Quantificação da área de adesão de substrato celular e distribuições de formas celulares em monocamadas de células MCF7

Summary

O artigo descreve a quantificação de 1) o tamanho e o número de aderências focais e 2) índice de forma celular e sua distribuição a partir de imagens confocal das monocamadas confluentes das células MCF7.

Abstract

Os métodos aqui apresentados quantificam alguns parâmetros de monocamadas de células aderirentes confluentes de múltiplas imagens confocais adequadamente manchadas: adesão ao substrato em função do número e tamanho das aderências focais, e forma celular, caracterizada pelo índice de forma celular e outros descritores de forma. As aderências focais foram visualizadas pela coloração de paxillin e as bordas das células celulares foram marcadas pela plakoglobina de junção e actina. Os métodos de cultura celular e coloração eram padrão; as imagens representam planos focais únicos; a análise de imagens foi realizada utilizando-se software de processamento de imagens disponível publicamente. Os protocolos apresentados são usados para quantificar o número e o tamanho das aderências focais e as diferenças na distribuição de formas celulares nas monocamadas, mas podem ser reaproveitados para a quantificação do tamanho e forma de qualquer outra estrutura celular distinta que possa ser manchada (por exemplo, mitocôndrias ou núcleos). Avaliar esses parâmetros é importante na caracterização das forças dinâmicas na camada celular aderente, incluindo adesão celular e contratilidade de actomyosina que afeta a forma celular.

Introduction

As monocamadas de células epiteliais atuam como um coletivo no qual a adesão célula-célula e substrato de células, bem como forças e tensões contratuais representam parâmetros importantes e seu equilíbrio adequado contribui para a integridade geral da unidade^1,,2,,3. Assim, avaliar esses parâmetros representa uma forma de estabelecer o estado atual da camada celular.

Os dois métodos descritos aqui representam uma análise bidimensional das monocamadas confluentes de células epiteliais aderentes (neste caso, linha de células cancerígenas de mama MCF7....

Protocol

1. Etapas preparatórias

1. Semeadura celular para obter monocamadas confluentes
   1. Antes de semear, cubra os poços de um escorregador de câmara de 4 poços com colágeno I (ou outro componente ECM de escolha). Para revestimento de colágeno I, siga um protocolo comercial: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html a uma concentração de 8 μg/cm².
   2. Semente 400.000 células para um poço de um deslizamento de câmara de 4 poços.
   3. Cultue as células por 24h (ou mais, dependendo dos pontos finais experimentais) antes de coloração, em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO₂. Est....

Results

Análise de adesão focal
O knockdown do gene HAX1 foi anteriormente mostrado para afetar as aderências focais⁶. As células foram cultivadas na superfície revestida de colágeno por 48 h. Imagens das células de controle MCF7 e células MCF7 com um knockdown HAX1 (HAX1 KD) de três experimentos independentes manchados com proteína de adesão focal paxillin foram obtidos usando um microscópio confocal (imagem de plano focal único/fatia Z da região basal). As .......

Discussion

A adesão célula-célula e substrato celular constituem atributos inerentes às células epiteliais e desempenham o papel crítico na morfogênese tecidual e embriogênese. Nos tecidos adultos, a regulação adequada das propriedades mecânicas da camada celular é crucial na manutenção da homeostase e na prevenção de respostas patológicas como progressão do tumor e metástase. O tamanho e o número de aderências focais dependem da força da adesão do substrato celular, enquanto a forma celular depende das forças contratuais e está re.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	anti-coelho de cabra, 1:500
Cloreto de amônio	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Colágeno da pele de bezerro	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (estoque 1 mg/mL em H2O), ácido nucleico coloração
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Piruvato	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Junção plakoglobina	Cell Signaling	2309S	coelho, 1:400
Gabinete de fluxo laminar classe 2	Equipamento padrão	Alpina
MCF7-basedHAX1KD linha celular	Linha celular estabelecida no Instituto Nacional de Oncologia, Varsóvia, descrita em Balcerak et al., 2019		Linha celular MCF7 comHAX1linha
celular knockdown MCF7 (CONTROLE)	ATCC	ATCC HTB-22	epitelial, linha celular de câncer de mama aderente
Microscópio óptico Olympus CK2 Olympus
Paxilina	Abcam	ab32084	coelho, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
conjugado Faloidina-TRITC	Sigma	P1951	1:400 (estoque 5 mg/mL em DMSO), marcação de actina
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST • NaCl	Sigma	S9888
TBST • Microscópio confocal Zeiss da base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
			LSM800