Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

Resumo

Aqui, descrevemos um método para aquecer blastocistos humanos vitrificados, culminando-os através do período de implantação in vitro, digerindo-os em células únicas e coletando células trophoblastas precoces para uma investigação mais aprofundada.

Resumo

A implantação humana, a apposição e a adesão à epitélia da superfície uterina e a subsequente invasão do blastocisto na decidua materna, é um evento biológico crítico, mas enigmático, historicamente difícil de estudar devido a limitações técnicas e éticas. A implantação é iniciada pelo desenvolvimento do trophectoderm ao trophoblasto e posterior diferenciação em sublineagens trophoblastos distintas. A diferenciação do trophoblasto precoce aberrante pode levar à falha de implantação, patologias placentárias, anormalidades fetais e aborto. Recentemente, foram desenvolvidos métodos para permitir que embriões humanos cresçam até o dia 13 pós-fertilização in vitro na ausência de tecidos maternos, período de tempo que abrange o período de implantação em humanos. Isso deu aos pesquisadores a oportunidade de investigar a implantação humana e recapitular a dinâmica da diferenciação do trophoblasto durante esse período crítico sem confundir influências maternas e evitar obstáculos inerentes ao estudo de eventos de diferenciação de embriões precoces in vivo. Para caracterizar diferentes sublinemas trophoblastos durante a implantação, adotamos métodos de cultura estendidos bidimensionais (2D) existentes e desenvolvemos um procedimento para digerir esnzimaticamente e isolar diferentes tipos de células trophoblastos para ensaios a jusante. Embriões cultivados em condições 2D têm uma morfologia relativamente achatada e podem ser subótimos na modelagem in vivo tridimensionais (3D) arquiteturas embrionárias. No entanto, a diferenciação do trophoblasto parece ser menos afetada, como demonstrado pela morfologia antecipada e mudanças na expressão genética ao longo da cultura estendida. Diferentes sublineagens trophoblastos, incluindo citotrofoblasto, sinintólogo e trophoblasto migratório podem ser separadas por tamanho, localização e emergência temporal, e usadas para caracterização ou experimentação. A investigação dessas células trophoblastos precoces pode ser fundamental na compreensão da implantação humana, no tratamento de patologias placentárias comuns e na mitigação da incidência de perda de gravidez.

Introdução

A implantação humana e o surgimento da placenta precoce são historicamente difíceis de investigar e permanecem em grande parte desconhecidos porque os tecidos humanos são inacessíveis nesta fase em que a gravidez é clinicamente indetectável. Modelos animais são inadequados, pois a placenta humana tem suas próprias características únicas em comparação com outros mamíferos euterianos. Por exemplo, a placenta humana invade profundamente a decidua com algumas células trophoblastas atingindo pelo menos o terço interno do miométrio uterino, enquanto outras células remodelam as artérias espiral uterinas. Mesmo nossos ancestrais evolutivos mais próximos, os primatas não humanos, mostram diferenças na morfologia placentária e interações trophoblastos com os tecidos deciduais maternos^1,,2,3. A obtenção de embriões humanos pré-implantação in vitro não era possível até a década de 1980, quando a fertilização in vitro humana clínica (FIV) começou como uma prática de rotina para o tratamento da infertilidade⁴. Agora, blastocistos humanos podem ser cultivados in vitro para permitir a seleção de embriões mais viáveis para transferência, bem como permitir testes genéticos seguros. A melhoria das técnicas de cultura de embriões, bem como o uso crescente de FIV, produziram muitos blastocistos excedentes que permanecem após a conclusão dos ciclos de tratamento do paciente. Com o consentimento do paciente, aprovação do IRB e com certas restrições, esses blastocistos podem ser utilizados para estudos de pesquisa. Tornaram-se um recurso inestimável que foi utilizado para a derivação de células-tronco embrionárias humanas⁵, entendendo a transição da massa celular interna para células-tronco embrionárias^6,,7e, mais recentemente, foram cultivadas com sucesso até o dia (D) 13 para remodelar a implantação humana^8,,9. Ao utilizar abordagens de omics unicelulares recém-desenvolvidas, o acesso a esses tecidos embriões humanos em estágio de implantação tem oferecido oportunidades únicas para descrever os mecanismos moleculares que regulam esse processo de diferenciação celular altamente dinâmico, que antes eram impossíveis de explorar^{10,,11,,12,13}.

Aqui, descrevemos os métodos utilizados em nossa recente publicação caracterizando a dinâmica da diferenciação do trophoblasto durante a implantação humana¹². Este protocolo inclui o aquecimento de blastocistos vitrificados, cultura de embriões estendida até D12 pós FIV, digestão enzimática do embrião em células únicas e coleta de células para ensaios a jusante(Figura 1). Este sistema de cultura estendida apoia o desenvolvimento de embriões humanos em estágio de peri-implantação sem insumo materno e recapitula a diferenciação do trophoblasto que parece consistente com as observações feitas a partir de espécimes histológicos há muitos anos^{14,,15,,16,17}. Durante a implantação, a população de trophoblasto é composta por pelo menos dois tipos de células: o citotrofoblasto progenitor mononucleado (CTB) e o sintiotrofost (STB) internucleado, diferenciado terminalmente diferenciado. Após a digestão da trippsina, o CTB são células pequenas e redondas que são morfologicamente indistinguíveis de outras linhagens celulares(Figura 2A, painel esquerdo). A separação do CTB de outras linhagens celulares, como epiblasto e endoderme primitivo, pode ser alcançada por seus distintos perfis transcriômicos revelados pelo sequenciamento de RNA de célula única. As células sincitotrofoblastos podem ser facilmente identificadas como estruturas de forma irregular que são significativamente maiores que os outros tipos de células e localizadas principalmente na periferia do embrião (Figura 2A, painel médio; Figura 2B, painel esquerdo). As células de trophoblasto migratório (MTB) são outra sublineagem trophoblasto encontrada durante a cultura estendida do embrião e podem ser reconhecidas como aparentemente se afastando do corpo principal do embrião (Figura 2A, painel direito, Figura 2B, painel direito). O trophoblasto migratório, embora expresse muitos dos mesmos marcadores do trophoblasto extra villous (EVT), não deve ser referido como EVT, uma vez que as estruturas villous na placenta não surgiram neste estágio inicial de desenvolvimento.

Experimentalmente, conseguimos coletar pequenos CTB e STB grandes que são facilmente distinguíveis depois que embriões são digeridos em células únicas em D8, D10 e D12 (Figura 2A,B). Os trophoblastos migratórios surgem nos estágios posteriores da cultura de embriões estendidos e podem ser coletados em D12 antes da digestão enzimática de todo o embrião (Figura 2A,B). Ao separar fenotipicamente essas três sublineagens trophoblastos antes da análise de células únicas, podemos identificar marcadores transcriômicos específicos e definir o papel biológico de cada tipo de célula. O citotrofoblasto é altamente proliferativo e atua como células progenitoras no fornecimento das linhagens diferenciadas STB e MTB^{10,,11,,12,,13}. O sinintismotrofã está envolvido na produção de hormônios placentários para manter a gravidez e também pode ser responsável pelos embriões que penetram no endométrio^10,,11,12,13. O trophoblasto migratório tem características ainda mais fortes de um fenótipo migratório invasivo e migratório e são provavelmente responsáveis pela colonização mais profunda e extensa do endométrio uterino^{10,,11,,12,13}. Após a definição da assinatura transcriômica de cada tipo de célula, as análises de agrupamento também revelaram dois subconjuntos adicionais de células que eram morfologicamente indistinguíveis da CTB e tinham transcriptomes com características de STB e MTB,^{respectivamente 12}. Essas células de estágio intermediário provavelmente estão no processo de diferenciação do CTB para as sublineagens MTB ou STB e teriam sido negligenciadas se os embriões fossem digeridos cegamente e as células fossem separadas apenas por transcriptome.

O protocolo descrito aqui utiliza um sistema de cultura bidimensional (2D) e pode não ser ideal para suportar o desenvolvimento estrutural tridimensional (3D), como sugerido por uma publicação recente descrevendo um recém-desenvolvido sistema de cultura 3D¹³. No entanto, neste sistema 2D a diferenciação do trophoblast precoce parece ser consistente com observações feitas a partir de espécimes in vivo^{14,,15,,16,17}. Este protocolo também pode ser facilmente adaptado para o uso no recém-descrito sistema de cultura 3D¹³ com mudanças mínimas. Todas as etapas são realizadas com uma pipeta de micromanipulação portátil com pontas descartáveis comercialmente disponíveis ou uma pipeta bucal de uma pipeta de vidro finamente puxada presa a tubos de borracha, um filtro e um porta-voz.

Protocolo

Todos os embriões humanos foram doados com consentimento para uso em pesquisa. Os protocolos para a cultura estendida do embrião humano foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional ocidental (estudo nº 1179872) e seguem diretrizes internacionais. Qualquer uso de embriões humanos deve ser revisto pelos órgãos de ética e governo adequados associados à instituição de pesquisa por meio deste protocolo.

1. Preparação

1. Prepare a mídia e as placas de recuperação um dia antes do aquecimento do embrião em um capô de fluxo laminar estéril.
   1. Prepare 2 mL de mídia de cultura blastocisto (BM) com 10% v/v substituto de proteína sérico (SPS).
      NOTA: A mídia de cultura blastocisto pode ou não conter proteína adicionada. Aqui, utilizamos um meio que deve ser suplementado com 10% da proteína albumina indicada. Verifique as orientações do fabricante para obter a variação desta suplementação. Todas as mídias devem ser filtradas usando um filtro estéril de 0,22 μM conectado a uma seringa estéril antes do equilíbrio.
   2. Encha dois pratos de lavagem de cultura de órgãos de centro-bem com 500 μL de BM com 10% v/v SPS cobertos com 500 μL de óleo de grau de cultura embrionária.
   3. Em um prato de cultura de tecido de 60 mm, camada 8 mL de óleo de cultura de embriões e, em seguida, ancorar 20 gotas de μL de BM com 10% v/v SPS para o fundo da placa de cultura. Faça 1 gota para cada embrião aquecido.
      NOTA: Mais mídia, gotas e lavar pratos podem ser feitos conforme necessário. As gotas também podem ser adicionadas ao prato antes que o óleo seja em camadas. As gotas de ancoragem sob o óleo ajudarão a reduzir a evaporação e quaisquer alterações subsequentes na osmolalidade.
   4. Equilibre a BM com 10% v/v SPS lavar pratos e placa de recuperação em uma incubadora a 37 °C, 6% DE CO_2, 5% O₂ por pelo menos 4h.
   5. Descongele um frasco da primeira etapa da mídia de cultura estendida (IVC1) em 4 °C ou na parte superior do banco.
   6. Prepare um prato de lavagem de 500 μL de IVC1 sem sobreposição de óleo. Alíquota de aproximadamente 4 mL de IVC1 em um tubo de tampa de snap de 5 mL.
   7. Equilibre o prato de lavagem IVC1 e pequeno tubo de tampa de estalo de IVC1 em 37 °C, 6% CO₂ e O₂ atmosférico por pelo menos 4 h.
2. Prepare placas de cultura estendidas um dia antes do aquecimento do embrião em uma capa de fluxo laminar estéril.
   1. Fibronectina diluída do soro humano em soro tamponado de fosfato (PBS) a 30 μg/mL. Serão necessários 250 μL de fibronectina de 30 μg/mL por embrião para revestir as câmaras.
   2. Abra o pacote de tampas bem câmara sob o capô enquanto toma cuidado para não tocar nos poços. Pipeta suavemente 250 μL de 30 μg/mL fibronectina em cada poço.
   3. Retorne a tampa para o deslizamento de cobertura câmara e coloque em 4 °C para 20-24 h.
3. Prepare a placa de cultura estendida na manhã do aquecimento do embrião.
   1. Recupere o deslizamento de cobertura com fibronectina e coloque na capa de fluxo laminar. Remova a mistura de fibronectina com uma pipeta de 1 mL e descarte no recipiente de resíduos.
   2. Recuperar mídia IVC1 aquecida e equilibrada a partir de um pequeno tubo de tampa de snap de 5 mL.
   3. Pipeta 300 μL de IVC1 equilibrado em cada poço. Tenha cuidado para não deixar nenhum fluido tocar na tampa, pois isso aumentará o risco de contaminação.
   4. Retorne o deslizamento de cobertura câmara com IVC1 para incubar em 37 °C, 6% DE CO₂ e atmosférico O₂ até a remoção da zona pellucida na etapa 4.

2. Aquecimento vitrificado D5 embriões humanos

NOTA: Outros fabricantes podem ter protocolos ligeiramente diferentes de acordo com sua própria tecnologia de vitrificação. Consulte as instruções do fabricante para uso quando aplicável.

1. Aqueça 3,0 mL de solução de descongelamento (TS) em prato de 35 mm a 37 °C. Leve 300 μL de solução de diluição (DS) e dois poços de 300 μL de solução de lavagem (WS) em uma placa de 6 poços à temperatura ambiente.
2. Usando fórceps, remova cuidadosamente a manga do dispositivo criogeno, garantindo que o embrião vitrificado permaneça sempre sob nitrogênio líquido.
3. Mova rapidamente o dispositivo criogeno de nitrogênio líquido e mergulhe a ponta do dispositivo criogeno em TS a 37 °C. Defina um temporizador por 1 min e mantenha o dispositivo criomerado até que o embrião se desprende no TS.
   NOTA: Embriões quentes um de cada vez para acompanhar as identidades dos embriões, pois podem estar relacionados com informações demográficas dos pacientes na análise a jusante.
4. Durante a incubação de 1 min em TS, remova cuidadosamente o dispositivo criogeno e pegue suavemente o embrião e mova-se para o lado oposto do prato TS.
   NOTA: Se aculturar vários embriões, seja diligente para manter os embriões separados para garantir que as identidades adequadas sejam mantidas.
5. Após 1 min, pegue suavemente o embrião com uma pequena quantidade de TS, aproximadamente 2 μL. Mova o embrião para o fundo do poço de 300 μL DS enquanto cobre o embrião em uma fina camada de TS da pipeta. Coloque um temporizador por 3 minutos e coloque a placa de 6 poços na parte superior do banco à temperatura ambiente.
6. Após 3 min, pegue o embrião com uma pequena quantidade de DS, aproximadamente 2 μL, e mova o embrião para o fundo do próximo poço contendo 300 μL de WS. Novamente, coloque suavemente uma pequena quantidade de DS da pipeta sobre o embrião. Defina um temporizador por 5 minutos e retorne ao banco de cima.
7. Depois de 5 min, pegue o embrião com volume mínimo de WS e passe para o topo do poço final de 300 μL WS. O embrião cairá lentamente e lavará através do WS até o fundo. Expulse qualquer WS retido da pipeta para um poço vazio.
8. Pegue o embrião com volume mínimo e retorne ao topo do mesmo poço de 300 μL de WS. O embrião cairá mais uma vez para o fundo do poço. Defina um temporizador por 1 min e devolva a placa de 6-well para o banco de cima.

3. Recuperação de embriões aquecidos

1. Um de cada vez, mova embriões aquecidos para um prato de tecido de órgãos de poço central contendo 500 μL de BM equilibrado com 10% v/v SPS abaixo de 500 μL de óleo de grau de cultura de embriões equilibrado.
2. Lave embriões pegando cada embrião e movendo-os para várias áreas do prato enquanto sopram a velha mídia entre os movimentos. Pegue o embrião e mova-o para uma queda de cultura individual de 20 μL de BM equilibrada com 10% v/v SPS sob óleo.
3. Deixe os embriões aquecidos se recuperarem por 2h em uma incubadora a 37 °C, 6% DE CO_2, 5% O_2.

4. Remoção da zona

1. Após uma recuperação de 2h, avalie os embriões para a reese expansão e tire fotos de cada embrião.
2. Mova embriões individualmente em 500 μL de um ácido 3-(N-morpholino)-ácido propanesulfônico (MOPS) com soro de bezerro fetal (V/v) antes do tratamento com solução ácida de Tyrode.
3. Mova um embrião rapidamente através de 300 μL da solução de Tyrode ácido aquecido enquanto observa ativamente através do microscópio. A zona pellucida começará a se dissolver visualmente. Isso vai levar aproximadamente 5 s.
4. Mova imediatamente o embrião com zona dissolução em 300 μL de mops aquecido médio tamponado para saciar a solução do ácido Tyrode.
5. Mova o embrião com volume mínimo de mops tamponado médio em uma antena de tecido de órgão de poço central contendo 500 μL de BM equilibrado com 10% v/v SPS abaixo de 500 μL de óleo de grau de cultura de embriões equilibrado para lavar.
6. Retorne o embrião à queda de recuperação de 20 μL da etapa 3.2.
   NOTA: Após o exame visual após a remoção da zona, quaisquer embriões com pellucida zona retida podem ser tratados com solução de Tyrode ácida, se necessário, repetindo as etapas 4.2-4.6. É desejado minimizar a exposição à solução do Tyrode.

5. Cultura estendida do blastocisto

1. Mova os embriões individualmente para o prato de lavagem com mídia IVC1 equilibrada a partir da etapa 1.1.6. Mova cuidadosamente um embrião para um poço do deslizamento de coberturas com IVC1 equilibrado e mantenha a identificação do embrião.
   NOTA: Esta etapa precisa ser concluída o mais rápido possível para minimizar a evaporação média.
2. Deslizamento de cobertura com câmara de retorno para uma incubadora definida para 37 °C, 6% CO_2, atmosférico O₂ por 2 dias.
   NOTA: Certifique-se de descongelar e equilibrar a mídia em 37 °C, 6% DE CO_2, o atmosférico O₂ para a troca de mídia 4h de antecedência.
3. No outgrowth D2 (D7 pós fertilização), examine cuidadosamente a fixação de embriões sob o microscópio e realize a troca de mídia.
   1. Observe qual embrião está preso ao prato antes de trocar mídia. Bata suavemente na placa e examine se um embrião está firmemente preso à placa sob o microscópio.
   2. Retire a tampa e remova cuidadosamente 150 μL de IVC1 e descarte sem perturbar o embrião anexado. Se um embrião ainda não tiver ligado à placa, não troque a mídia, pois o soro em IVC1 ajudará na fixação de embriões.
   3. Pipeta 150 μL de mídia de cultura estendida equilibrada, IVC2, lentamente em cada poço e retornar a tampa para o deslizamento de cobertura câmara.
      NOTA: Certifique-se de que a remoção da tampa da tampa de câmara é minimizada para evitar a evaporação média.
4. Devolva cuidadosamente a tampa de câmara para a incubadora sem espirrar qualquer mídia na tampa. Repita a troca de mídia e verifique o anexo todos os dias de cultura estendida até que os embriões estejam prontos para fixação ou digestão de células únicas.

6. Coleta opcional de mídia gasta

1. Opcionalmente, colete mídia gasta durante a troca de mídia cultural após d7 ou qualquer dia depois. Durante a etapa 5.3.2, em vez de descartar o snap-freeze médio os 150 μL do IVC1 removido em um tubo estéril e de baixa ligação de 0,5 mL para análise futura.

7. Fixação opcional para imunofluorescência

1. Use uma pipeta de 200 μL para lavar embriões com trocas de mídia de 1/2 de PBS por 3x antes da fixação para remover quaisquer detritos extracelulares. Lavar detritos e proteínas em excesso ajudará a otimizar a clareza e reduzir o fundo em imagens obtidas com imunofluorescência.
2. Remova todas as mídias e adicione lentamente 200 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) no PBS ao poço. O embrião vai querer grudar na superfície do fluido. Várias lavagens de 150 μL com 4% de PFA antes de remover todo o fluido ajudarão a minimizar qualquer dano ao embrião.
3. Incubar os embriões em 4% de PFA por 20 minutos para fixação.
4. Lave os embriões 3x por 10 min por lavagem com 200 μL de 0,1% v/v polisorbato 20 em PBS fresco.
5. Armazene embriões fixos em 0,1% v/v polisorbate 20 em PBS a 4 °C antes de prosseguir com o protocolo de imunofluorescência.

8. Digestão celular única com Trippsin

NOTA: Embriões frescos (não fixos) são usados para digestão celular única.

1. Lave o embrião uma vez com 200 μL de PBS e adicione 200 μL de solução de trippsina a cada poço. Devolva a tampa de câmara para a incubadora por 5 minutos.
2. Remova a tampa de câmara da incubadora e examine os embriões sob um estereoscópio. As células da periferia do embrião começarão a se retrair e o MTB ainda deve ser anexado à placa onde estão remotamente localizados a partir do embrião.
3. Use uma pipeta pequena ou uma pipeta bucal finamente puxada para pegar MTB individual antes de quebrar todo o embrião. Pule para a etapa 9.1 para salvar mtb e volte à etapa 8.4 após a etapa 9.3.
4. Use uma pipeta de micromanipulação portátil ou pipeta bucal para dissociar suavemente o embrião aspirando para cima e para baixo.
5. As células começarão a se dissociar de todo o embrião. Continue aspirando o embrião suavemente e repetidamente usando uma ponta de pipeta de diâmetro menor ou pipeta bucal até que o embrião tenha sido incubado por um total de 10 minutos em trippsina.

9. Seleção de células únicas e coleta de amostras

1. Com trippsina mínima, mova as células dissociadas através de três gotas de lavagem de 20 μL PBS + 0,1% de polivinylpyrrolidone (PVP) sob óleo de cultura de embriões com o cuidado de não perder nenhuma célula.
2. Depois de lavar as células, use uma pipeta de vidro finamente puxada para selecionar uma célula. Pipete cuidadosamente a célula única em um tubo estéril de 0,2 mL de baixa ligação com volume mínimo de PBS+0,1% PVP.
3. Esto a 1 a 1 em células únicas de congelamento em nitrogênio líquido (LN₂), e armazene em -80 °C para uso futuro.

Resultados

Embriões saudáveis apresentaram proliferação contínua ao longo da cultura estendida(Figura 2B). Embriões anormais começaram a se retrair de suas bordas externas e se desintegrarem(Figura 2C). Pela nossa experiência, aproximadamente 75% dos embriões foram anexados ao fundo do prato revestido de fibronectina a 48 h e o acessório aumentou para aproximadamente 90% em 72 h na cultura. O sucesso do apego ao embrião pode ser em grande parte impactado pela qualidade ini...

Discussão

O desenvolvimento do protocolo para cultivar embriões humanos através da implantação permitiu aos cientistas explorar um tempo anteriormente inexplorado no desenvolvimento^8,,9. Aqui, usamos um sistema de cultura estendido para cultivar embriões humanos e estudar a diferenciação do trophoblasto precoce antes da formação de placenta villous. Os métodos aqui descritos permitem coletar diferentes sublineagens de TB para uso na análise de células únicas a jusante. Est...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa estéril NORM JECT Luer Lock	VWR	53548-019	Pacote de 100
incubadoras de CO2 com camisa de água 3130 ou 3110 Forma Série II	Thermo Fisher Scientific	13-998-078
Placa de cultura de tecidos Corning Primaria de 35 mm	VWR	62406-038	Caixa de 500 Tubo de
tampa de pressão de 5 mL	VWR	60819-295	Pacote de 25
tecidos Corning Primaria de 60 mm prato de cultura	VWR	25382-687	Caixa de 200
pratos de 6 poços	Agtech Inc.	D18	Pacote de 1, 10, ou 50
Solução Ácida de Tyrode	Millipore Sigma	T1788	100 mL
Biotix 1250 µ L ponteiras de pipeta	VWR	76322-156	Pacote de 960
Blast, meios de cultura de blastocisto	Origio	83060010	de 10 mL
	Kitazato	VT802	1 x 4 mL
Pipetas Pasteur de Vidro Borossilicato Descartáveis	Thermo Fisher Scientific	1367820D	5.75 in. (146 mm); 720/Cs
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Millipore Sigma	D8537
Óleo de parafina para cultura de embriões OvOil	Vitrolife	10029	de 100
mL 0,2 mL	VWR	47730-598	Pacote de 1.000
tubos de PCR Eppendorf 0,5 mL	VWR	89130-980	Caixa de 500
Fibronectina de plasma humano. Solução líquida de .1%	Millipore Sigma	F0895	1 mg
Gilson 1 mL Pipeman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 200-1000 µ L
Gilson 20 µ L Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 2-20 µ L
Gilson 200 µ L Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 50-200 µ L
Meios de manuseio G-MOPS	Vitrolife	10129	125 mL
Meios de manuseio	Origio	83100060	60 mL
Ibidi 8 lamínulas bem compartimentadas	Ibidi	80826	15 lâminas por caixa
IVC1/IVC2	Sistemas de Orientação de Células	M11-25/ M12-25	5-5mL alíquotas
K System T47 Placa de Aquecimento	Cooper Surgical	23054
Filtros de Seringa Estéreis MilliporeSigma Millex com Membrana Durapore PVFD	Fisher Scientific	SLGVR33RS	Pacote de 50
peças de boca	Loja de fertilização in vitro	MP-001-Y	100 peças
Prato de centro de poço	Oosafe	OOPW-CW05-1	Caixa de 500
Quinn's Advantage SPS	Origio	ART-3010	12x 12 mL
Tubo de borracha de látex para bocais	Loja de fertilização in vitro	IVFS-NRL-B-5	5 pés.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270
Pontas de Stripper	Cooper Surgical	MXL3-275	20/pk 275 µ m
Solução de Descongelamento	Kitazato	VT802	2 x 4 mL
The Stripper Micropipetter	Cooper Surgical	MXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), sem vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific	12604013	1 x 100 mL
Tween20	Millipore Sigma	P1379-25ML	25 mL frasco
VWR 1-20 µ Ponteiras de pipeta L	VWR	76322-134	Pacote de 960
VWR 1-200 µ Ponteiras de pipeta L	VWR	89174-526	Pacote de 960
Solução de lavagem	Kitazato	VT802	1 x 4 mL