Interferência de RNA em besouros aquáticos como uma poderosa ferramenta para manipular a expressão genética em pontos de tempo específicos de desenvolvimento

Resumo

A interferência de RNA é uma técnica amplamente aplicável e poderosa para manipular a expressão genética em estágios específicos de desenvolvimento. Aqui, descrevemos os passos necessários para a implementação dessa técnica no besouro de mergulho aquático Thermonectus marmoratus, desde a aquisição de sequências genéticas até o knockdown de genes que afetam a estrutura ou o comportamento.

Resumo

A interferência de RNA (RNAi) continua sendo uma técnica poderosa que permite a redução direcionada da expressão genética através da degradação do mRNA. Esta técnica é aplicável a uma grande variedade de organismos e é altamente eficiente na ordem rica em espécies Coleoptera (besouros). Aqui, resumimos os passos necessários para o desenvolvimento dessa técnica em um novo organismo e ilustramos sua aplicação aos diferentes estágios de desenvolvimento do besouro de mergulho aquático Thermonectus marmoratus. As sequências genéticas de destino podem ser obtidas de forma econômica através da montagem de transcriptomes contra um parente próximo com genômica conhecida ou de novo. A clonagem de genes candidatos utiliza um vetor de clonagem específico (o plasmídeo pCR4-TOPO), que permite a síntese de RNA de dupla cadeia (dsRNA) para qualquer gene com o uso de um único primer comum. O dsRNA sintetizado pode ser injetado em embriões para processos de desenvolvimento precoce ou larvas para processos de desenvolvimento posteriores. Em seguida, ilustramos como o RNAi pode ser injetado em larvas aquáticas usando a imobilização em agarose. Para demonstrar a técnica, fornecemos vários exemplos de experimentos RNAi, gerando knockdowns específicos com fenótipos previstos. Especificamente, RNAi para o gene de bronzeamento laccase2 leva à clareamento de cutículas em larvas e adultos, e RNAi para o gene de pigmentação dos olhos branco produz uma clareamento/falta de pigmentação em tubos oculares. Além disso, o knockdown de uma proteína de lente-chave leva a larvas com deficiências ópticas e uma capacidade reduzida de caçar presas. Combinados, esses resultados exemplificam o poder da RNAi como ferramenta para investigar padronagem morfológica e traços comportamentais em organismos com apenas bancos de dados transcriômicos.

Introdução

A questão de como genes específicos contribuem para a evolução de traços diversos é um tema emocionante na biologia. Ao longo das últimas décadas, muito progresso foi feito em relação à dissecação dos fundamentos genéticos dos processos de desenvolvimento em alguns organismos modelo, como o nematode Caenorhabditis elegans, a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster, e o rato da casa Mus musculus¹. Mais recentemente, a invenção de técnicas poderosas de edição de genes, como repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente (CRISPR)/Cas9^2, proporcionou a capacidade de alterar o código genético de organismos não-modelo (por^exemplo,ver^3,4). Como resultado, houve um aumento nos estudos genéticos sobre uma variedade de organismos que não haviam sido abordados anteriormente através de técnicas moleculares. Considerando a enorme diversidade do nosso reino animal, com muitos traços interessantes ou variâncias de traços que só são representados em espécies específicas, esse progresso tornou-o um momento emocionante para o trabalho relacionado à biologia evolutiva-de-desenvolvimento ("evo-devo"). No entanto, as técnicas de edição de genomas que estão disponíveis para organismos não-modelo são relativamente restritas em relação aos pontos de tempo de desenvolvimento aos quais podem ser aplicados, tornando desafiador discernir as propriedades temporais relacionadas ao papel que genes específicos desempenham em qualquer característica. Além disso, as técnicas transgênicas são muitas vezes limitadas a genes que não são essenciais para a sobrevivência (ou seja, cujo nocaute não resulta em letalidade). Portanto, embora as técnicas de edição de genes tenham começado a se popularizar, ainda há a necessidade de técnicas eficazes aplicáveis a uma variedade de organismos diferentes em pontos de tempo específicos de desenvolvimento e facilitam knockdowns parciais (em vez de perda completa de função). Aqui, chamamos a atenção para a interferência de RNA (RNAi), uma técnica de knockdown genética um pouco datada, mas^poderosa, que é particularmente valiosa como uma abordagem sinérgica para a edição de genes. Especificamente, desenvolvemos procedimentos que permitem a aplicação do RNAi aos besouros de mergulho aquático como exemplo que ilustra a implementação desta técnica, desde a aquisição das sequências moleculares necessárias até a injeção bem sucedida de RNA de duplaridade (dsRNA) em ovos e larvas.

O knockdown genético baseado em RNAi aproveita um mecanismo de defesa inata de organismos, no qual moléculas de dsRNA facilitam o silenciamento de sequências de ácido nucleico invasor, como vírus e transposons⁶. Resumindo, o dsRNA é levado para dentro da célula, onde é cortado em 20-25 pedaços de nucleotídeos pela enzima Dicer. Essas peças então ativam a formação do complexo de silenciamento induzido pelo RNA (RISC), que inibe o mRNA direcionado, vinculando-se a ele em locais específicos usando a cadeia guia. Esse processo acaba por levar à degradação do mRNA e, portanto, interfere na tradução do mRNA para a respectiva proteína⁶. A técnica de knockdown genético baseada em RNAi apresentada aqui, portanto, conta com a injeção de dsRNA. Para modelos animais, essa técnica foi originalmente desenvolvida em C. elegans⁷ e D. melanogaster^8, mas desde então surgiu como uma poderosa ferramenta genética funcional em organismos não-modelo^9,,10. Devido à sua natureza altamente eficaz em alguns insetos, a RNAi pode até ser aplicada no manejo de pragas¹¹.

Como ferramenta de pesquisa, a RNAi tem sido usada para examinar como as principais vias de desenvolvimento molecular funcionam em modelos de insetos não tradicionais. Por exemplo, rnAi no besouro de farinha Tribolium castaneum tem sido fundamental para determinar o quão profundamente conservados genes contribuem para traços específicos naquele besouro, como exemplificado para o desenvolvimento de asas especificamente moldadas^12,,13,,14 e olhos^15,,16. As técnicas que estão por trás das manipulações em T. castaneum foram bem descritas¹⁷ e contam com a capacidade de imobilizar ovos e larvas relativamente secos em uma superfície pegajosa. Essa imobilização, no entanto, não é possível para as formas de desenvolvimento úmido de organismos aquáticos como o Fusca de Mergulho Sunburst Thermonectus marmoratus. Como é o caso de muitos organismos modelos não tradicionais, ele não tem um genoma anotado. Manipular a expressão genética em qualquer organismo sem genoma, um primeiro passo razoável e econômico é gerar transcritos e identificar as sequências putativas de nucleotídeos dos genes de interesse expressos com base na similaridade sequencial com organismos modelos relacionados, mas mais estabelecidos, neste caso, principalmente os genes Tribolium (Coleoptera) e Drosophila.

Aqui, para demonstrar como o RNAi pode ser usado em um organismo aquático, primeiro discutimos protocolos e softwares para extração de RNA e geração e montagem de transcriptome, que permitem a identificação de sequências genéticas específicas direcionadas. Resumimos então os passos necessários para sintetizar o dsRNA específico de genes. Posteriormente, ilustramos como os ovos podem ser injetados em um ambiente aquático e demonstramos protocolos de incubação para a cultura de embriões em desenvolvimento. Além disso, mostramos como o gel de agarose pode ser usado para imobilizar completamente as larvas durante o processo de injeção, uma técnica que geralmente é útil durante vários procedimentos e pode ser aplicada a uma variedade de artrópodes. Para demonstrar como o RNAi pode ser aplicado a diferentes estágios de desenvolvimento, incluímos um exemplo no qual silenciamos o gene da pigmentação dos olhos branco em embriões. Além disso, descrevemos um exemplo no qual o gene de bronzeamento laccase2(lac2) foi silenciado durante a segunda instar larval (para afetar larvas da terceira instar larval) quanto a terceira instar larval (para afetar adultos). Finalmente, demonstramos que a injeção de uma menor concentração de dsRNA leva a um knockdown parcial, o que mostra que essa técnica também pode ser aplicada a genes onde a perda de função é conhecida por ser letal.

Protocolo

1. Isolamento do RNA e montagem de novo transcriptome

1. Realize o isolamento total do RNA a partir do terceiro estágio final de mergulho tubos de besouro larval e besouros adultos usando um kit de isolamento de RNA (ver Tabela de Materiais) que é projetado para tecido rico em lipídios. Isole o RNA total de T. marmoratus e sequenciá-lo seguindo os métodos descritos anteriormente¹⁸.
2. Montagem de novo transcriptome
   NOTA: Para montar o transcriptome de novo, várias plataformas de bioinformática podem ser utilizadas (ver Tabela de Materiais). Essas plataformas estão disponíveis comercialmente e, em alguns casos, existem como scripts de linha de comando baseados no Unix. Como a montagem é de novo, recomenda-se reunir os transcriptomes independentemente em duas plataformas e comparar os resultados para excluir falsos positivos ou falsos negativos.
   1. Para começar a montar os transcriptomes, faça upload das leituras brutas na respectiva plataforma de bioinformática.
      NOTA: Esses arquivos geralmente são compactados e no formato FASTQSANGER. Gz. Não há necessidade de descomprimir os arquivos, pois esse formato é aceito na próxima etapa.
   2. Usando a linha de comando Trimmomatic, corte as leituras brutas para remover sequências de adaptador ou leituras curtas que ficam abaixo do limiar padrão. Descomprimir as leituras cruas aparadas; os arquivos agora estarão no formato FASTQ. Concatenar as leituras brutas FASTQ para cada amostra para obter arquivos que estejam prontos para o montagem de novo.
   3. Monte as leituras brutas concatenadas de novo usando qualquer script de linha de comando que possa montar transcriptomes de novo. Salve o transcriptome montado, que agora terá uma lista de contigs com suas respectivas sequências, como um arquivo FASTA. Para aumentar a cobertura da montagem, combine e monte vários transcriptomes para a mesma espécie.
      NOTA: Este processo aumenta as chances de gerar contigs mais precisos e é especialmente importante se genes de número de cópia baixa forem de interesse.
   4. Uma vez montado, avalie o transcriptome para completude calculando os escores de cobertura (o software de avaliação de cobertura está livremente disponível, consulte Tabela de Materiais).
      NOTA: Um transcriptome com pontuação de cobertura >75% é considerado bom. No entanto, a relevância dessa pontuação depende da razão para a geração de transcriptome. Por exemplo, se o transcriptome está sendo usado para identificar genes de números de cópia baixa, então uma pontuação >85% é melhor, pois significa maior cobertura.
   5. Anote o transcriptome montado de novo usando uma ferramenta básica de pesquisa de alinhamento local (BLAST; ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Para este experimento, o transcriptome foi anotado principalmente contra um banco de dados de proteínas conhecidas de Drosophila e um banco de dados de proteínas de besouro conhecidas. A lista de anotações pode ser baixada como um arquivo de planilha e contig/contigs que indicam que a semelhança sequencial com as proteínas de outros organismos pode ser baixada como um arquivo FASTA.
   6. Identifique o número/números de contig da proteína de interesse e extraia as sequências de nucleotídeos. Use o BLAST para identificar se regiões conservadas específicas de proteínas (como domínios de homeobox) estão presentes na sequência de interesse nucleotídeo anotado. Verifique outras contigas com a mesma anotação para sobreposições de sequência de nucleotídeos para gerar a sequência de uma transcrição específica de genes.
      NOTA: Identificar contigs com sobreposição de sequência geralmente não é possível para todos os genes, especialmente para genes de número de cópia baixa.
   7. Se for necessária a sequência completa do gene, comece com a contig que tem a maior similaridade de sequência como ponto de iniciação para identificar a sequência nucleotídea de toda a transcrição madura usando técnicas como 3′ e 5′ amplificação rápida das extremidades cDNA (RACE¹⁹).
   8. Anote o conjunto obtido na segunda plataforma seguindo as etapas 1.2.4-1.2.7.
      NOTA: Idealmente, os resultados devem ser semelhantes para as proteínas de interesse; no entanto, a cobertura pode diferir entre plataformas até certo ponto.
   9. Use o transcriptome montado para sintetizar dsRNA específico da espécie, conforme descrito na seção 2.

2. Clonagem e síntese dsRNA específica de genes

NOTA: A clonagem específica de genes e a síntese de dsRNA foram descritas em detalhes para T. castaneum^20,,21,22. Os passos a seguir são uma breve visão geral.

1. Clonagem, transformação bacteriana e sequenciamento plasmídeo
   1. Isole o RNA total do organismo (conforme descrito na etapa 1.1) e crie DNA complementar (cDNA) utilizando um kit de transcrição reversa (ver Tabela de Materiais). Identifique uma ou duas sequências de nucleotídeos de 100-1000 bp de contigs que são específicas para os genes de interesse.
      1. Projetar pares de primer abrangendo todo o trecho identificado de nucleotídeos e amplificar a sequência através de uma reação em cadeia de polimerase (PCR). Adicione um passo extra de 30 minutos no final para criar saliências de adenina de 3′ no produto de DNA amplificado. Purifique este produto usando um kit de purificação pcr (ver Tabela de Materiais).
   2. Clone o produto purificado em um vetor plasmídeo pCR4-TOPO (ver Tabela de Materiais) seguindo o protocolo do fornecedor fornecido com o kit de clonagem. O uso do tratamento de choque térmico transforma os plasmídeos clonados em células bacterianas competentes (cepa: E.coli DH10B) seguindo o protocolo do fornecedor para células competentes (ver Tabela de Materiais),e tela para células transformadas com sucesso.
      NOTA: Placas com colônias podem ser embrulhadas em filme de parafina para reter umidade e armazenadas a 4 °C por até um mês.
   3. Escolha colônias de células transformadas usando uma ponta de pipeta de 10 μL e cultura em caldo de lysogeny (LB) contendo ampicillina (50 μg/mL) em uma incubadora shaker a 37 °C e 200 rpm por 24 h.
      NOTA: Para armazenamento a longo prazo, as células cultivadas podem ser diluídas 1:1 com 100% de glicerol e congeladas a -80 °C como estoques de glicerol.
   4. Isolador plasmídeos contendo o gene de interesse desta cultura usando um kit de isolamento miniprep (ver Tabela de Materiais). Armazene os plasmídeos isolados (minipreps) a -20 °C depois de avaliar o rendimento espectrofotometricamente. Especificamente, meça a absorvância amostral em 260 nm, 280 nm e 230 nm. Calcule as proporções A₂₆₀/A₂₈₀ para quantificar DNA, e A₂₆₀/A₂₃₀ para quantificar a pureza do DNA.
      NOTA: Uma razão de 260/280 de 1,8 é geralmente aceita como DNA suficientemente puro, razões inferiores a 1,5 indicam a presença de reagentes de extração residual, como o fenol. A razão 260/230 deve ser maior ou igual à razão 260/280. Proporções mais baixas indicam contaminação residual do reagente. O rendimento normalmente varia de 100 a 500 ng/μL.
   5. Sequencia os minipreps isolados para confirmar que o fragmento específico do gene foi integrado com sucesso, sendo flanqueado entre regiões promotoras T3 de 5′ e 3′ no plasmídeo; isso pode ser feito usando primers de sequenciamento T7 e T3 universais²². Use os minipreps com a sequência de interesse específica do gene para a preparação de dsRNA.
2. Amplificação pcr e síntese in vitro dsRNA
   1. Amplificação do PCR e purificação do produto
      1. Projete primers específicos ou específicos de genes que tenham a sequência de promotores T7 em seus lados de 5' (ver referência²² para detalhes) para amplificar um fragmento linear do gene inserido. Otimize o rendimento configurando pelo menos 10 reações de 20 μL cada.
         NOTA: O produto resultante é ladeado por dois locais de ligação de polimerase T7 de 20 bps.
      2. Purifique o produto PCR usando um kit de purificação de produtos PCR (ver Tabela de Materiais),seguindo o protocolo de eluição baseado em colunas do fornecedor. Para aumentar o rendimento, repita o passo final de eluição até 3 vezes com o mesmo eluente. Avalie o rendimento espectrofotometricamente.
         NOTA: O rendimento geralmente varia de 100 a 700 ng/μL. Este produto purificado pode ser armazenado a -20 °C até que seja usado.
   2. Síntese e purificação in vitro dsRNA
      1. Use o produto purificado PCR específico para sintetizar dsRNA in vitro de acordo com o protocolo de um kit de síntese dsRNA de escolha. Se necessário, amplie o tempo de incubação para o aumento da produção de dsRNA.
      2. Avalie a progressão da reação com base na opacidade da mistura de reação (quanto maior a quantidade do produto dsRNA, maior a turbidez). No final da incubação, pare a reação usando um tratamento DNase. Para isso, adicione 1 μL de um estoque de 2 U/ μL, à mistura de reação. Este tratamento para 1-2 h para garantir a degradação ideal do DNA do modelo.
      3. Purifique o dsRNA com um kit de purificação ou através das etapas a seguir.
         1. Diluir o produto resultante com 115 μL de água sem nuclease e adicionar 15 μL de acetato de sódio de 3 M. Adicione 2 volumes de gelo frio 100% etanol a esta mistura de reação e precipitar o dsRNA durante a noite a -20 °C.
            NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas com segurança sem afetar o rendimento final.
         2. Centrifugar o precipitado a 0 °C por 20 min a 9000 x g e descartar o supernaspe. Lave o produto uma vez com 70% de etanol gelado e centrífuga por 15 min a 13000 x g.
         3. Remova o supernasce e o ar seque a pelota por 5-15 min. Resuspend a pelota em até 40 μL de água livre de nuclease (este volume pode ser ajustado com base no tamanho da pelota isolada) e avaliar o rendimento e a pureza espectrofotometricamente, conforme descrito em 2.1.4.
         4. Armazene o dsRNA purificado a -20 °C até que seja mais utilizado. Use o dsRNA purificado para injeção no estágio de desenvolvimento desejado.

3. Coleta e preparação de embriões T. marmoratus em estágio inicial para injeções de dsRNA

1. Prepare uma placa de ágarose para a incubação de embriões de T. marmoratus.
   1. Primeiro, dissolva 20 mg de pó de agarose de baixo derretimento em 100 mL de água destilada autoclavada (2% de agarose) e depois ferva essa mistura em um micro-ondas até que uma solução clara seja obtida. Tome cuidado com a solução quente, pois as bolhas de ar podem fazer com que ela transborde.
   2. Distribua esta solução em uma pequena placa de Petri. Para fazer ranhuras (que segurarão os embriões) na superfície da placa de agarose, coloque três tubos plásticos de 1 a 2 mm de largura (como as pontas das pipetas de transferência de plástico) na superfície do líquido agarose antes de se solidificar.
   3. Uma vez que a ágarose solidifice, use um par de fórceps contundentes para remover esses tubos. Adicione 500 μL de água autoclavada destilada usando uma micropipette P1000 para cobrir essas recuos na agarose.
2. Usando uma fina escova de tinta natural de cabelo, colete embriões T. marmoratus que têm de 5 a 8 h de idade dos locais de ninho de besouro em um prato de cavidade de vidro cheio de água autoclavada destilada. Monitore os locais de aninhamento com frequência para garantir que os ovos obtidos sejam da idade adequada.
3. Descorionato os embriões sob um estereómico usando fórceps de dissecção fina. Para isso, visualize o acorde sob o microscópio (na ampliação desejada) posicionando a fonte de luz em um ângulo apropriado, em seguida, pegue o acorde de dois lados com fórceps afiados, rasgue-o aberto e deslize suavemente o embrião para fora. Como há duas camadas, certifique-se de que ambas sejam removidas.
4. Usando uma fina escova de tinta natural de cabelo, transfira cuidadosamente os embriões do prato de cavidade de vidro para a placa de agarose e organize-os nas ranhuras sob um estereótipo. Tome muito cuidado durante esse processo, pois os embriões descorrioados são muito frágeis. Use os embriões preparados para injeções de dsRNA.
   NOTA: A extremidade ligeiramente mais grossa é o lado do embrião no qual a cabeça se desenvolverá.

4. microinjeções dsRNA em embriões T. marmoratus em estágio inicial

1. Para injetar embriões em estágio inicial com dsRNA específico para genes, prepare agulhas de microinjeção usando um puxador de agulha de microinjeção (ver Tabela de Materiais). Ao visualizar a ponta da agulha sob um estereótipo, use um par de fórceps finos para quebrar a ponta da agulha, criando uma borda afiada. O ideal é quebrar a ponta da agulha na diagonal para que uma borda mais nítida permaneça de um lado, o que permitirá que ele entre no embrião enquanto causa lesões mínimas.
2. Descongele a solução de dsRNA de estoque purificado no gelo, adicione 1 μL do tampão de injeção de 10x e cubra-o com água destilada dupla, para fazer 10 μL de solução de injeção. Para injeções, uma concentração de dsRNA de 1 μg/μL geralmente é adequada, mas pode ser ajustada de acordo com a gravidade fenotípica dos animais resultantes).
   NOTA: Prepare 1 mL de tampão de injeção de 10x²² adicionando 10 μL de tampão fosfato de sódio de 0,1 M (feito por mistura de 8,5 mL de 1 M Na2HPO4 e 1,5 mL de 1 M NaH2PO4 ajustado a um pH 7.6 a 25 °C com 100 μL de 0,5 M KCl), 100 μL de corante alimentar e 790 μL de água dupla destilada.
   1. Usando uma pipeta P10, enchimento de volta a agulha de microinjeção com a solução dsRNA de trabalho. Uma vez que a solução tenha preenchido a ponta da agulha, conecte-a a um suporte de microagulha conectado a um sistema de microinjeção que utiliza tecnologia de ejeção de pressão (ver Tabela de Materiais).
3. Ligue o sistema de microinjeção e o fornecimento de ar pressurizado. Usando o microvalve no sistema de microinjeção, ajuste a pressão de injeção para 15 psi. Ajuste a duração da injeção usando o botão de ajuste de tempo (ajuste-o como "Segundos").
   1. Como a duração da injeção depende do volume de injeção necessário, se necessário, ajuste este parâmetro no sistema de microinjeção antes de cada injeção. Use um volume de injeção de 1-2 nL para embriões T. marmoratus em estágio inicial.
      NOTA: Volumes de injeção mais elevados tendem a interferir com a taxa de sobrevivência do embrião.
4. Para medir o volume de fluido de injeção que é dispensado pelo sistema de microinjeção, calibrar a agulha de injeção avaliando o volume da bolha de fluido que é formada na ponta da agulha ao injetar no ar. Para embriões T. marmoratus, use um tamanho de bolha ideal de 100-200 μm. A agulha de injeção é de boa qualidade se isso pode ser alcançado a 15 psi com uma duração de injeção de ~3 s.
5. Alinhe a agulha e a placa de agarose contendo os embriões sob um estereótipo, de modo que a agulha se aproxime dos embriões em um ângulo entre 45° e 60°.
6. Usando o micromanipulador, mova o microalícula lentamente enquanto monitora o progresso através do estereoscópio. Uma vez que a ponta da agulha esteja tocando a superfície de um embrião, mova cuidadosamente a agulha para a frente até perfurar a superfície do embrião. Não perfure profundamente o embrião com a ponta da agulha, pois isso pode afetar a sobrevivência do embrião. Para reduzir a variabilidade, entregue a injeção no meio do embrião.
7. Uma vez que a agulha esteja dentro do embrião, pressione cuidadosamente o botão de injeção do micro-injetor para entregar a dose de dsRNA ao embrião. Depois de injetar 1-2 nL de dsRNA, retraia lentamente a agulha do embrião, de tal forma que não faça com que o embrião se rompa.
   1. Injete os outros embriões de forma semelhante. Se a agulha de microinjeção ficar bloqueada durante o procedimento, desbloqueie-a aumentando a pressão e a duração da injeção. Identificar visualmente embriões injetados com sucesso pela presença de um ponto colorido no local da injeção (já que o tampão de injeção contém coloração alimentar).
8. Coloque cuidadosamente o prato com embriões injetados em uma câmara de umidade.
   1. Para construir tal câmara, pegue qualquer caixa de plástico com tampa, esterilize-a com 70% de etanol, deixe-a secar e coloque tecido encharcado em água autoclavada na parte inferior para proporcionar um ambiente úmido. Coloque esta câmara de umidade em uma incubadora com temperatura apropriada (neste caso, 25 °C) e ciclo de luz de 14h de luz e 10h escuro.
9. Permitir que embriões injetados se desenvolvam em primeiras larvas instar, o que requer de 4 a 5 dias. Monitore o progresso do desenvolvimento de embriões diariamente usando um estereótipo para identificar fenótipos de knockdown morfologicamente visíveis, como descrito na Figura 2.
10. Documente esse progresso tirando imagens digitais usando uma câmera de alta resolução. Remova embriões mortos e reponha a água na placa de agarose diariamente para evitar a dessecação e a possível disseminação da contaminação microbiana para outros embriões sobreviventes durante o período de incubação.
11. Realize controles apropriados para injeções de dsRNA, incluindo injeções tampão, injeções de dsRNA sintetizadas contra o fio de sentido do gene de interesse, e injeções de dsRNA sintetizadas contra sequências que não existem dentro do organismo alvo. Confirme o knockdown rnai usando métodos moleculares adicionais²².

5. Preparação de larvas de T. marmoratus para injeções de dsRNA

NOTA: Ao contrário dos embriões em estágio inicial, as larvas de T. marmoratus são relativamente resistentes e podem ser injetadas com volumes maiores. Por exemplo, as segundas instars podem ser injetadas com até 2 μL de solução de trabalho dsRNA e terceiros instars com pelo menos 3 μL sem efeitos negativos perceptíveis sobre a taxa de sobrevivência. Para injetar dsRNA, é útil imobilizar larvas incorporando-as em agarose.

1. Antes de coletar as larvas, derreta 2% de agarose e mantenha-a em um banho de água a 60-70 °C para mantê-la em forma líquida. Prepare uma placa de imobilização derramando 2% de agarose derretida em uma pequena placa de Petri e, em seguida, esfrie até solidificar. Use fórceps contundentes para fazer uma ranhura rasa na placa de agarose (aproximadamente do tamanho do artrópode a ser incorporado) para cada animal que será injetado.
2. Recolher larvas jovens na fase de desenvolvimento adequada (uma etapa antes do estágio desejado para análise). Para isso, drene cuidadosamente a água dos copos de cultura contendo as larvas e siga os passos mencionados abaixo.
3. Anestesia no gelo (retire cuidadosamente a larva de seu copo de água e coloque-a suavemente no gelo) até que a larva não mostre movimentos notáveis. Use fórceps sem corte e macios para levantar cuidadosamente a larva do gelo e colocá-la no estágio de imobilização com seu pescoço e corpo na ranhura, mas sua cauda localizada acima da superfície da ágarose para que não seja coberta, o que permite que a larva continue respirando através de seus espirros traseiros.
4. Cubra a larva com uma camada grossa de agarose que ainda é líquida, mas não perigosamente quente. Se foi acidentalmente coberto, use os fórceps para libertar a cauda e os dois segmentos abaixo dela a partir da agarose. Uma vez que a agarose solidifice, use a larva para injeções de dsRNA.

6. microinjeções dsRNA em larvas de T. marmoratus

1. Prepare e ensinche uma agulha de microinjeção com a quantidade desejada de solução de trabalho dsRNA específica de genes (conforme descrito nas etapas 4.1-4.2). Conecte a agulha a um suporte de agulha conectado a uma seringa de microinjeção controlada manualmente. Antes de prender a agulha, puxe o êmbolo da seringa todo o caminho para evitar ficar sem pressão de injeção no meio do procedimento.
2. Posicione a larva imobilizada de tal forma que o local da injeção, que está localizado dormente entre os segmentos da placa do terceiro e quarto corpo, esteja alinhado com a trajetória da agulha de microinjeção em um ângulo relativamente plano (quase paralelo ao estágio).
   NOTA: A pescada da agulha e da larva nesta posição é importante, pois fornece o caminho de menor resistência para que a ponta da agulha perfure as larvas com danos mínimos.
3. Uma vez que a agulha e a larva tenham sido posicionadas, mova cuidadosamente a ponta da agulha para a larva usando o micromanipulador enquanto monitora o progresso através de um estereoscópio.
4. Depois que a ponta perfurar o tecido, aplique lentamente e cuidadosamente pressão na seringa. Ajuste a pressão de injeção observando o movimento do fluido de injeção colorido na agulha sob o microscópio.
5. Retraia cuidadosamente a agulha após a injeção. Use fórceps macios para descascar e, portanto, libertar a larva da agarose. Transfira a larva de volta para um recipiente com água (à temperatura ambiente) e permita que ela se desenvolva ainda mais em uma incubadora ou sala de cultura a 25\u201228 °C e um ciclo de luz de 14h de luz e 10h escuro.
6. Empregue injeções de controle adequadas e quantificações de knockdown, conforme descrito na etapa 4.10.

Resultados

Usando o protocolo descrito acima, derrubamos três genes diferentes, como branco, laccase2 (lac2),e Lens3 (Tabela 1),em uma variedade de diferentes estágios de desenvolvimento do Fusca de Mergulho Sunburst T. marmoratus. Realizamos RNAi em T. marmoratus injetando dsRNA em um estágio muito inicial durante a embriogênese (Figura 1A). Como alguns dos embriões não sobrevivem ao processo e tornam-se necroses(Figura 1B),eles precisam ser removidos para manter os demais embriões saudáveis. Exemplificadas aqui estão as injeções de dsRNA contra o gene branco. Este gene é bem conhecido em Drosophila como um dos três transportadores de de ligação ATP (ABC) envolvidos na absorção e armazenamento dos precursores do pigmento ocular²³. Assim, sua perda de função resulta em um fenótipo de olho branco não espigmentado. Nossos resultados mostram que as injeções de dsRNA visando o gene branco ortologous em embriões de T. marmoratus levam à perda de pigmentação ocular em larvas recém-emergentes. Neste caso, as larvas do tipo selvagem são caracterizadas por olhos fortemente pigmentados, e o knockdown RNAi de branco leva a vários níveis de redução e até eliminação completa do pigmento ocular. No geral, observamos pelo menos alguma redução na coloração dos olhos em 34% dos embriões sobreviventes (n = 35). A Figura 2A compara um indivíduo de controle e um indivíduo com cor de olho ligeiramente mais clara. A Figura 2B ilustra um knockdown mais severo em um indivíduo, no qual os olhos mais ventral (Olhos 2-5) do aglomerado são completamente despigmentados, enquanto os olhos dorsais ainda mostram alguma pigmentação. Essas diferenças destacam como a eficiência do knockdown pode variar regionalmente, o que possivelmente está relacionado a diferenças na eficácia da penetração de dsRNA em tecido denso. Outro indivíduo mostra essencialmente perda completa de pigmento em todos os olhos(Figura 2C).

Para investigar o quão bem rnAi funciona na fase larval de T. marmoratus, injetamos dsRNA visando o gene tânnico lac2 em segunda larva instar alguns dias antes de serem devidos a molt em terceiras estrelas(Figura 3) e avaliamos o efeito na coloração cuticular da terceira larva instar. Lac2 é um tipo de fenoxidase que conjuga oxidativamente proteínas para torná-las insolúveis, mais duras e escuras. Knockdown no besouro de farinha T. castaneum tem sido mostrado para levar a indivíduos de cor mais clara em doses baixas, mas é considerado letal em altas doses²⁴. A Figura 4 ilustra que este tratamento também leva a larvas de besouros de mergulho de sunburst coloridos mais claros. Especificamente, neste experimento, 75% das larvas injetadas sobreviventes (n = 12) apresentaram pigmentação reduzida (em comparação com 0% no grupo controle). A Figura 4A mostra um indivíduo com despigmentação relativamente leve, enquanto a Figura 4C ilustra a cabeça de uma larva T. marmoratus na qual a coloração escura da cutícula está quase ausente. A despigmentação foi particularmente evidente para a padronização escura central típica dessas larvas, enquanto este padrão permaneceu claramente visível em um indivíduo injetado no controle(Figura 4B). Além disso, observou-se um clareamento da traqueia da cauda, como retratado na Figura 4D. No caso em que lac2 dsRNA foi injetado em terceiras larvas instar, indivíduos adultos mais leves foram obtidos(Figura 5). Note que as asas do besouro knockdown são um pouco deformadas, provavelmente devido à sua maciez incomum.

Além de alterar traços morfológicos, é possível usar RNAi para atingir genes que afetam o comportamento. Para demonstrar isso, realizamos o RNAi contra um gene de codificação de proteínas de lente-chave, Lens3¹⁸, e injetamos-no em segunda larva instar para afetar as propriedades ópticas do terceiro olho larval instar. Quaisquer efeitos na lente aqui observados são prováveis porque os olhos das larvas de T. marmoratus sofrem um grande crescimento ocular nesta transição, que também envolve grandes alterações ópticas da lente²⁵. O knockdown da RNAi neste experimento foi altamente eficiente. A verificação através do qPCR mostrou uma taxa de sucesso de 100%; dos 13 indivíduos testados, 12 foram derrubados para menos de 10% do nível de expressão dos indivíduos de controle, com o indivíduo restante tendo um nível de expressão de 17% do nível de controle (observação inédita). No nível fenotípico, apenas alguns indivíduos eram severamente deficientes ou incapazes de capturar presas, como é ilustrado na Figura 6 para um indivíduo que repetidamente se aproximou de sua presa de uma distância muito próxima, mas consistentemente a ultrapassou.

Tabela 1: Sequências de primer e amplicons para proteínas branca, lac2 e Lens3. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura 1: Ilustração de injeções de embriões. (A) Embriões descores alinhados em uma placa de agarose e injetados perto de seu centro usando uma agulha de microinjeção cheia de dsRNA e tampão de injeção contendo corante alimentar. A barra de escala representa 500 μm. (B) Um indivíduo com um knockdown mais grave. Embriões injetados são mantidos em uma câmara de umidade e monitorados diariamente para marcar fenótipos e remover indivíduos mortos (que ficam marrons). A barra de escala representa 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplo de embriões totalmente desenvolvidos que foram injetados com dsRNA contra branco. (A) Comparação de um indivíduo com redução da pigmentação ocular (esquerda) e um indivíduo injetado no controle (direita). E1-E6 refere-se a Olhos 1-6. (B) Um indivíduo com um fenótipo de knockdown mais grave, que ilustra que, às vezes, alguns dos olhos dentro do aglomerado são mais severamente afetados pelo knockdown do que outros. (C) Indivíduo com perda quase completa de pigmentação ocular. A barra de escala representa 200 μm; Os painéis B e C estão representados na mesma escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Ilustração de injeções larvais. (A) Várias larvas imobilizadas pela incorporação em 2% de agarose com seus espirros traseiros deixados longe de qualquer agarose. (B) Microeletroda contendo a solução de injeção colocada para que sua ponta possa penetrar na membrana fina entre dois segmentos. (C) Corante de injeção azul visível no local da injeção após a injeção. As barras de escala representam 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: RNAi para laccase2 aplicada à segunda larva instar resultando em coloração de cutícula reduzida em terceira larva instar. (A) Perda relativamente leve de coloração em um indivíduo lac2 RNAi (inferior) quando comparado com um indivíduo injetado no controle (superior). A barra de escala representa 5 mm. (B) Cabeça de um indivíduo de controle mostrando o padrão colorido escuro característico no centro da cabeça. (C) Knockdown relativamente severo de lac2 levando a uma perda quase completa da coloração central da cabeça. (D) Perda de coloração na cutícula traseira principal de um indivíduo lac2 RNAi (inferior) quando comparado com um indivíduo injetado no controle (superior). Barras de escala em B\u2012D representam 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: RNAi para laccase2 aplicada a uma terceira larva instar resultando em coloração de cutícula reduzida em um adulto. O indivíduo knockdown (esquerda) também é caracterizado por elytra muito suave quando comparado com o controle (direita). A barra de escala representa 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Derrubada de uma proteína de lente principal levando a deficiências na captura de presas. (A-C). Três exemplos em que uma larva de Besouro de Mergulho Sunburst, na qual déficits ópticos foram induzidos através do RNAi, foi incapaz de capturar presas (larvas de mosquito). Imagens estáinas representativas foram selecionadas a partir de uma gravação de vídeo de capturas de presas características. (D)Controle da captura de larvas. Todas as barras de escala representam 2 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Nosso objetivo é que esta compilação de métodos torne a RNAi amplamente disponível, especialmente porque esta ferramenta continua sendo uma poderosa técnica sinérgica para a edição de genes baseada em CRISPR/Cas9, com a vantagem de que ela pode ser aplicada aos estágios de desenvolvimento desejados dos organismos estudados. Para exemplificar essa força, injetamos dsRNA em embriões e em diferentes estágios larvais. As injeções em ovos afetaram o desenvolvimento de embriões(Figura 2),injeções no segundo estágio larval tiveram efeitos aparentes no terceiro estágio larval(Figura 4 e Figura 6),e as injeções no terceiro estágio larval mostraram efeitos nos adultos(Figura 5). Embora o tempo exato tenha que ser estabelecido experimentalmente, geralmente, as injeções fazem efeito dentro de alguns dias. O sucesso desse processo pode ser afetado pelo comprimento da sequência dsRNA. Aqui, apresentamos exemplos usando pouco mais de 200 bp a mais de 800 bp. Como regra geral, as sequências entre 100 e 600 bp são preferidas para limitar os efeitos fora do alvo, mas as sequências de até 1000 bp produzem bons resultados²². Uma questão em relação ao RNAi é a duração do knockdown que pode ser alcançado através desta técnica. Como os fenótipos eram terminais em cada etapa, não podemos comentar sobre esse assunto com base nos resultados apresentados. No entanto, já foi observado anteriormente que os efeitos RNAi são geralmente relativamente longos, e que concentrações mais altas levam a knockdowns mais duradouros²⁰.

Uma limitação dessa técnica é que ela funciona melhor para alguns organismos do que para outros, e parece não haver uma maneira direta de prever o quão bem funcionará a priori. No entanto, tem sido encontrado para funcionar bem para uma grande variedade de organismos diferentes. Dentro dos artrópodes, isso inclui aracnídeos²⁶, crustáceos²⁷, e uma variedade de insetos, com taxas de sucesso particularmente altas em besouros²⁸. Outra complicação é que as diferenças na gravidade do fenótipo ocorrem frequentemente entre os indivíduos, apesar da aplicação da mesma quantidade de dsRNA. Conforme ilustrado na Figura 2B,a variação pode até ocorrer dentro de um indivíduo. Em nossos estudos RNAi visando diferentes genes envolvidos no desenvolvimento dos olhos larvais T. marmoratus, descobrimos frequentemente que alguns olhos são afetados mais severamente do que outros. Este fenômeno pode estar relacionado ao tecido relativamente denso do aglomerado ocular, com o dsRNA mais capaz de alcançar algumas das unidades.

Para a execução bem sucedida de experimentos RNAi, é fundamental que vários parâmetros sejam otimizados para o gene alvo. Por exemplo, a concentração do dsRNA e o comprimento do gene alvo podem influenciar fortemente o resultado²⁰. Outro parâmetro crítico é como as injeções são executadas, pois esse processo pode influenciar muito a taxa de sobrevivência. Para os embriões, alcançamos os melhores resultados mirando o centro do embrião. Uma placa bem disposta permite a injeção de 100 ou mais embriões em uma única sessão. Para larvas, é fundamental inserir a agulha de injeção entre os segmentos. Essas injeções requerem mais dsRNA, e com base na disponibilidade de larvas, nossos conjuntos de injeção aqui normalmente consistiam apenas de alguns animais de cada vez. Para todas as injeções, é fundamental evitar que o ar entre no organismo.

Em alguns casos, os loops de feedback de uma rede de regulação genética e redundância genética podem influenciar a penetração dos fenótipos RNAi, apesar de knockdowns consistentes. Este parece ser o caso de nossas observações comportamentais de larvas com knockdowns altamente bem sucedidos de uma proteína de lente proeminente, Lens3¹⁸. Embora tenhamos verificado a alta eficiência desses knockdowns através do qPCR, observou-se variação considerável nos fenótipos associados. Este resultado destaca a necessidade de quantificar adequadamente os knockdowns RNAi (para detalhes sobre as opções ver²²). Se não há uma expectativa clara de a priori em relação aos fenótipos resultantes, uma boa maneira de controlar os efeitos fora do alvo da RNAi é atingir o mesmo gene com duas sequências não sobrepostas de dsRNA e avaliar os resultados para fenótipos comuns.

Em contraste com as técnicas de edição de genes, a RNAi também é uma ferramenta poderosa para estudar genes letais, e há duas maneiras de fazê-lo. Por exemplo, se alguém está interessado na contribuição funcional de um gene onde a perda de função no início do desenvolvimento é conhecida como letal, uma investigação funcional de tal gene pode ser alcançada simplesmente permitindo que o animal se desenvolva normalmente e, em seguida, derrubando o gene via RNAi mais tarde em desenvolvimento (ou seja, no adulto). Alternativamente, um gene onde a perda completa de função é conhecida como letal pode ser investigado através de um knockdown parcial, que pode ser alcançado injetando uma série de concentrações de dsRNA. Alguns de nossos resultados mostram knockdowns de lac2, que são conhecidos por serem letais se a cutícula em insetos se tornar excessivamente macia²⁴. Mesmo o besouro lac2 RNAi retratado na Figura 5 seria improvável de sobreviver fora das condições laboratoriais. Outro gene letal é o corte, que codifica um fator de transcrição que é fundamental para a especificação do destino celular em vários sistemas de órgãos em artrópodes e tem sido ligado ao desenvolvimento da glia no sistema visual Drosophila ²⁹. Com base em nossa experiência com rnai cortado em embriões T. marmoratus, podemos evocar fenótipos informativos oculares em embriões que são capazes de completar seu desenvolvimento ocular embrionário (observações inéditas). Aqui, doses mais altas parecem levar a maiores taxas de letalidade, enquanto doses mais baixas resultam em fenótipos observáveis e informativos.

Nosso protocolo não apenas lista os passos necessários para um pesquisador prosseguir experimentos RNAi em T. marmoratus,como ilustrado, mas também é geralmente aplicável a outros organismos, especialmente organismos aquáticos. Entre os organismos aquáticos, já existem vários exemplos dentro dos crustáceos, como as pulgas de água Dafnia³⁰ e camarão (para uma revisão recente, veja referência³¹). Há amplas oportunidades entre insetos aquáticos, pois estima-se que eles compõem cerca de 6% de toda a diversidade de insetos, com provavelmente mais de 200.000 espécies³². Além disso, a RNAi já foi realizada em andaridores de água que tendem a habitar a superfície dos ambientes aquáticos³³. Se nenhum genoma estiver presente, então um transcriptome pode ser montado de novo. Desde que este processo revele contigas de algumas centenas de nucleotídeos, dsRNA contra genes específicos pode ser projetado. Nosso protocolo para imobilizar insetos em agarose provavelmente também será útil para outros procedimentos, especialmente para organismos macios, maleáveis e aquáticos. Juntos, a RNAi continua sendo uma técnica poderosa para manipular a expressão genética em um grupo diversificado de organismos, mesmo quando não há outras ferramentas moleculares e genéticas disponíveis.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1. Isolamento de RNA e montagem de transcriptoma de novo
líquido	Almoxarifado		Universitário Normalmente disponível localmente em instituições de pesquisa
pontas de pipeta	Fisher Scientific	dependentes do tamanho	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
Mini kit de tecido lipídico RNeasy (kit de isolamento de RNA)	Qiagen	74804	O protocolo específico detalhado é fornecido com o espectrofotômetro do kit
(NnanoDrop)	Thermo Fisher	9836674	Outros modelos funcionariam igualmente bem
1.2. Transcriptoma de novo assembly.
BUSCO.v3	https://busco.ezlab.org/		Qualquer software disponível gratuitamente para avaliar a integridade do transcriptoma pode ser usado.
Bancada de trabalho CLC Genomics	Qiagen	832021	Outros pacotes de software equivalentes também estão disponíveis
Bancada de trabalho Galaxy	https://usegalaxy.org/		Um pipeline de montagem e anotação de transcriptoma on-line de código aberto
NCBI BLASTx	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx		Um pipeline
2. Síntese, clonagem e Miniprep isolamento
ampicilina sal de sódio	Gibco	11593-027	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
glicerol	Fisher Scientific	G33-500	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
Caldo LB	Fisher Scientific	BP1426-500	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
Kit Omniscript RT (transmissão reversa)	Qiagen	205111	Protocolo específico detalhado é fornecido com o kit
One Shot™ TOP10 E. coli quimicamente competente	Invitrogen	C404010	Protocolo específico detalhado é fornecido com o kit
Placas de Petri	Fisher Scientific	FB0875713	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit	ThermoFischer	771471	Protocolo específico detalhado é fornecido com o kit
Kit de purificação QIAquick PCR	Qiagen	28104	Protocolo específico detalhado é fornecido com o kit
agitador-incubadora	Labnet	211DS	Outros modelos funcionariam igualmente bem
espectrofotômetro (NnanoDrop)	Thermo Fisher	9836674	Outros modelos funcionariam igualmente bem
termociclador para PCR	BioRad	T100	Outros modelos funcionariam igualmente bem
TOPO TA Kit de clonagem	Invitrogen	1845069	Protocolo específico detalhado é fornecido com o kit
X-Gal Solution	Thermo Scientific	R0941	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
2.2 Amplificação de PCR e síntese de dsRNA in vitro
Centrífuga	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17R	Outros modelos funcionariam igualmente bem
etanol	Fisher Scientific	A4094	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
FastTaq DNA Polimerase, dNTPack	Roche	13873432	Este kit contém todos os reagentes necessários para um kit de limpeza de
transcrição PCR MEGAclear	ThermoFischer	AM1908	Protocolo específico detalhado é fornecido com o kit
MEGAscript T7 Kit de transcrição	ThermoFischer	AM1334	Protocolo específico detalhado é fornecido com o kit
de água livre de nuclease	Fisher Scientific	AM9932	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
QIAquick PCR kit de purificação	Qiagen	28104	Protocolo específico detalhado é fornecido com o kit
de acetato de sódio	Fisher Scientific	BP333-500	Faça a solução de trabalho 3M
Espectrofotômetro (NnanoDrop)	Thermo Fisher	9836674	Outros modelos funcionariam igualmente bem
3. Coletando e preparando embriões de T. marmoratus em estágio inicial para injeções de dsRNA
agarose	Fisher Scientific	9012-36-6	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
água destilada	Fisher Scientific	9180	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
fórceps (Dumon # 4 Biologia)	Ferramentas de Ciências Finas	11242-40	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
prato de cavidade de vidro (3 pratos de poço)	Fisher Scientific	50-243-43	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
microondas	Welbilt	turn-table	Outros modelos funcionariam igualmente bem
pincel de cabelo natural	Amazon		Qualquer pincel fino fará
P1000 micro-pipetter	Gilson	F123602	Outros modelos funcionariam igualmente bem
Placas de Petri	Fisher Scientific	FB0875713	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
estereomicroscópio	Microsocope Central	10446293	Qualquer bom estereomicroscópio funcionará
pipetas de transferência	Fisher Scientific	21-200-109	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
4. micro-injeções de dsRNA em embriões de T. marmoratus em estágio inicial
	Óptica Edmund (Qimaging)	Retiga 2000R	Outros modelos funcionariam igualmente bem
etanol	Fisher Scientific	A4094	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
corante alimentar	Kroger		Qualquer corante alimentar disponível deve câmara de umidade fina de trabalho
	pegue qualquer caixa de plástico com tampa, esterilize-a com etanol 70% e deixe secar
			L de tampão fosfato de sódio 0,1 M, 100 µ L de solução de cloreto de potássio 0,5 M, 100 µ L de corante alimentar e 790 µ L de água bidestilada Armazene em 4 °C.
Sistemas de Microinjeção intracelular (Picospritzer)	Parker	052-0500-900	Atualmente o modelo III está disponível, mas os modelos mais antigos também funcionam
micro porta-agulhas	A-M Systems	672441	Outros produtos funcionariam igualmente bem
agulhas de microinjeção (1,2 mm x 0,68 mm, 4 polegadas)	A-M Systems	603000	Outros modelos funcionariam igualmente bem
micromanipulador	Drummond Scientific Company	3-000-024-R	Qualquer micromanipulador de qualidade funcionará
fosfato monossódico	Fischer scientific	7558-80-7	Para fazer 10 mL de solução de trabalho 1 M: Adicione 1,2 g de pó de fosfato monossódico a 10 mL de água destilada dupla e misture até obter uma solução límpida
P-1000 Extrator de Micropipeta	Instrumento	Sutter P-1000	Configurações do extrator: Calor 575, Tração 60, Velocidade 75, Atraso 110, Pressão 700.
Micropipetador P10	Gilson	F144802	Outros modelos funcionariam igualmente bem
P1000 micropipetador	Gilson	F123602	Outros modelos funcionariam igualmente bem
potássio	Fischer scientific	7447-40-7	Para fazer 100 mL de solução de cloreto de potássio 0,5 M: Adicione 3,73 g de cristais de cloreto de potássio a 100 mL de água bidestilada e misture até obter uma solução límpida.
tampão fosfato de sódio (0,1M)			Para fazer 10 mL de 0,1 M deste tampão: Misture 8,5 mL de solução dibásica de fosfato de sódio 1 M com 1,5 mL de solução de fosfato monossódico 1 M. Verifique o pH com um medidor de pH e ajuste de acordo com o pH 7.6 à temperatura ambiente.
fosfato de sódio dibásico	Fischer scientific	7558-79-4	Para fazer 10 mL de solução de trabalho 1 M: Adicione 1,42 g de fosfato de sódio dibásico em pó a 10 mL de água bidestilada e misture até obter uma solução límpida
estereomicroscópio	Microsocope Central	10446293	Qualquer bom estereomicroscópio funcionará
5. Preparando larvas de T. marmoratus para injeções de dsRNA
agarose	Fisher Scientific	9012-36-6	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
fórceps (Dumon # 4 Biologia)	Ferramentas de Belas Ciências	11242-40	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
placas de Petri	Fisher Scientific	FB0875713	Produtos de outros fornecedores funcionariam igualmente bem
6. microinjeções de dsRNA em larvas de T. marmoratus injeção forte
microinjeção (1,2 mm x 0,68 mm, 4 polegadas)	A-M Systems	603000	Outros modelos funcionariam igualmente bem
seringa	A-M Systems	603000	Outros modelos funcionariam igualmente bem
porta-agulha micro	A-M Systems	672441	Outros produtos funcionariam igualmente bem
P-1000 Extrator de Micropipeta	Instrumento Sutter	P-1000	Configurações do extrator:Calor 575, Tração 60, Velocidade 75 Atraso 110, Pressão 700.
estereomicroscópio	Microsocope Central	10446293	Qualquer bom estereomicroscópio funcionará