterilizersVWR75999-328
Tissue Tek OCT compostoSakura4583Para incorporação de tecidos
Seringas da Placa de aquecimento de controle Agulha RN 30G PT STY 3, 0,5 polegadas Fishcer Scientific NC9459562 Controlador de Temperatura

Referências

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