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Artigo de método

Avaliando o engajamento de alvos celulares por inibidores de fosfattase de PHOsphatase

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DOI:

10.3791/61457

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17 de julho de 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Neste artigo

Resumo

A capacidade de avaliar o engajamento de alvos por inibidores candidatos em células intactas é crucial para a descoberta de drogas. Este protocolo descreve um ensaio de mudança térmica celular de formato 384 que detecta de forma confiável o engajamento de alvos celulares de inibidores visando shp2 tipo selvagem ou suas variantes oncogênicas.

Resumo

O domínio Src-homology 2 (SH2) contendo fosfattase 2 (SHP2), codificado pelo proto-oncogene PTPN11, é um mediador-chave da sinalização celular orientada por tyrosina quinase receptora (RTK), promovendo a sobrevivência celular e a proliferação. Além disso, o SHP2 é recrutado por receptores de ponto de verificação imune para inibir a ativação de células B e T. A função Aberrant SHP2 tem sido implicada no desenvolvimento, progressão e metástase de muitos cânceres. De fato, inibidores de pequenas moléculas SHP2 entraram recentemente em testes clínicos para o tratamento de tumores sólidos com ativação da via Ras/Raf/ERK, incluindo tumores com algumas mutações oncogênicas ras. No entanto, a classe atual de inibidores de SHP2 não é eficaz contra as variantes oncogênicas SHP2 que ocorrem frequentemente em leucemias, e o desenvolvimento de pequenas moléculas específicas que visam o SHP2 oncogênico é o tema da pesquisa atual. Um problema comum com a maioria das campanhas de descoberta de drogas envolvendo proteínas citosósicas como o SHP2 é que os ensaios primários que impulsionam a descoberta química são frequentemente ensaios in vitro que não relatam o engajamento de alvos celulares de compostos candidatos. Para fornecer uma plataforma para medir o engajamento de alvos celulares, desenvolvemos ensaios de mudança térmica celular SHP2 do tipo selvagem e mutantes. Estes ensaios detectam de forma confiável o engajamento de alvos de inibidores de SHP2 nas células. Aqui, fornecemos um protocolo abrangente deste ensaio, que fornece uma ferramenta valiosa para a avaliação e caracterização dos inibidores SHP2.

Introdução

A fosforilação da tyrosina desempenha um papel importante na transdução de sinal nas células1,,2. Esta modificação pós-translacional é catalisada por proteínas tyrosina quinases (PTKs) e revertida por fosfattases de proteína tyrosina (PTPs). Portanto, a aberrante função PTK ou PTP leva a muitas doenças humanas herdadas ou adquiridas3,4,,5,6. O domínio Src-homology 2 (SH2) contendo fosfattase 2 (SHP2) é um PTP não receptor amplamente expresso codificado pelo proto-oncogene PTPN117 e é um regulador-chave de numerosos processos fisiológicos que envolvem transdução de sinal por ativação das vias de sinalização Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt, ou jak/STAT sinalizando caminhos8. Normalmente, a atividade SHP2 é fortemente regulada para evitar sinalizações aberrantes. Sob condições basais, o SHP2 é autoinibido pelo seu domínio SH2 n-terminal, que bloqueia o acesso ao local ativo dentro do domínio fosfatase catalítico(Figura 1A)9,,10. Após a ativação celular, as proteínas de ligação de fosforilalatados de tyrosina recrutam SHP2, fazendo com que adote sua conformação ativa, na qual o local ativo agora está acessível aos seus substratos. Em muitos cânceres, a atividade SHP2 é elevada. Mutações de ganho de função somática (GOF) no PTPN11 foram identificadas principalmente em leucemias e impedem a vinculação do domínio N-SH2 ao domínio fosfatase, resultando em SHP2(Figura 1B)11. Mutações germinas em PTPN11 são responsáveis por ~50% dos casos de síndrome de Noonan, uma desordem de desenvolvimento com risco aumentado de malignidade12. Em tumores sólidos, onde as mutações PTPN11 são raras, maiores níveis de proteínas de ligação fosfoilada levam a uma atividade SHP2 aprimorada(Figura 1C). O SHP2 também é importante para a sinalização de ponto de verificação imune, pois receptores de ponto de verificação como BTLA ou PD-1 recrutam SHP2 para desfosforilarar moléculas-chave de sinalização, impedindo a ativação de células imunes13,,14,,15.

Mirar PTPs com pequenas moléculas tem sido um desafio, pois o local ativo dos PTPs é altamente conservado e altamente carregado; inibidores que visam o local ativo são muitas vezes potentes, mas apresentam pouca seletividade e biodisponibilidade oral16,17,18,19,,20,,21,,22. De fato, muitos inibidores SHP2 relatados sofrem de pouca seletividade e falta de eficácia nas células23. Recentemente, foram relatados inibidores alusivos de SHP2 com boa potência e excelente seletividade (por exemplo, SHP09924 e RMC-455025) e despertaram interesse renovado nos inibidores de SHP2. Compostos baseados em SHP099 e RMC-4550 estão atualmente em ensaios clínicos de fase I para tratar tumores sólidos com ativação da via tyrosina quinase receptora (RTK)26,27. Embora inovadores, esses compostos são ineficazes contra muitos dos mutantes oncogênicos SHP2 que impulsionam a leukemogênese em um número significativo de pacientes com câncer de sangue28,,29,30. Essa falta de potência dos compostos semelhantes ao SHP099 em relação às variantes oncogênicas SHP2 decorre de seu mecanismo alergênico único, pois inibem a atividade SHP2, vinculando e estabilizando a conformação inativa e fechada, que é interrompida em mutantes SHP2. Além disso, com base em um relatório recente31,os mecanismos de resistência adaptativa em pacientes tratados com inibidores semelhantes ao SHP099 são bastante concebíveis. Consequentemente, o desenvolvimento de inibidores SHP2 de próxima geração que visam seu estado ativo e aberto é objeto de intensa pesquisa.

A caracterização dos novos inibidores SHP2 nas células é um aspecto essencial do processo de otimização do chumbo. Criticamente, o engajamento comprovado do inibidor em condições fisiológicas fornece um nível adicional de confiança de que os recursos para a química medicinal são eficientemente implantados em compostos com eficácia celular promissora. No passado, vários métodos para avaliar a ligação de inibidores de pequenas moléculas aos seus alvos foram desenvolvidos, principalmente para as quinases proteicas32. Para desenvolver um ensaio de engajamento de alvos celulares SHP2, utilizamos um ensaio de mudança térmica celular33. Este ensaio, semelhante ao ensaio de mudança térmica in vitro (PTS) para proteínas34,monitora a estabilidade térmica da proteína alvo, que é tipicamente alterada pela ligação de pequenas moléculas. O ensaio original é um ensaio de baixo rendimento que utiliza anticorpos para quantificar os níveis de proteína alvo. Alternativamente, escolhemos uma variante recentemente relatada do ensaio de mudança térmica que utiliza um ensaio de complementação de fragmento de enzima β-galactosidase (EFC)(Figura 2)35. Para esses experimentos, a proteína de interesse é expressa nas células como uma proteína de fusão terminal N ou C carregando uma etiqueta ProLabel aprimorada (ePL, um fragmento de 42 aminoácidos de β-galactosidase). As células são então transferidas para placas compatíveis com PCR de 384 poços e incubadas com compostos de interesse. Um termociclador é utilizado para aplicar um gradiente de temperatura às células, cujas proteínas irão desnaturar e agregar à medida que a temperatura aumenta com base em sua estabilidade térmica. A capacidade de um composto candidato para ligar e estabilizar a proteína de interesse resultará em um aumento da estabilidade térmica dessa proteína. Portanto, seguindo a lise das células, as proteínas marcadas que foram estabilizadas por um composto candidato permanecerão em solução a temperaturas mais altas do que as proteínas marcadas das células incubadas com o controle do veículo. O aceitador de enzimas repórteres (EA) é capaz de complementar as proteínas solúveis marcadas por EPL, resultando em atividade detectável β-galactosidase usando um substrato de luminescência.

Recentemente desenvolvemos um robusto ensaio de mudança térmica celular para SHP2 (SHP2-WT) e uma variante oncogênica SHP2 frequente (SHP2-E76K) em um formato 384-well miniaturizado384-well 36. Aqui, relatamos um protocolo detalhado deste ensaio, que detecta de forma confiável o engajamento de alvos por inibidores de SHP2 nas células e demonstra um alto grau de correlação entre potência inibidora e dados de mudança térmica celular. O fluxo de trabalho de ensaio geral é ilustrado na Figura 3. Nossa plataforma usa proteínas de fusão ePL-SHP2 marcadas em n-terminal. Para a geração dos plasmídeos de expressão correspondentes pICP-ePL-N-SHP2-WT e pICP-ePL-N-SHP2-E76K, consulte nossa recentepublicação 36. Este ensaio pode ser realizado usando um gradiente térmico para estabelecer perfis térmicos SHP2 e determinar temperaturas de fusão SHP2 na presença ou ausência de inibidor. Uma vez estabelecidos perfis térmicos, ele também pode ser realizado em condições istermais, permitindo a avaliação inibidora da dose-resposta. Ambos os tipos de experimentos são descritos abaixo.

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Protocolo

1. Preparação da cultura celular e reagentes

  1. Formule uma garrafa de 500 mL de mídia de crescimento com soro bovino fetal de 10%, 1x antibiótico/antimicocítico, 20 mM HEPES e 1 mM piruvato de sódio. Armazenar a 4 °C.
  2. Descongele os reagentes de mudança térmica celular (reagente EA, tampão de lise e substrato) de garrafas de caldo originais congeladas.
  3. Dispense reagentes e tampão como alíquotas de 2 mL e armazene a -20 °C.
    NOTA: Evite congelar/descongelar para reprodutibilidade e use apenas o volume de reagente necessário para o procedimento de ensaio.

2. Crescimento e manutenção de células HEK293T

  1. Obtenha células HEK293T de baixa passagem do armazenamento crio.
  2. Mantenha as células HEK293T em mídia de crescimento a 37 °C, 5% de CO2.
  3. Células divididas a cada 4 dias em uma proporção de 1:14.
    NOTA: Para melhor desempenho, as células HEK293T não podem passar mais de 25 vezes.

3. Preparação celular HEK293T para transfecção transitória

  1. Desprender células HEK293T de placas de 16 mL usando 3 mL do reagente de descolamento celular.
  2. Diluir com 12 mL de mídia de crescimento. Coletar células por centrifugação a 1.400 x g por 4 min.
  3. Resuspense a pelota em mídia de crescimento de 10 mL. Meça a concentração e viabilidade das células usando azul trypan e um contador celular.
  4. Placa 7.0 x 105 células HEK293T de crescimento exponencial por poço em uma placa de cultura de células de 6 poços aproximadamente 24 horas antes da transfecção.
    NOTA: Reserve um poço para cada plasmídeo ser transfetado.
  5. Incubar por 24 h a 37 °C, 5% DE CO2.

4. Transfecção de células HEK293T

  1. A partir de um estoque plasmídeo purificado de pICP-ePL-N-SHP2-WT ou pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~200 ng/μL) dilui 2 μg de DNA plasmídeo em 200 μL de tampão de transfecção.
  2. Vórtice para 10 s e centrífuga a 1.400 x g por 4 min.
  3. Adicione 4 μL de reagente de transfecção ao DNA diluído. Vórtice para 10 s e centrífuga a 1.400 x g por 4 min.
  4. Incubar a 23 °C por 10 min.
  5. Remova a placa de 6 poços contendo células HEK293T crescentes da incubadora. Adicione a mistura de transfecção às células anexadas na placa de 6 poços. Incubar por 24 h a 37 °C, 5% DE CO2.

5. Preparação de placas de ensaio

  1. Prepare soluções de estoque de 10 mM em DMSO de compostos a serem testados.
  2. Dispense soluções inibidoras em uma placa de origem de volume morto de 384 poços para uso imediato.
  3. Localmente o volume desejado de inibidores ou veículo (DMSO) usando um manipulador líquido em placas PCR em tempo real de 384 poços a um volume final de alvo inferior a 0,5% DMSO (v/v). Sele a placa usando um selador de placas com purificação de gás inerte.
    NOTA: Para ensaios inibidores de dose-resposta, certifique-se de reabastecendo O DMSO de acordo para que quantidades iguais de DMSO sejam usadas para cada concentração inibidora. Para obter melhores resultados, armazene as placas a 23 °C e use placas dentro de 24 horas.

6. Desprendimento e preparação de células transfeinadas

  1. Mídia de crescimento pré-insusulusão e reagente de descolamento celular em um banho de água de 37 °C. Remova as células transfeinadas da incubadora. Aspire suavemente a mídia dos poços da placa.
    NOTA: Use um novo aspirador para cada poço que contenha um plasmídeo transfectado diferente.
  2. Adicione 0,3 mL do reagente do descolamento celular. Balance suavemente a placa para frente e para trás para cobrir completamente a superfície do fundo da placa. Incubar a 23 °C por 2 min.
  3. Adicione 1 mL de mídia de crescimento a cada poço. Mídia de pipeta suavemente e células no poço e transfira para um tubo de centrífuga Falcon de 15 mL. Coletar células por centrifugação a 1.400 x g por 4 min.
  4. Suavemente, mas completamente aspirado fora da mídia.
    NOTA: O fenol residual vermelho no reagente do descolamento celular pode interferir com o ensaio.
  5. Resuspenda cuidadosamente a pelota de célula em 2 mL de mídia de crescimento. Meça a concentração e viabilidade das células usando azul trypan e um contador celular.
    NOTA: A viabilidade celular deve ser > 90% para melhores resultados.
  6. Diluir células a uma concentração de 125 células/μL. Por exemplo, para um ensaio de 5 μL este é ~625 células/μL. Para a viabilidade ideal mantenha as células em suspensão por não mais do que 2 h.

7. Incubação de células com inibidores de SHP2

  1. Distribua células em um cocho de solução de canal único estéril.
  2. Centrifugar 384-bem placa PCR em tempo real que foi pré-preparada pela deposição inibidora SHP2 a 2.500 x g para 5 min a 23 °C.
  3. Remova a vedação da placa composta. Utilizando uma pipeta multicanal de 125 μL, adicione 5 μL das células diluídas aos poços desejados.
  4. Centrifugar a placa a 42 x g por 30 s sem tampa na placa. Coloque uma vedação da tampa na placa depois que a placa for girada e incubar a placa de ensaio a 37 °C, 5% de CO2 por 1h.

8. Preparação da mistura mestre de reagente quimiominescente

  1. Remova a quantidade necessária de reagentes de detecção (reagente EA, tampão de lise e substrato) a partir de -20 °C de armazenamento após células de revestimento. Degelo de reagentes a 23 °C.
    NOTA: Para conveniência na transferência, prepare um volume que seja de 1,5x o volume total de células que foram depositadas na placa. Não reutilize os reagentes após o uso.
  2. Prepare uma mistura mestre dos reagentes utilizando a condição EA-10, que consiste em componente e fração de volume da seguinte forma: reagente EA (0,17), tampão de lise (0,17), substrato (0,67).
    NOTA: As proporções de reagentes são baseadas em experimentos de otimização realizados conforme especificado no manual do fornecedor.

9. Pulso de calor gradiente isotémico ou térmico

  1. Programe o termociclador capaz de gradiente para a entrega de pulso de calor.
    1. Para experimentos de gradiente de perfil térmico, pré-programe o termociclador com as seguintes especificações de exemplo:
    2. Pulso de calor: 3 min de temperatura de fusão desejada (gradiente vertical ou horizontal +/- 15 °C; exemplo 38-68 °C espalhados por 24 poços produz incrementos de temperatura de 1,25 °C).
  2. Passo de recuperação de equilíbrio: 3 min 20 °C com velocidade de rampa = 1 °C/s
    1. Para experimentos isthermal, configure o protocolo configurado da seguinte forma:
    2. Pulso de calor: 3 min 55 °C. Passo de recuperação de equilíbrio: 3 min 20 °C com velocidade de rampa = 1°C/s
      NOTA: Para maior reprodutibilidade, pois pode ser difícil colocar a placa precisamente no momento em que o termociclizador atinge a temperatura desejada, configure o programa para contagem regressiva de 15 s antes de iniciar o pulso de 3 minutos. Para o termociclador utilizado neste experimento ver Tabela de Materiais,a tampa é mantida durante o pulso de calor.

10. Detecção e medição de lise

  1. Asscritos de suplemento com mistura mestre de detecção de lise por adição de volumes iguais (5 μL) a cada poço a ser analisado usando uma pipeta multicanal.
  2. Centrifugar a placa 42 x g para 30 s. Guarde a 23 °C na escuridão por 30-60 min.
  3. Meça a chemiluminescência usando um leitor de microplaca capaz de detectar luminescência em formato 384-well. Realize a medição de luminescência com o tipo de placa e o tempo de integração otimizado (tempo de integração de 1000 ms, tempo de liquidar 0 s). Meça valores como contagens/s e saída para análise posterior.

11. Análise de dados

  1. Analise os dados de luminescência usando um software científico de gráficos e estatísticas 2D.
  2. Gerar perfis térmicos analisando os dados de luminescência normalizados (normalizados para o controle do veículo) utilizando regressão não linear e um modelo boltzmann sigmoidal.
    NOTA: Em experimentos de perfil térmico, o V50calculado , a temperatura que é o meio caminho entre a parte inferior e a parte superior da curva, define a temperatura de fusão de SHP2. Em experimentos isotémicos, a EC50 define a concentração do inibidor que dá resposta semi-máxima.

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Resultados

O experimento de gradiente térmico para SHP2-WT resultou em um perfil térmico celular sigmoidal com uma transição estreita de fusão que é típica e consistente para uma proteína dobrada(Figura 4A). O SHP2 consiste em três domínios independentes: dois domínios SH2 e o domínio catalítico(Figura 1). Na conformação fechada autoinibida esses domínios se auto-associam; a transição de fusão observada no experimento do perfil térmico presumivelmente refletiu esse estado ...

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Discussão

Apresentamos um ensaio de engajamento de alvo que pode confirmar a ligação direta de pequenas moléculas à fosfattase SHP2 nas células. O ensaio pode discriminar entre inibidores de baixa e alta afinidade e, principalmente, confirmar a falta de potência pelos inibidores alergênicos do tipo SHP099 para o mutante SHP2-E76K oncogênico gof. Uma força deste ensaio miniaturizado é sua capacidade de ser integrado em uma campanha de triagem inibidora SHP2. A capacidade do ensaio de confirmar a ligação intracelular ao SHP2 por mat...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (para L. T.), Epstein Family Foundation Award (para N. D. P.C.) e NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Além disso, este projeto foi financiado total ou parcialmente com recursos federais do Instituto Nacional de Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, sob o Contrato nº nº 1 do Consórcio de Biologia Química. HHSN261200800001e. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem menciona nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implicam o endosso do Governo dos EUA. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Termociclador equipado com gradiente de 384 poçosEppendorf AGX50h
Microplaca de baixo volume morto Echo qualificada com 384 poçosBeckman Coulter, Inc.LP-0200
Placas de cultura celular de 6 poçosGreiner Bio-One657 160Estéril com tampa
Antibiótico-Antimicoótico (Anti Anti) 100 XThermo Fisher Scientific15240-062
Contador de célulasThermo Fisher ScientificCondessa II FL
Eagle Medium Modificado da Dulbecco + GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566-016500 mL
Manuseador acústico de líquidos EchoBeckman Coulter, Inc.Echo 550
Pipeta eletrônica multicanalThermo Fisher ScientificE1 ClipTip
Soro fetal bovinoThermo Fisher Scientific26140-079500 mL
Buffer HEPESThermo Fisher Scientific15630-680100 mL
Kit inicial InCell PulseEurofins DiscoverX Corp.94-4007Os componentes incluem buffer EA, buffer de lise e substrato
Leitor de microplacasTecan Trading AGSpark
Canal único de soluçãoThermo Fisher ScientificS253012005
Piruvato de sódioThermo Fisher Scientific11360-010100 mM
Selante térmico de microplacasAgilent Technologies, Inc.PlateLoc
Reagentes de transfecçãoTransfecção PolyplusjetPRIME
Azul de tripanThermo Fisher ScientificT10282
Reagente TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605-010
Placas de PCR em tempo real Twin.tec 384Eppendorf AG30132734

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