Isolamento de núcleos de tecido inteiro usando um método detergente e sem enzimas

Resumo

O isolamento de núcleos únicos depende da dissociação e da permeabilização baseada em detergente da membrana celular, passos que precisam de otimização e são propensos a introduzir artefatos técnicos. Demonstramos um protocolo detergente e sem enzimas para o rápido isolamento de núcleos intactos diretamente de todo o tecido, produzindo núcleos adequados para RNA-seq de núcleo único (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

Resumo

Transcrição de alta taxa e profilamento de epigenome requer a preparação de uma única célula ou suspensão de núcleos únicos. A preparação da suspensão com células ou núcleos intactos envolve dissociação e permeabilização, etapas que podem introduzir ruído indesejado e danos indesejáveis. Particularmente, certos tipos de células, como neurônios, são desafiadores para dissociar em células individuais. Além disso, a permeabilização da membrana celular para liberação de núcleos requer otimização por tentativa e erro, o que pode ser demorado, trabalhoso intensivo e financeiramente inviável. Para aumentar a robustez e a reprodutibilidade da preparação da amostra para sequenciamento de alta produtividade, descrevemos um método rápido de isolamento de núcleos baseados em colunas sem enzimas e detergente. O protocolo permite o isolamento eficiente dos núcleos de todo o cérebro de zebrafish dentro de 20 minutos. Os núcleos isolados exibem morfologia nuclear intacta e baixa propensão a agregar. Além disso, a citometria de fluxo permite o enriquecimento dos núcleos e a liberação de detritos celulares para aplicação a jusante. O protocolo, que deve funcionar em tecidos moles e células cultivadas, fornece um método simples e acessível para a preparação de amostras que pode ser utilizado para perfis de alto rendimento, simplificando as etapas necessárias para experimentos de RNA-seq e ATAC-seq bem-sucedidos.

Introdução

RNA-seq unicelular (scRNA-Seq) e ATAC-seq são ferramentas versáteis para estudar sistemas biológicos complexos em resolução unicelular. Eles são amplamente utilizados para definir subtipos e estados celulares, redes genéticas e para avaliar a heterogeneidade celular. Um pré-requisito para a realização do SCRNA-seq é a preparação de uma única suspensão celular por dissociação tecidual. Devido à variação da composição da matriz extracelular e das propriedades mecânicas, os tecidos individuais requerem otimização do protocolo de dissociação para a preparação da suspensão celular única.

A dissociação de tecidos em células únicas normalmente envolve o tratamento com enzimas digestivas, incluindo colagenase, dispase ou trippsina, a 37 °C^1,,2,3,4. Como o maquinário transcricional permanece ativo a 37 °C, a dissociação enzimática pode introduzir artefatos de expressão mRNA e ruído^5,6. Notavelmente, a incubação prolongada pode induzir genes responsivos ao estresse e resposta ao choque térmico de forma não uniforme – levando à variabilidade técnica no experimento⁷.

Outra desvantagem de gerar uma única suspensão celular é a dificuldade em obter tipos de células viáveis e intactas com morfologias complexas. Em particular, neurônios, adipócitos e podocitos são desafiadores para isolar^8,,9,10,11. Por exemplo, Wu e colegas demonstraram a ausência de podocitos glomerulares em perfis de scRNA de um rim de camundongo adulto¹². Observações não ocetimais semelhantes foram feitas em relação à recuperação de neurônios interconectados do tecido cerebral^8,,13,14. Em suma, os protocolos de dissociação podem introduzir viés de detecção para facilitar a dissociação de tipos celulares, levando a uma deturpação da arquitetura celular do órgão.

Para superar o ruído técnico e o viés introduzidos durante a preparação da amostra em scRNA-Seq., o isolamento e o perfil do núcleo fornecem uma alternativa atraente. Como a morfologia nuclear é semelhante entre diferentes tipos de células, o isolamento dos núcleos contorna a questão de isolar células intactas e viáveis com morfologias complexas. Por exemplo, Wu e colegas demonstraram o perfil bem sucedido de podocitos glomerulares com o RNA-Seq. (snRNA-Seq.) de um rim de rato adulto, que estava faltando de scRNA-Seq¹². Curiosamente, estudos comparativos entre RNA-seq unicelular e de núcleo único sugeriram uma diminuição na indução de genes de estresse e resposta ao choque térmico com snRNA-Seq¹². Os estudos sugerem ainda uma alta correlação entre os genes detectados pelos dois métodos. No entanto, um estudo recente sobre microglia humana falhou em detectar ativação genética na doença de Alzheimer¹⁵. Assim, em certos contextos, o snRNA-Seq é uma alternativa adequada para o scRNA-Seq^16,17. Além disso, o isolamento nuclear pode ser utilizado para atac-seq., fornecendo informações sobre as regiões de cromatina aberta dentro de células individuais.

O protocolo de isolamento dos núcleos envolve três passos principais: i) lise à base de detergente da membrana celular para liberar o núcleo; ii) homogeneização tecidual utilizando um homogeneizador do Dounce; e iii) enriquecimento dos núcleos e remoção de detritos celulares utilizando centrifugação gradiente ou citometria de fluxo^{18,19,,20,,21,22}. Entre isso, os dois primeiros passos dependem do tipo de tecido e precisam ser otimizados empiricamente. Detergente suave leva à ruptura parcial da membrana celular e recuperação ineficiente dos núcleos do tecido²³. Por outro lado, o alto nível de detergente e homogeneização dura leva à ruptura da membrana nuclear e sua perda^24,25. Núcleos rompidos tendem ainda a se agrupar e formar agregados, que se não forem removidos podem levar a artefatos no experimento de perfil a jusante.

Para contornar as questões relacionadas à otimização de detergentes para isolamento de núcleos, introduzimos um protocolo para isolar núcleos intactos de amostras frescas usando um método baseado em detergente e spin-column. O protocolo produz núcleos de órgãos inteiros dentro de 20 minutos, limitando a indução da transcrição artefatoual. Os núcleos isolados podem ser enriquecidos com FACS para RNA-Seq. e ATAC-seq, fornecendo um método simples e universal que permite um perfil robusto e reprodutível de alto rendimento.

Protocolo

Todos os procedimentos apresentados abaixo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos institucionais (Université Libre de Bruxelles (ULB)) e nacionais de ética e bem-estar animal, que foram aprovados pela Comissão ética para o bem-estar animal (CEBEA) da Université Libre de Bruxelles (protocolos 578N-579N).

1. Preparação antes da dissecação do tecido

1. Prepare 0,2% solução tricaine na PBS para eutanásia do zebrafish. Esfrie a solução no gelo.
2. Prepare uma placa de Petri de 30 mm para picar o tecido.
3. Prepare o frio frio 1x PBS (10 mL por amostra de tecido).
4. Esfrie a centrífuga a 4 °C.
5. Para isolamento dos núcleos, utilize um kit de isolamento de núcleos sem detergente(Tabela de Materiais).
6. Antes de iniciar o protocolo, o tampão pré-frio A e B fornecidos no kit, colocando-os no gelo por pelo menos 30 minutos antes do isolamento dos núcleos.
7. Para manusear os núcleos isolados, cubra os reagentes plásticos, como tubos e pontas de pipeta com solução 5% BSA. Para isso, prepare a solução dissolvendo 2 g de BSA em 40 mL de PBS. O revestimento de itens plásticos com 5% de BSA reduz os núcleos grudados no plástico. Esta etapa melhora a recuperação de núcleos isolados.
8. Cubra as pontas da pipeta pipeta 5% de solução BSA 2-3 vezes. Seque as pontas por 2 horas. Prepare 10 pontas plásticas por amostra.
9. Cubra os tubos para coleta de núcleos, preenchendo-os com 5% de BSA. Inverta os tubos 3 vezes para garantir um revestimento eficiente. Remova a solução e seque os tubos de cabeça para baixo em um papel de tecido limpo por 2 horas. Por amostra, cubra um tubo de coleta fornecido no kit. Além disso, prepare tubos revestidos de 1,5 mL para coleta de núcleos após FACS.
   NOTA: As pontas de vidro são uma alternativa altamente recomendada às pontas de pipeta de plástico para minimizar a aderência.

2. Dissecção do cérebro de zebrafish

1. Para eutanásia do zebrafish, prepare uma placa de Petri de 90 mm com 25 mL de solução tricaine gelada.
2. Cuidadosamente, pegue o zebrafish do tanque usando uma rede de pesca e coloque-o na placa de Petri.
3. Eutanize o peixe deixando-o em Tricaine por 5 minutos.
4. Decapite o animal com uma lâmina afiada.
5. Usando fórceps, abra suavemente o crânio e remova tecidos moles, pele e ossos do lado ventral e dorsal do crânio.
6. Suavemente, transfira o cérebro para um prato fresco de 30 mm contendo PBS gelado.
7. Pique o cérebro em pequenos pedaços usando uma lâmina de barbear para facilitar o carregamento da amostra na coluna de spin.

3. Isolamento de núcleos únicos

1. Transfira o tecido picado para o cartucho de filtro fornecido no kit de isolamento dos núcleos e adicione 200 μL de tampão frio A para sensibilizar o tecido. Triture o tecido usando a haste de plástico fornecida pelo kit por 2 minutos.
2. Adicione 300 μL de tampão frio A e incubar o cartucho do filtro no gelo com tampa aberta por 10 minutos.
3. Tampe o cartucho e resuspense o tecido invertendo o tubo 5 vezes.
4. Centrifugar a 16.000 x g por 30 s. Nesta etapa, as células são rompidas ao passar pelo filtro e a força centrífuga de alta velocidade é aplicada. O fluxo contém núcleos intactos, que pelotam na parte inferior do tubo.
5. Descarte o filtro e resuspenque a pelota vórtice vigorosamente por 10 s.
6. De pelota os núcleos centrifugando a solução a 500 x g por 3 min. Descarte o supernasce cuidadosamente, pois a pelota dos núcleos é incolor.
7. Resuspengue a pelota em 0,8 mL de tampão frio B e centrífuga a 600 x g por 10 min. Nesta etapa, os núcleos são separados dos detritos da membrana. A pelota incolor obtida contém núcleos isolados.
8. Resuspend os núcleos isolados em 500 μL de PBS com 5% de BSA. Mantenha a suspensão dos núcleos no gelo para realizar FACS após a quantificação.

4. Visualização da morfologia dos núcleos

1. Confirme a morfologia nuclear pela coloração de Hoechst. Para isso, remova 100 μL de suspensão de núcleos únicos em um novo tubo usando pontas revestidas de BSA. Para colorar os núcleos, adicione 0,1 μL de Hoechst (1 mg/mL). Gentilmente vórtice do tubo.
2. Transfira a suspensão dos núcleos para a placa de fundo de vidro para a imagem.
3. Imagem dos núcleos usando um microscópio de fluorescência com configurações de excitação a laser de ~405 nm (Violet) comprimento de onda.

5. Enriquecimento baseado em FACS de núcleos

1. Antes de realizar o FACS, filtre os núcleos usando um coador de células de 40 μm no tubo revestido de BSA.
2. Diluir a suspensão filtrada adicionando PBS com 5% de BSA a um volume final de 1.000 μL.
3. Rotule dois tubos FACS de fundo redondo como 'controle' e 'manchado'. O tubo de "controle" conterá núcleos não manchados, enquanto o tubo 'manchado' terá núcleos manchados de Hoechst.
4. Transfira 250 μL da suspensão dos núcleos para o tubo de 'controle' usando a ponta de pipeta revestida BSA.
5. Transfira a solução restante de 750 μL para o tubo FACS rotulado como 'manchado' e adicione 1 μL de corante Hoechst para manchar os núcleos. Misture por vórtice lento.
6. Carregue a amostra de controle não manchada para o classificador celular. Recorde de 5000 eventos.
7. Carregue as amostras manchadas e grave 5000 eventos.
8. Desenhe portões FACS que permitam a identificação de núcleos únicos. Os núcleos podem ser selecionados comparando o sinal de fluorescência hoechst entre controle e amostra manchada.
9. Classifique núcleos hoechst positivos do tubo manchado em um novo tubo de 1,5 mL contendo 50 μL de PBS com 5% de BSA.
   NOTA: Núcleos isolados podem ser coletados em um meio desejado de acordo com os requisitos da aplicação a jusante.

Resultados

--O protocolo descrito acima foi usado para gerar suspensão de núcleo único diretamente do tecido cerebral de zebrafish. O isolamento normalmente requer 20 minutos e evita o uso de detergente ou enzima digestiva. Um esquema resumindo as etapas individuais do protocolo é fornecido na Figura 1, que pode ser impressa para ser usada para orientação.

Figura 1: Esquema do método baseado em coluna spin sem detergente para isolamento de núcleos.
Representação gráfica das etapas individuais realizadas durante a extração de núcleos a partir de tecido cerebral de zebrafish fresco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Visualização da morfologia nuclear

Para confirmação qualitativa da morfologia nuclear, os núcleos isolados foram manchados com Hoechst e visualizados por microscopia de fluorescência. Os núcleos pareciam intactos, redondos e bem separados(Figura 2). Importante, a agregação nuclear, um sinal de ruptura da membrana nuclear, estava ausente.

Figura 2: Isolamento de núcleos únicos do cérebro de zebrafish.
Imagem de microscopia de fluorescência de núcleos manchados de Hoechst demonstrando sua morfologia intacta. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Enriquecimento baseado em FACS dos núcleos intactos

O enriquecimento de núcleos isolados e a remoção de detritos celulares foram realizados por citometria de fluxo, gating na presença de um sinal de fluorescência hoechst. O sinal hoechst foi detectado após excitação com violeta, 405 nm, laser (Brilhante Violet 421 – BV421). Núcleos não manchados apresentaram fluorescência de fundo(Figura 3A, Figura Suplementar 1A), enquanto núcleos manchados apresentaram forte sinal fluorescente(Figura 3B, Figura Suplementar 1B). Como ilustrado na Figura 3C,os núcleos manchados e hoechst estavam bem segregados no canal violeta.

Figura 3: Núcleos isolados apresentam sinal fluorescente Hoechst forte e específico na citometria de fluxo.
Tramas histogramas para suspensão de núcleos únicos exibindo a distribuição da coloração de Hoechst. Hoechst é animado por violeta, 405 nm, laser (Brilhante Violeta 421 – BV421). A amostra não manchada (A) exibe sinal na faixa de 10^-103, enquanto os núcleos manchados de Hoechst(B) emitem sinal na faixa^{10 3}-10^5. Uma sobreposição de intensidade de fluorescência emitida por amostras não manchadas (cinza) e manchadas (azul)(C)demonstra clara separação entre as duas populações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Estratégia de gating de citometria de fluxo para núcleos isolados. Parcelas de fluxo representativas para suspensão de núcleos isolados. Núcleos isolados foram analisados utilizando dispersão dianteira e laser violeta BV421 que excita Hoechst a 405 nm. A amostra não manchada(A)exibiu sinal BV421 na faixa¹⁰-10^3. Dos 13.130 eventos, 141 eventos foram detectados como núcleos únicos baseados no FSC-A (1,07% do total) e 0 eventos para núcleos não manchados com base no sinal BV421 (0% do total). Os núcleos manchados de Hoechst (B) exibiram sinal BV421 na faixa^{10 3}-10^5. Dos 5.0000 eventos, 2418 eventos foram detectados como núcleos únicos baseados no FSC-A (4,84% do total) e 2414 eventos para núcleos hoechst-positivos com base no sinal BV421 (4,83% do total). Clique aqui para baixar este número.

Discussão

Traçar o perfil do transcriptome e do epigenome em uma resolução unicelular revolucionou o estudo dos sistemas biológicos. Estudos na resolução de uma única célula para um tecido sólido dependem da dissociação do órgão em células individuais ou núcleos. Dissociação é um procedimento destrutivo que pode introduzir artefatos técnicos, que podem impedir o desenvolvimento de uma representação precisa do sistema^5,6. Por exemplo, a dissociação enzimática pode prejudicar células com morfologias complexas, como neurônios ou podocitos, e pode induzir a expressão de genes de estresse e resposta ao choque térmico^7,,12. Além disso, o uso de detergente durante a dissociação pode romper a membrana nuclear e levar à agregação^23,25. Assim, otimizar a dissociação para obter uma única suspensão celular ou núcleo da mais alta qualidade é primordial para o sucesso de experimentos de perfil de alto rendimento.

Aqui, demonstramos um método de isolamento de núcleos livre de detergente e enzimas que permite a extração de núcleos intactos do cérebro de zebrafish em menos de 20 minutos. O protocolo produz núcleos com morfologia típica e integridade robusta(Figura 2). De um único cérebro de zebrafish pesando 6 mg, o protocolo produz um total de 60.000 núcleos determinados por uma contagem de hemítmetros. Os núcleos isolados podem ser utilizados para múltiplas aplicações a jusante, incluindo snRNA-seq, ATAC-seq e imunostaining. Os núcleos isolados podem incluir contaminação cruzada de frações citoplasmáticas, particularmente de componentes de órticulum endoplasmático e mitocôndrias. Para experimentos de perfil de alto rendimento, a liberação de detritos celulares, particularmente mitocôndrias, é fortemente recomendada. A citometria de fluxo(Figura 3)fornece uma opção viável para purificação de núcleos. Alternativamente, o gradiente de sacarose também pode ser utilizado para a remoção de detritos.

O protocolo foi testado na glândula tireoide do camundongo (dados não mostrados) e fornece resultados semelhantes ao tecido cerebral de zebrafish. No geral, o protocolo fornece um método robusto, reprodutível e universal para a preparação de suspensão de núcleo único, ajudando a simplificar a logística para experimentos de perfil de alto rendimento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino (BSA)	Carl Roth	90604-29-8 Fração de	albumina V
Classificador de células	BD Biosciences		FACSAria III
Centrífuga	Sartorius	A-14C
Eppendorf tubos Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	22363204
Falcon (15 mL)	Tubos
Falcon (5 mL)	Tubos de ensaio de fundo redondo de poliestireno	352052	Corning
Fine forceps	Ferramentas Fine Science	11295-10
Filtro de célula Flowmi (40 μ m)	Microscópio de	Sigma BAH136800040
	Leica	DMI6000 B
Frasco de vidro (250 mL)	VWR	215-1593
Prato com fundo de vidro	World Precision Instruments	FD3510-100	Fluorodish 35 mm
Pipetas de vidro	Pasteur VWR	612-1701
Soquete de pipeta de vidro	Carl Roth	388.1	Auxiliar de pipetagem pi-pump 2500
Solução de corante de coloração Hoechst	Abcam	ab228551	Hoechst 33342
Kit de isolamento de núcleos sem detergente Invent	Biotechnologies	NI-024
PBS (10X)	ThermoFisher	70011069
(30 mm)	FisherScientific	11333704	Pyrex
(90 mm)	Ponteiras de Pipeta Corning	758-10178-CS	Gosselin
	VWR	89079	10 μ L, 200 μ L, 1000 μ L
Pipetas	Gilson	F167380	Pipetman
Lâmina de barbear	Swann-Morton	7981809
Tricaine metano sulfonato	Sigma	E10521
Máquina de vórtice	Scientific Industries	SI-0236	Vortex-Genie 2