Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para medir fluxos in vitro ca²⁺ em neurônios de cérebro médio e seus efeitos a jusante no caspase-3 usando culturas primárias de cérebro médio do rato. Este modelo pode ser empregado para estudar alterações fisiosiopatológicas relacionadas à atividade anormal do Ca²⁺ em neurônios do cérebro médio, e para tela de novas terapêuticas para propriedades anti-apoptóticas.

Resumo

A doença de Parkinson (DP) é uma devastadora doença neurodegenerativa causada pela degeneração de neurônios dopaminérgicos (DA). O fluxo excessivo de Ca²⁺ devido à ativação anormal dos receptores de glutamato resulta em excitoxicidade da DA e foi identificado como um importante mecanismo para a perda de neurônios da DA. Neste estudo, isolamos, dissociamos e cultura neurônios de cérebro médio do messenencefalon ventral do camundongo (VM) de embriões de camundongos ED14. Em seguida, infectamos as culturas primárias do cérebro do camundongo de longo prazo com um vírus associado ao adeno (AAV) expressando um indicador de cálcio geneticamente codificado, GCaMP6f sob controle do promotor de sinápsia específico do neurônio humano, hSyn. Usando imagens confocal ao vivo, mostramos que neurônios de cérebro médio cultivados exibem fluxos ca²⁺ espontâneos detectados por AAV-hSyn-GCaMP6f. A aplicação do banho de glutamato às culturas do cérebro médio causa elevações anormais no Ca²⁺ intracelular dentro dos neurônios e isso é acompanhado pela ativação caspase-3 em neurônios da DA, como demonstrado pela imunostaining. As técnicas para identificar apoptose mediada por glutamato nos neurônios principais da DA do camundongo têm aplicações importantes para a triagem de alto conteúdo de drogas que preservam a saúde dos neurônios da DA.

Introdução

A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum em todo o mundo, sem cura conhecida. Estimativas sugerem que a prevalência de DP continuará aumentando e deverá superar 1 milhão de diagnósticos até o ano de 2030 apenas nos Estados Unidos¹. Com poucos tratamentos eficazes atualmente disponíveis para combater a DP, há uma necessidade premente de desenvolver terapias mais eficazes. PD é caracterizada por uma perda rápida e progressiva de neurônios de dopamina de cérebro médio (DA)². Os mecanismos que fundamentam a neurodegeneração em DP são mal compreendidos. As evidências sugerem uma provável convergência de múltiplos mecanismos, como estresse oxidativo e disfunção mitocondrial, etc. que contribuem para o início de cascatas de sinalização apoptótica e eventual morte celular³.

Um desses mecanismos convergentes, a excitotoxicidade mediada pelo glutamato tem sido implicada em múltiplas doenças neurodegenerativas, incluindo a DP⁴. Embora a excitotoxicidade mediada pelo glutamato seja pensada para funcionar principalmente através da estimulação de receptores NMDA através de um aumento excessivo na concentração intracelular Ca²⁺ e eventual iniciação da apoptose, os receptores AMPA ca²⁺-permeáveis também foram implicados na resposta excitotóxica^5,,6,7. Portanto, é de interesse determinar a contribuição dos receptores AMPA para a apoptose mediada por glutamato dentro de um modelo de DP. Isso pode ser conseguido usando nBQX, um bloqueador AMPA e kainate, que em concentrações de micromolar é seletivo para receptores AMPA⁸. Excitotoxicidade mediada por glutamato e cascatas de sinalização apoptótica são um alvo a jusante ideal para medir a extensão da morte celular, e um alvo potencial para intervenção terapêutica. Portanto, desenvolver um método de alto teor para avaliar a modulação mediada por glutamato da atividade de cálcio e a sinalização a jusante associada em neurônios messencéceicos ventral primários (VM) seria valioso para a triagem de novos métodos de tratamento sobre sua capacidade de preservar a saúde neuronal.

Aqui, desenvolvemos um protocolo no qual expressamos o indicador de cálcio geneticamente codificado (GECI), GCaMP6f, utilizando AAV2/5 com a sinapsina humana (hSyn) promotor para medir a atividade Ca²⁺ dos neurônios primários VM do rato em resposta à aplicação do glutamato que pode ser medido no nível fisiológico e molecular. Este rastreamento de alto teor pode ser adaptado para descobrir produtos farmacêuticos ou tratamentos que modulam a atividade ca²⁺ para preservar a saúde dos neurônios VM. Propomos que este modelo de cultura primária seja uma forma eficaz de triagem de novas intervenções em DP, baseadas em sua capacidade de preservar a saúde dos neurônios VM e mitigar a progressão da DP.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo o uso de matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas (25 de novembro^de 2019; AUP# 2019-0346).

NOTA: A preparação de soluções de cultura celular deve ser feita utilizando procedimento estéril em um armário de segurança biológica e filtrada a 0,2 μm para evitar contaminação.

1. Elaboração de soluções e meio de cultura

1. Prepare a solução de revestimento de laminina diluindo 20 μL de 1 mg/mL de laminina em 2 mL de H₂O. Prepare-se no dia da dissecção.
2. Prepare a solução de parada de 10% de equino (cavalo) (ES) adicionando 5 mL de ES a 45 mL de 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm ou ponta de filtro de seringa. Armazenar a 4 °C.
3. Prepare 4% de solução de estoque de soro bovino (BSA) adicionando 2 g de pó BSA a 1x salina tamponada com fosfato (PBS) e trazendo para um volume final de 45 mL. Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm ou ponta de filtro de seringa. Armazenar a 4 °C.
4. Prepare a solução de estoque papain diluindo papain para 3 mg/mL em 1x HBSS. Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm ou ponta de filtro de seringa. Armazenar a -20 °C.
5. Prepare a solução deoxyribonuclease (DNase) adicionando 20 mg de pó DNase ao estéril H₂O e trazendo para um volume final de 20 mL. Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm ou ponta de filtro de seringa. Armazenar a -20 °C.
6. Prepare a solução de estoque de ácido ascórbico adicionando 352 mg de ácido ascórbico ao Estéril Destilado H₂O e trazendo para um volume final de 20 mL. Aqueça no banho de 37 °C para dissolver se necessário. Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm ou ponta de filtro de seringa. Armazenar a -20 °C.
7. Prepare o meio de cultura celular adicionando o seguinte a 50 mL de meio neurobásal: 500 μL de Glutamax (100x), 500 μL de soro equino, 1 mL de B-27, 100 μL de ácido ascórbico, 500 μL de penicilina-estreptomicina, 50 μL de kanamicina e 50 μL de ampicillina. Filtro estéril usando um sistema de filtro de 0,2 μm. Armazenar a 4 °C.
8. Prepare 0,01% Solução Triton X-100 adicionando 1 mL de Triton X-100 em 9 mL de PBS 1x para fazer uma solução de 10%. Como Triton X-100 é viscoso, pipeta lentamente para permitir que a ponta encha completamente. Aqueça no banho de 37 °C para dissolver se necessário. Armazenar a 4 °C.
9. Para diluir 10% triton X-100 a 0,01%, realizar 3 diluições seriadas 1:10. Diluir 1 mL de 10% de estoque em 9 mL de 1x PBS para fazer 1% de solução. Diluir 1 mL de solução de 1% em 9 mL de 1x PBS para fazer 0,1% de solução. Diluir 1 mL de solução de 0,1% em 9 mL de 1x PBS para fazer uma solução de 0,01%.
10. Prepare a solução de soro de cabra (NGS) 10% e 1% normal adicionando 1 mL de NGS a 9 mL de 1x PBS para uma solução de 10%. Adicione 100 μL de NGS a 9,9 mL de 1x PBS para fazer 1% de solução.
11. Prepare a solução de estoque de glutamato (100 mM) adicionando 735 mg de ácido L(+)-glutamic ao H₂O destilado estéril e leve a um volume final de 50 mL. Solubilidade nesta concentração será um problema. Adicionar pequenos volumes (100 μL) de ácido clorídrico de 1 M é suficiente para aumentar a solubilidade.
12. Prepare a solução de estoque NBQX (10 mM) adicionando 50 mg de NBQX ao Estéril Destilado H₂O e leve a um volume final de 13 mL.

2. Preparação de pratos culturais e coberturas (Feito no dia anterior à dissecção)

NOTA: Descobrimos que a combinação de três agentes de revestimento, poli-L-lysine, poli-L-ornithine e laminina permite a adesão e viabilidade das células ideais.

1. Coloque 10 placas de Petri de 35 mm em um armário de segurança biológica. Coloque duas tampas circulares de 12 mm em cada prato e encha com 70% de EtOH por 10 minutos. Use uma linha de vácuo para aspirar o EtOH restante de cada prato, permitindo que o EtOH evapore completamente.
2. Pipeta ~90-100 μL de solução de 0,1% de poli-L-lisina em cada deslizamento de cobertura, certificando-se de que todo o deslizamento de cobertura esteja coberto pela solução de poli-L-lisina. Cubra os pratos com tampas e coloque em uma incubadora de 37 °C por 1h.
3. Aspirar a solução de poli-l-lisina remanescente de cada deslizamento de cobertura e enxaguar com H₂O estéril.
4. Repetição passos 2.2 – 2.3 com solução poli-L-ornitina de 0,1%.
5. Novamente, repetimos as etapas 2.2 – 2.3 com solução laminina de 0,01%. Coloque em uma incubadora de CO₂ de 37 °C/5% até ficar pronta para chapeamento celular no dia seguinte.

3. Dissecções embrionárias do rato

NOTA: Usamos entre 4 a 6 camundongos gestantes cronometrados por cultura. Embora grande parte do processo de dissecação ocorra fora de um gabinete de segurança biológica, ainda é importante manter o procedimento estéril. O uso abundante de 70% de EtOH em superfícies próximas ao microscópio de dissecção e em ferramentas cirúrgicas é ideal. Uma máscara também pode ser usada durante a dissecção para evitar ainda mais contaminação. Além disso, usamos 4 antibióticos separados no meio da cultura, por isso a contaminação é improvável. No entanto, se o uso de antibióticos for problemático, essa configuração de dissecção pode ser movida dentro de um capô estéril. Para preservar a viabilidade celular, todas as soluções de dissecção devem ser pré-refrigeradas a 4 °C, e as dissecções devem ser concluídas o mais rápido possível. Não realizamos as dissecções no gelo. O método de dissecção de neurônios de cérebro médio embrionários do camundongo é idêntico aos métodos descritos anteriormente^9,,10.

1. Prepare um espaço em um banco perto de um microscópio de dissecção com uma almofada absorvente e pulverize liberalmente com 70% de EtOH.
2. Pulverize duas placas de Vidro Petri de vidro de 100 x 15 mm e uma placa de Petri de vidro de 50 x 10 mm com 70% de EtOH e permita que a EtOH evapore. Uma vez evaporado, coloque 50 mL de HBSS 1x estéril em cada placa de Petri de 100 x 15 mm.
3. Submergir tesoura cirúrgica, fórceps e lâmina de microtome em 70% EtOH por 10 min mínimo para esterilizar. Coloque os instrumentos na almofada absorvente para secar.
4. Utilizando CO₂ seguido de luxação cervical, eutanize camundongos de 2 a 3 meses de idade cronometrado no dia 14.
5. Pulverizar o abdômen dos camundongos eutanizados com 70% de EtOH. Usando fórceps, pegue o abdômen inferior e abra a cavidade abdominal usando uma tesoura cirúrgica. Comece a cortar perto de onde as fórceps estão segurando o abdômen, fazendo cortes laterais em cada lado até que a parede abdominal possa ser dobrada para trás e o útero esteja claramente visível.
6. Usando uma tesoura cirúrgica, corte ambas as extremidades do chifre uterino. Em seguida, remova o útero e coloque na placa de Petri com 1x HBSS.
7. O uso de fórceps de ponta reta remove cuidadosamente os embriões do útero. Deixe embriões no HBSS durante todo esse processo. Usando as fórceps ou uma lâmina de microtómeo, decapite rapidamente os embriões cortando perto do pescoço. Fazendo o nível de um corte possível.
8. Sob um microscópio dissecando, mova uma cabeça de embrião para uma placa de Petri seca de 50 mm e coloque no lado ventral. Estabilize a cabeça com fórceps colocando e penetrando perto dos olhos/focinho. Fórceps devem ser inclinados para baixo a ~45° para evitar penetrar o mesencephalon.
9. Usando as fórceps na outra mão, remova cuidadosamente a camada translúcida de pele e crânio pouco antes do cume proeminente do messencéfalo. Comece perto da linha média e remova a pele e o crânio caudalmente até que o mesencephalon esteja totalmente exposto.
10. Segure os fórceps perpendiculares ao mesencephalon exposto com uma ponta entre o córtex e o mesenencefalon e a outra perto do cerebelo. Pressione para baixo e aperte os fórceps juntos para remover todo o cérebro médio. O segmento de cérebro médio deve ter aproximadamente 0,5 mm de espessura. Coloque o segmento midbrain na segunda placa de Petri cheia de HBSS 1x fresco. Repita este processo para cada embrião.
11. Usando o microscópio de dissecção, posicione o segmento cerebral com o lado ventral voltado para cima. Se as meninges ainda estiverem presas, remova-a cuidadosamente agarrando-as com os fórceps e levantando-se e afastando-se do segmento cerebral.
12. O segmento cerebral deve ter 4 quadrantes visíveis. Coloque o segmento de tal forma que os dois quadrantes menores estejam posicionados superiores aos dois quadrantes maiores. Há um cume proeminente separando os dois (pequenos) quadrantes superiores dos dois quadrantes inferiores (grandes).
13. Usando as pinças e separe os quadrantes superiores dos quadrantes inferiores e, em seguida, descarte os quadrantes superiores. Os demais quadrantes inferiores terão excesso de tecido lateralmente no lado dorsal, este tecido parecerá menos opaco do que o tecido ventral restante. Remova o tecido dorsal menos denso e descarte. O segmento restante deve conter tanto a Substantia nigra pars compacta (SNc) quanto a área tegmental ventral (VTA).
14. Usando os fórceps, corte o segmento restante do tecido ventral em 4 pedaços menores e usando uma pipeta de furo de 1mL de largura transfira esses segmentos em um tubo cônico de 15 mL com 1x HBSS. Mantenha o tubo cônico com segmentos cerebrais no gelo durante todo o procedimento.
15. Repita este processo para todos os segmentos cerebrais restantes.

4. Dissociação de células

1. Digestão enzimática das células
   1. Aspire cuidadosamente o HBSS a partir do tubo cônico de 15 mL contendo segmentos de cérebro médio, deixando os segmentos na parte inferior do tubo.
   2. Adicione ~800 μL de solução de papain ao tubo e coloque em uma incubadora de 37 °C por 7 min. Resuspend células movendo o tubo e substituindo para a incubadora de 37 °C por mais 7 minutos.
   3. Com uma ponta de pipeta de 1 mL larga, remova apenas os segmentos do cérebro médio em uma alíquota de 1 mL de DNase. Permita que os segmentos cheguem ao fundo da alíquota ou cerca de 1 min de exposição.
   4. Com uma ponta de pipeta de 1 mL larga, remova apenas os segmentos do cérebro médio em um tubo cônico de 15 mL contendo 2 mL de solução stop. Deixe que os segmentos se instalem na parte inferior do tubo e repita a lavagem em um tubo cônico adicional preenchido com solução stop.
2. Trituração mecânica da suspensão celular
   1. No tubo de lavagem da segunda solução de parada, usando uma ponta de pipeta de 1 mL larga, pipeta as células para cima e para baixo 10 vezes até que não haja grandes segmentos de tecido visíveis. É importante evitar a trituração excessiva para a lise celular mínima.
   2. Pipeta lentamente 300 μL de solução BSA de 4% para a parte inferior do tubo cônico de 15 mL contendo segmentos cerebrais. Remova cuidadosamente a ponta da pipeta para manter uma camada de suspensão. Centrifugar a 0,4 x g por 3 min. Em seguida, aspire cuidadosamente as células supernascidas e resuspend em 400 μL de meio de cultura celular.

5. Chapeamento das células

NOTA: Com base na experiência, cerca de 100.000 células viáveis por embrião são coletadas. Camundongos gestantes cronometrados de 2 a 3 meses normalmente têm tamanhos de ninhada de 8 a 10 embriões; portanto, uma estimativa aproximada para o rendimento total de células por camundongo grávida cronometrado é de aproximadamente 1 milhão de células.

1. Usando um hemócitometro preforme uma contagem de células e, em seguida, dilua a suspensão para 2.000 células/μL usando meio de cultura celular. Triturate brevemente para misturar.
2. Remova as tampas com solução de laminina a partir do passo 2 da incubadora e aspire a solução de laminina restante das tampas revestidas usando um vácuo. Prato rapidamente para evitar que as tampas sequem completamente. Pipeta 100 μL (2,0 x 10⁵ células/deslizamento de cobertura) em cada deslizamento de cobertura e coloque placas de Petri em uma incubadora de 37 °C por 1h.
3. Adicione cuidadosamente 3 mL de cultura celular a cada prato e coloque de volta na incubadora de 37 °C. Pré-forma meio muda 2 vezes por semana durante 2 semanas.

6. Infecção da cultura celular em 14 DIV com vetores virais associados ao Adeno (AAV)

1. Para cada prato prepare 1 mL de meio DMEM livre de soro com 1 μL de hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 10¹³ titer)
2. Aspire o meio de cultura celular de cada prato e substitua por 1 mL de DMEM livre de soro contendo hSyn-GCaMP6f. Coloque os pratos de volta na incubadora de 37 °C por 1h.
3. Aspire o meio livre de soro contendo AAVs e substitua por 3 mL de meio de cultura celular. Coloque os pratos de volta na incubadora de 37 °C. Descobrimos que 5-7 dias de infecção por AAV permite níveis ideais de expressão GCaMP. Continue a mudar de meio a cada 2-3 dias durante este período de infecção viral.

7. Imagem confocal ca²⁺ ao vivo entre 19-21 DIV

NOTA: Como mencionado na etapa 6.3, a imagem pode ser feita entre 5-7 dias após a infecção viral. Esta é a janela ideal para alcançar a expressão visível do fluoróforo em níveis que permitem a detecção da atividade espontânea ca^2+.

1. Preparação de buffers de gravação
   1. Para fazer 1 L de buffer de gravação HEPES, adicione: 9.009 g de NaCl, 0,3728 g de KCl, 0,901 g de D-glicose, 2.381 g de HEPES, 2 mL de solução de estoque CaCl₂ de 1 M CaCl 2 e 500 μL de 1 M MgCl₂ solução de estoque para 800 mL de estéril destilado H₂O. Leve o pH para 7,4 com NaOH. Traga para um volume final de 1 L.
   2. Para fazer 200 mL de 20 μM tampão de gravação de glutamato, diluir 40 μL de 100 mM solução de estoque de glutamato em 200 mL de tampão de gravação HEPES descrito acima.
   3. Para fazer 200 mL de buffer de gravação NBQX de 10 μM, diluir 200 μL de 10 mM NBQX solução de estoque em 200 mL de buffer de gravação HEPES.
2. Imagem confocal
   1. Encha uma placa de Petri estéril de 35 mm com 3 mL de tampão de gravação.
   2. Remova uma placa de Petri de 35 mm com culturas infectadas da incubadora de 37 °C. Usando fórceps finos, pegue cuidadosamente a borda de uma tampa e transfira-a rapidamente para a placa de Petri cheia de tampão de gravação. Coloque o deslizamento de cobertura restante em médio de volta na incubadora de 37 °C. Transporte o prato com tampão de gravação para o microscópio confocal.
   3. Inicie o software de imagem. Prossiga para o próximo passo enquanto ele inicializa.
   4. Inicie a bomba peristáltica e coloque a linha no buffer de gravação. Calibrar a velocidade de fluxo a 2 mL/min.
   5. Transfira a mancha de cobertura infectada da placa de Petri de 35 mm para o banho de gravação.
   6. Usando o objetivo de imersão em água de 10x e luz BF, encontre o plano de foco e procure uma região com alta densidade de corpos celulares neurônios. Mude para o objetivo de imersão em água 40x e usando luz BF refoque novamente a amostra.
   7. Na janela "Lista de corantes" dentro do FluoView selecione AlexaFluor 488 e aplique-a.
   8. A expressão AAV pode ser variável; portanto, a fim de evitar a superexposição e fotobleaching dos fluoroforos, comece com configurações de baixa HV e laser power. Para o canal AlexaFluor 488, defina a alta tensão (HV) para 500, o ganho para 1x e offset para 0. Para a linha laser 488, a potência foi de 5%. Para aumentar o volume efetivo retratado no plano z, aumente o tamanho do orifício para 300 μm. Use a opção de digitalização "focus x2" para ajustar os sinais de emissão de forma otimizada aos níveis de subsaturação. A partir daqui, as configurações podem ser ajustadas até que a visibilidade ideal de cada canal seja alcançada.
      NOTA: Para capturar com precisão toda a gama de fluxos ca²⁺ com GCaMP, ajuste as configurações de HV e laser da linha de base, a fim de permitir um aumento na intensidade fluorescente sem sobressaturar o detector.
   9. Uma vez que as configurações do microscópio sejam otimizadas, mova o estágio para localizar uma região com múltiplas células exibindo alterações espontâneas na fluorescência GCaMP6f e foco no plano desejado para imagem.
   10. Use a ferramenta "Clip rect" para prender o quadro de imagem a um tamanho que pode alcançar um intervalo de quadro de pouco menos de 1 segundo. Isso é necessário para definir o intervalo de imagem em 1 quadro por segundo.
   11. Defina a janela "Intervalo" para um valor de 1.0 e a janela "Num" para 600.
       NOTA: Para entregar diferentes buffers de gravação no ponto de tempo desejado (300 s), é importante calibrar a latência da bomba para entregar a nova solução ao banho. Isso dependerá da taxa de perfusão da solução (2 mL/min) e do comprimento da linha usada para bombear a solução.
   12. Para capturar um filme da série T, selecione a opção "Tempo" e, em seguida, use a opção de digitalização "XYt" para iniciar a imagem.
   13. Observe a barra de progresso da imagem e mova a linha do buffer de gravação hepes para o buffer de gravação de glutamato de 20 μM no ponto de tempo apropriado (por exemplo, se a latência da bomba for calibrada para entregar solução em 60 s, mova a linha para o tampão de glutamato em 240 quadros, a fim de entregar glutamato a 300 s).
   14. Quando a imagem estiver concluída, selecione o botão Series Done e salve o filme final da série T. Continue a perfundir 20 μM Glutamato por mais 5 minutos, de modo que os neurônios cultivados tenham sido expostos ao glutamato por um total de 10 minutos. Repita este processo para que cada deslizamento de cobertura seja imageado.
   15. Após a exposição adicional de 5 minutos ao glutamato de 20 μM, remova o deslizamento do banho e coloque de volta na placa de Petri de 35mm contendo tampão de gravação até que o dia da imagem seja concluído. Quando terminar, prossiga para a etapa 8.
3. Análise de traços Ca²⁺
   1. Realize a análise de imagens no ImageJ. Instale o plugin BIO-FORMATS para ImageJ, que permitirá . Arquivos de imagem OIB para abrir.
   2. Na barra de ferramentas ImageJ, clique em Analisar | Defina medidase selecione a caixa para O valor cinza médio (MGV).
   3. Em ImageJ, abra um filme da série T como um hipersepilado.
   4. Arraste o controle deslizante para o filme e identifique o quadro com resposta máxima de glutamato para visualizar todos os neurônios que respondem ao glutamato. Use a ferramenta polígono para rastrear todos os corpos celulares de neurônios visíveis, adicionando seus ROIs à lista "gerenciador de ROI".
   5. Quando terminar de rastrear e adicionar ROIs, selecione todos os ROIs na janela ROI Manager e use a seleção de várias medidas na lista de opções mais. Copie e cole esses dados em uma planilha. Complete este processo para que todos os filmes sejam analisados.
   6. Para cada ROI, converta os dados mgv brutos de cada quadro para valores ΔF/F₀ usando a equação: ΔF/F₀ = [F(t) – F₀] / F₀. Onde F(t) = MGV de qualquer quadro, e F₀ = MGV de linha de base média de ~10 quadros onde não há fluxos Ca^2+.
   7. Usando um software estatístico como o OriginPro 2020, os traços ΔF/F₀ convertidos podem ser transformados em gráficos de linha. A função "Analisador de pico" pode ser usada (ou função semelhante se usar um software diferente) para medir o pico de amplitude da resposta ao glutamato, latência para responder ao glutamato e área sob a curva.

8. Imunostaining de culturas

NOTA: Após a fixação com formalina, as manchas podem ser armazenadas em 1x PBS a 4 °C até estarem prontas para serem processadas para imunossuagem. A incubação de anticorpos primários e secundários foi feita de forma serial, como tal incubação com anticorpo primário anti-Caspase-3 e seu anticorpo secundário complementar precedeu a incubação com o anticorpo primário anti-TH e seu anticorpo secundário complementar.

1. Imediatamente após a exposição ao glutamato, coloque o deslizamento de cobertura de volta em sua placa de Petri de 35 mm, aspire o tampão de gravação e adicione 3 mL de 10% de formalina. Deixe sentar-se por 40 minutos em temperatura ambiente (RT).
2. Enxágüe o prato 3 vezes com 1x PBS.
3. Aspirar as células PBS e permeabilize em 1 mL de 0,01% Triton X-100 em PBS por 2 min.
4. Enxágüe o prato 3 vezes com 1x PBS.
5. Aspire o PBS e bloqueie células em 1 mL de 10% de NGS em PBS por 40 min.
6. Enxágüe o prato 3 vezes com 1x PBS.
7. Adicione 1 μL de anticorpo primário anti-Caspase-3 de coelho a 1 mL de 1% de NGS em PBS (diluição de 1:1000). Aspire PBS do prato e substitua pela solução de anticorpos primário. Coloque em um agitador e incubar por 1,5 h no RT.
8. Enxágüe o prato 3 vezes com 1x PBS.
9. Adicione 1 μL de anticorpo médio alexafluor 488 de cabra a 1 mL de 1% de NGS em PBS (diluição de 1:1000). Aspire PBS do prato e substitua pela solução de anticorpos secundários. Coloque em um agitador e incubar por 1 h no RT. Em frente, proteja as amostras da luz.
10. Enxágüe o prato 3 vezes com 1x PBS.
11. Repita os passos 8.7 – 8.10, mas usando o anticorpo primário anti-TH de frango (1:1000) na etapa 8.7 e o anticorpo secundário AlexaFluor 594 (1:1000) na etapa 8.9.
12. Após a lavagem final do PBS, coloque 30 μL de meio de montagem em um slide de microscópio. Usando fórceps pegue uma mancha de cobertura da placa de Petri de 35 mm e coloque o deslizamento de tampas com as células voltadas para o meio de montagem. Ambas as tampas caberão em um único slide de microscópio se colocadas corretamente. Coloque em uma área seca e escura e deixe o meio de montagem secar durante a noite.

9. Imagem confocal de culturas imunossu detidas

1. Imagem confocal
   1. Inicie o software de imagem. Coloque a amostra no estágio do microscópio.
   2. Com as oculares do microscópio, utilizando um objetivo de ampliação de 20x e luz epifluorescente com um filtro TRITC, concentre a amostra e procure por um corpo celular TH+.
   3. Uma vez que localize um corpo celular TH+, centralize-o no campo de visão e, em seguida, mova-se para o objetivo de ampliação de 60x.
   4. Selecione os corantes AlexaFluor 488 e AlexaFluor 594 na janela "lista de corantes".
   5. Como na imagem ao vivo, comece com configurações de baixa HV, ganho, deslocamento e energia a laser para evitar fotobleaching. Use a opção de varredura "focus x2" para avaliar a intensidade fluorescente de cada canal e ajustar de acordo. Como essas imagens serão mais tarde quantificadas para intensidade fluorescente, é necessário manter as configurações de imagem consistentes em todos os campos de visão. Portanto, é melhor olhar para alguns exemplos de cada condição para ter uma ideia da faixa de intensidade fluorescente entre as amostras.
   6. Uma vez determinadas as configurações de imagem ideais, selecione a opção de varredura "focus x2" e mova a célula de interesse para o centro do campo de visão. Aumente o zoom digital para 3x usando o controle deslizante "zoom".
   7. Usando o botão de foco, encontre o plano de foco com a fluorescência mais brilhante e capture uma única imagem XY plano. Guarde a imagem para terminar.
   8. Volte para o objetivo de ampliação de 20x para procurar outra célula TH+. Repita este processo até que o número desejado de células tenha sido amostrado de cada condição.
2. Análise de imagem
   1. Na barra de ferramentas ImageJ, clique em Analisar | Defina medidase selecione as caixas para Área, Densidade Integrada e Valor cinza Médio.
   2. Abra uma imagem como um hipersepilamento com cada canal separado arrastando e caindo na barra de ferramentas ImageJ ou selecionando a imagem através do menu de arquivos.
   3. Use o canal TH (594 nm) para desenhar ROIs ao redor do corpo celular. Usando a ferramenta de rastreamento de polígono no ImageJ, rastreie de perto a borda externa do corpo celular. Onde a distância entre a membrana celular e o núcleo celular é a menor, rastreie uma linha reta através do citosol até a borda do núcleo e, em seguida, siga de perto o contorno do núcleo, a fim de excluí-lo. Em seguida, rastreie uma linha reta de volta à membrana externa, beirando a linha inicial o mais próximo possível, e continue a seguir o contorno do corpo celular até que o ROI esteja completo.
   4. Usando o atalho do teclado "T" ou usando o caminho do menu da barra de ferramentas Analise | Ferramentas | Roi Manager, abra o gerenciador de ROI e adicione o ROI que acabou de ser sorteado na lista.
   5. Selecione a janela do canal caspase-3 (488 nm) e selecione o ROI adicionado na lista "ROI Manager".
   6. Na janela ROI Manager, selecione o botão Medir. A janela de resultados aparecerá com as medidas definidas anteriormente. Copie-os para uma planilha e repita esse processo para cada célula.

Resultados

Após a culminação inicial das células, tratamos pratos de cultura VM a 14 DIV com 1 μL de AAV hSyn-GCaMP6f e permitimos 5 dias de expressão viral. No dia da imagem, o buffer de gravação do HEPES foi preparado fresco. Usamos duas condições; em uma condição foi aplicado 20 μM de glutamato para 10 min, enquanto na outra condição 5 min de 10 μM NBQX aplicação precedeu uma co-aplicação de 10 min de 10 μM NBQX + 20 μM glutamato. Em ambas as condições, observamos alterações heterogênios e espontâneas na fluorescência GCaMP6f, que indicam fluxos ca²⁺ espontâneos, como mostrado nos traços representativos(Figura 1A,B, Filme Suplementar 1-2). A aplicação de 20 μM de glutamato gerou uma resposta Ca²⁺ robusta e sustentada em neurônios espontaneamente ativos e quiescentes(Figura 1A, Filme Suplementar 1). A aplicação de 10 μM NBQX reduziu a atividade espontânea e bloqueou parcialmente a resposta ao glutamato (Figura 1B, Filme Suplementar 2). A medida em que a aplicação do glutamato estimulou uma resposta ca²⁺ em cada condição foi quantificada usando área sob a curva, amplitude de pico e latência para responder. Ambas as áreas sob a curva e amplitude de pico foram semelhantes tanto para as condições tratadas com glutamato quanto para o glúteo NBQX + glutamato(Figura 1C),enquanto a latência à resposta foi significativamente aumentada na condição NBQX + glutamato(Figura 2A,B). Além de quantificar a resposta ca²⁺ ao tratamento de glutamato, fixamos e manchamos amostras com um anticorpo anti-caspase-3 como medida de apoptose mediada por glutamato. Observamos uma gama de ativação caspase-3 nas condições(Figura 3A,B). A ativação caspase-3 foi quantificada pela área de medição e intensidade média de caspase-3. Quando comparadas com células de controle não tratadas, a área média de células com ativação caspase-3 sob glutamato e NBQX + condições de glutamato tendência para significância(Figura 3B). A intensidade média de caspase-3 foi significativamente maior nas condições de glutamato e NBQX + glutamato em comparação com controles não tratados(Figura 3B). Juntos, esses resultados demonstram uma estrutura de alto teor em que apoptose dos neurônios pode ser medida quantificando respostas ca²⁺ aos agentes excitotóxicos e acompanhados com uma análise de eventos apoptóticos a jusante, como a ativação caspase-3 no mesmo conjunto de culturas.

Figura 1: Os neurônios mesencéces ventral cultivados apresentam atividade espontânea ca²⁺ e são robustamente estimulados pela aplicação do glutamato. (A) Traços representativos da atividade espontânea ca²⁺ em neurônios VM e sua resposta à aplicação de glutamato de 20 μM. (B) Traços representativos da atividade espontânea ca²⁺ em neurônios VM e sua resposta à aplicação de 10 μM NBQX + 20 μM glutamato. (C) Dados populacionais mostrando área sob a curva e amplitude de pico de traços ca^2+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Bloqueio AMPAR com NBQX atrasa resposta à aplicação de glutamato em neurônios mesencéces ventral cultivados. (A) Os traços representativos Ca²⁺ de glutamato (cinza) e NBQX + glutamato (azul) evocaram respostas. Os traços médios de Ca²⁺ de glutamato (preto) e NBQX + glutamato (vermelho) são mostrados sobrepostos. (B) Dados populacionais que mostram latência à resposta para glutamato e NBQX + glutamato evocaram respostas. A variação percentual entre as condições de glutamato e NBQX + glutamato é exibida no painel direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A aplicação do glutamato aumenta a expressão caspase-3 em neurônios mesentados ventral positivos de tyrosina (TH). (A) Imagens confocal representativas das culturas VM imunos detidas para caspase-3 (verde) e TH (vermelho), barra de escala = 10 μm. (B) Dados populacionais mostrando área do neurônio DA e valor cinzento médio da expressão caspase-3 em cada condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme suplementar 1: Atividade espontânea ca²⁺ e resposta à aplicação de glutamato.
Fluxos espontâneos ca²⁺ na presença de tampão de gravação HEPES (0-300 s) seguidos pela aplicação de 20 μM glutamato (301-600 s). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Filme suplementar 2: atividade espontânea ca²⁺ e resposta à aplicação NBQX + glutamato.
Fluxos espontâneos ca²⁺ na presença de tampão de gravação HEPES (0-300 s) seguidos pela aplicação de 10 μM NBQX (301-600 s), e 10 μM NBQX + 20 μM glutamato (601-900 s). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

Descrevemos um sistema de cultura celular de longo prazo de mesencéfalia ventral (VM) para análise de alto teor de apoptose mediada por glutamato em neurônios. Estudos têm utilizado culturas dopaminérgicas primárias de cérebro médio para elucidar mecanismos excitotóxicos no contexto dos modelos de DP^11,12. Neste estudo, utilizamos uma abordagem combinatória utilizando Indicadores de Cálcio Codificados Geneticamente (GECIs) para medir a atividade do Ca²⁺ e associar ainda mais essa atividade a alterações moleculares a jusante, como o início das cascatas de sinalização apoptótica⁴. O método tem múltiplas vantagens para outros sistemas de cultura celular semelhantes. Como temos um interesse particular na excitotoxicidade dentro do contexto da doença de Parkinson, usar culturas primárias de células VM é ideal. Usando diferentes técnicas de realocação de campo, como tampas gridded ou um estágio de microscópio XY motorizado combinado com imunostaining TH, podemos estudar diretamente os efeitos específicos do tipo celular da apoptose mediada por glutamato em neurônios de cérebro médio ventral. Além disso, o modelo de cultura celular de 3 semanas permite que os neurônios desenvolvam seu perfil molecular completo e maduro, refletindo os neurônios da DA^{adultos 9}. Métodos anteriores se concentraram principalmente em mudanças moleculares após a excitotoxicidade mediada pelo glutamato^13,14. O modelo é único em sua capacidade de correlacionar alterações agudas na fisiologia neuronal com eventos moleculares a jusante em tipos celulares identificados. Uma limitação do modelo de cultura primária é que a técnica de dissecção captura todo o cérebro médio ventral, incluindo neurônios DA e GABAérgic, bem como neurônios do SNc e VTA. Evidências sugerem agora que os neurônios da DA da SNc têm vulnerabilidade seletiva ao cálcio e eventual morte celular em comparação com os neurônios da DA do vizinho VTA¹⁵. Infelizmente, diferenciar os neurônios VTA dos neurônios VTA em culturas embrionárias tem se mostrado difícil com poucos marcos anatômicos para definir essas estruturas no cérebro embrionário.

Demonstramos que a técnica de cultura primária permite quantificação da atividade espontâneo heterogênio Ca²⁺ (Figura 1). Portanto, este é um modelo ideal do sistema de cultura celular para estudar células tonicamente ativas, como o pacemaking neurônios dopaminérgicos do cérebro médio, neurônios neocorticais e neurônios GABAérgicos do núcleo supraciasmático (SCN)^16,17. Na maioria das aplicações, a imagem Ca²⁺ não atinge a mesma resolução temporal que a eletrofisiologia. Portanto, é provável que um único evento Ca²⁺ seja análogo a uma explosão de potenciais de ação neuronal. Isso pode ser interpretado para significar que a imagem Ca²⁺ permite medidas relativamente precisas de atividade anormal de estouro em células de marcação de passo e, portanto, é apropriada para uma tela de alto conteúdo de Ca^2+-mediada morte celular excitotóxica.

Para alcançar e manter a atividade espontânea ca^2+, é importante abordar dois pontos-chave no protocolo. A primeira é a densidade de revestimento das células após a dissecação. Para neurônios VM primários, estudos anteriores utilizaram cerca de 100.000 células/cm^29,10. Adaptamos o protocolo para emplacar uma densidade de 200.000 células/cm^2,o que cria uma faixa heterogedróia de atividade espontânea e aumenta o número de neurônios VM dopaminérgicos presentes em cada deslizamento de cobertura. Uma vez que diferentes neurônios de marcação de passo possuem propriedades distintas de disparo^16,a densidade de revestimento precisa ser personalizada para o tipo celular que está sendo estudado e otimizado para alcançar níveis ideais de atividade espontânea. Em segundo lugar está o tempo de incubação após a infecção viral de AAVs. Como a densidade de revestimento, isso dependerá do contexto específico da questão da pesquisa e do tipo de AAV que está sendo utilizado. Para o AAV específico utilizado aqui, 5 dias de incubação após infecção viral é ideal para alcançar os níveis de expressão proteica desejados, o que permite mudanças dinâmicas na fluorescência GCaMP, a fim de registrar a atividade ca^2+. Muitos fatores determinam a rapidez e eficiência que um AAV expressará sua carga, muito do que está fora do escopo deste método, mas brevemente, é importante considerar a atividade do promotor e a taxa em que a proteína de carga amadurece e dobra.

Outra vantagem do método é que ele permite uma flexibilidade considerável no formato, vetores de expressão, uso de equipamentos de imagem e a gama de questões científicas que podem ser abordadas. Além disso, o método permite a investigação de uma ampla gama de questões específicas que envolvem excitotoxicidade mediada por glutamato em DP, e outros modelos de disfunção do sistema nervoso. Por exemplo, a excitotoxicidade mediada pelo glutamato envolve múltiplos receptores e cascatas de sinalização⁵. Utilizando o método, e como demonstrado com o bloqueador AMPAR, NBQX na Figura 1,é possível dissecar componentes específicos da resposta de glutamato excitotóxico a um nível fisiológico e molecular. Possivelmente, uma abordagem semelhante usando inibidores de sistemas de segundo mensageiro poderia ser usada para determinar sua contribuição à excitoxicidade. Além disso, os AAVs usados aqui poderiam ser adaptados para expressar GECIs com promotores específicos de células ou sensores optogenéticos expressos por AAV que poderiam ser usados para medir outros parâmetros, como a liberação de neurotransmissores.

Além das dissecções embrionárias primárias e imagens confocal, grande parte do protocolo utiliza habilidades básicas de laboratório que não exigem treinamento especializado. Portanto, as limitações ao modelo incluem a dificuldade da técnica de dissecção embrionária, o tempo que as células devem ser cultivadas para atingir a maturidade, e acesso a um microscópio confocal, ou aparelho de imagem semelhante. Os muitos benefícios e flexibilidade do método superam essas limitações, tornando este um modelo ideal para estudar o papel da excitotoxicidade mediada pelo glutamato em distúrbios do sistema nervoso. Finalmente, este modelo pode ser uma ferramenta eficaz para tela de novos compostos para efeitos anti-apoptóticos e sua capacidade de preservar a saúde dos neurônios da DA.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10% de formalina/PBS	VWR	100496-506
10X NA 0,3 objetiva de imersão em água	Olympus	UMPLFLN10XW
vidro de cobertura circular de 12 mm nº 1	Phenix Research Products	MS20-121
20X NA 0,85 objetiva de imersão em óleo	Olympus	UPLSAPO20XO
placas de cultura de células plásticas não revestidas de 35 mm	VWR	25382-348
40X NA 0,3 objetiva de imersão em água	Olympus	LUMPLFLN40XW
60X NA 1,35 objetiva de imersão em óleo	Olympus	UPLSAPO60XO
Ampicilina (sódio)	Gold Bio	A-301-25
B-27 suplemento	ThermoFisher	17504044	50x estoque
Microscópio Binolcular	Kent Scientific	KSCXTS-1121
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030
Cloreto de cálcio (CaCl < sub > 2 < / sub>), anidro	Sigma-Aldrich	746495
frango policlonal anti-tirosina hidroxilase	Abcam	ab76442
Desoxirribonuclease I (DNase)	Sigma-Aldrich	DN25
D-glicose, andídro	Sigma-Aldrich	RDD016
DMEM + GlutaMAX médio	ThermoFisher	10569010	500 mL
Soro equino	ThermoFisher	26050088	inativado por calor
de filtro de KSC5410		Kent Scientific	de 100 V
PES 22UM 250ML	VWR	28199-764
Fluoview 1000	Olympus
Fluoview 1200	Suplemento Olympus
GlutaMAX	ThermoFisher	35050061
Cabra policlonal anti-frango Alexa Fluor 594	Abcam	ab150176
Cabra policlonal anti-coelho Alexa Fluor 594	Abcam	ab150077
Solução salina balanceada Hanks (HBSS) 1x	ThermoFisher	14175095	500 mL
HEPES	VWR	101170-478
HeraCell 150 CO2 incubadora	Heraeus (ThermoFisher)
ImageJ v1.52e	NIH
IRIS-Tesoura Fina (Tipo Redondo)-S/S Str/31*8mm/13cm	RWD	S12014-13
Monossulfato de canamicina	Ouro Bio	K-120-25
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich	A7506
Ácido L-glutâmico	VWR	97061-634
Cloreto de Magnésio (MgCl2), andídromo	Sigma-Aldrich	M8266
MPII, 115/230 VAC, 50/60 Hz	Aparelho Harvard	70-2027
MULLER Micro Forceps-Str, pontas de 0,15 mm, 11 cm	RWD	F11014-11
NBQX	Hello Bio	HB0443
Meio neurobasal	ThermoFisher	21103049	500 mL
Soro de cabra normal (NGS)	Abcam	ab7481
Origem 2020	OriginLab
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	Addgene	100837-AAV1	Título: 1.00E+13 gc/ml
Papaína	Worthington Biomedical Corporation	LS003126
Penicilina estreptomicina	ThermoFisher	15140122	10.000 U/mL
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x	ThermoFisher	10010049	500 mL
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P4832
Poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich	P4957
Cloreto de potássio (KCl), peças de tubulação de	Sigma-Aldrich	746436
para aparelho MPII	Harvard	55-4148
Coelho monoclonal anti-caspase-3	Abcam	ab32351
Cloreto de sódio (NaCl), anidro	Sigma-Aldrich	746398
Sacarose	Sigma-Aldrich	S7903	BioXtra, ≥ 99,5% (GC)
Camundongos C57BL/6 fêmeas grávidas	Texas A& M Institue for Genomic Medicine
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	500 mL
Ponteiras de pipeta azuis de diâmetro largo P1000	VWR	83007-380