Monitoramento Simultâneo da Eletrofisiologia Wireless e Teste Comportamental de Memória como Ferramenta para Estudo da Neurogênese do Hipocampo

O teste comportamental é crucial na pesquisa em neurociência para uma grande quantidade de informação gerada em um contexto in vivo. Nesse sentido, pesquisadores têm utilizado amplamente diferentes testes comportamentais para analisar a função sensório-motora, as interações sociais, o comportamento ansioso e depressivo, a dependência de substâncias e as diversas formas de funções cognitivas¹. O registro manual de testes comportamentais pode ser difícil, exaustivo e impreciso mesmo para a maioria dos observadores experientes. Embora alguns esforços tenham sido feitos para desenvolver softwares livres e de código aberto para registro de comportamento (por exemplo, aplicativo sexrat male² para comportamento sexual), várias alternativas permitem o registro comportamental automático e em tempo real de diferentes espécies animais, desde peixes³ até roedores ^4,5,6. O rastreamento de vídeo é um método valioso para a gravação rápida e precisa do comportamento usado em uma ampla variedade de aplicações⁷. Uma característica mais potencial na área de registro comportamental é explorar a atividade neural durante a manifestação comportamental. O registro simultâneo da atividade neuronal (de células isoladas para as principais áreas cerebrais) e tarefas comportamentais poderia nos mostrar como o cérebro gera padrões comportamentais específicos⁸. Comportamentos são uma sequência de componentes menores que podem revelar correlatos entre a atividade neural e movimentos ou ações. Se a atividade neuronal e os padrões comportamentais pudessem ser registrados simultaneamente por meio de várias escalas de tempo, eles poderiam explicar como cada estado cerebral se correlaciona com cada comportamento particular (para um exame mais aprofundado do registro comportamental, ver Datta et al., revisão⁸ de 2019). Portanto, o registro sincronizado da atividade comportamental e neuronal na escala desejada (de neurônios a grandes áreas do cérebro) é considerado uma ferramenta extremamente útil. Existem vários sistemas destinados a integrar registros comportamentais com outras medidas como a atividade^neural4,5.

Embora a eletroencefalografia seja considerada uma das técnicas mais utilizadas no campo da neurociência clínica e de pesquisa, a mobilidade relativamente alta, bem como o tamanho do aparelho de registro de EEG, torna essa técnica única e desafiadora para detecção em modelos in^vivo9. Algumas soluções para esse problema foram desenvolvidas, por exemplo, o uso de cabos e dispositivos giratórios que permitem que os animais se movam livremente na arena. No entanto, os sistemas baseados em cabos muitas vezes impõem problemas para a realização de estudos, por exemplo, durante a transferência de um animal de uma gaiola para outra, observa-se impedimento ou emaranhamento do animal com os cabos. Dispositivos telemétricos foram desenvolvidos para registros eletrofisiológicos sem fio para aumentar a flexibilidade da situação de registro^10,11. No entanto, tais sistemas têm mostrado limitações consideráveis devido ao seu baixo número de canais de gravação e baixas taxas de amostragem¹¹. Neste estudo, foi utilizado um sistema sem fio disponível comercialmente que envia sinais de EEG do animal através de uma conexão Wi-Fi com um sistema de roedores em movimento livre¹². O aparelho pesa 6 gramas e suporta até 16 canais gravados a 1 kSps. Este sistema permite o registro de EEG ou spike no ambiente animal, com uma perturbação reduzida, servindo como uma solução econômica em comparação com os sistemas eletrofisiológicos tradicionais no mercado. Além disso, sincronizamos esses dados usando um software de rastreamento de vídeo para fornecer correlação entre EEG e padrões comportamentais. Essa sincronização é feita off-line por alinhamento e interpolação de dados e eventos com base em carimbos de data/hora gerados por ambos os sistemas e é processada no MATLAB.

A neurogênese do adulto é definida como a proliferação, sobrevivência e diferenciação em neurônios de células recém-geradas no giro denteado de animais^13,14. Sabe-se que esse processo está associado à melhora da memória e do aprendizado, o que aumenta a neurogênese adulta em roedores por meio de condições de ambiente enriquecido (EE)¹⁵. A EE consiste em alojar roedores em pequenos grupos dentro de uma grande gaiola provida de brinquedos e tubos, onde os animais apresentam relevância biológica nova e complexa, mas sem relevância biológica¹⁵. Embora o EE estimule a neurogênese hipocampal, ele também varia em muitos fatores, como idade, tensão animal, condições específicas de estimulação ou procedimento de detecção da neurogênese. Em camundongos de meia-idade expostos ao alojamento de EE por sete dias, o nascimento de novas células granulares (GC) no giro denteado (GD) hipocampal foi relatado¹⁶. Estudos tentando ablar seletivamente a neurogênese adulta em ratos adultos têm sugerido que novas células granulares de cerca de 1 a 2 semanas de idade são necessárias na resposta aprendida¹⁷. Por volta de 2 ou 3 semanas após o nascimento do CG no adulto GD, várias características como espinhos dendríticos, essenciais para a transmissão sináptica^{excitatória18}, começam a aparecer. realizaram uma análise quantitativa para mostrar que o pico de crescimento da coluna ocorre durante as primeiras 3 a 4 semanas¹⁹. Vários estudos eletrofisiológicos in vivo sugerem que apenas três semanas de condições de alojamento do EE produzem alterações na transmissão sináptica do GD e aumentam a excitabilidade celular²⁰. Além disso, foi relatado que a exposição a um ambiente enriquecido em 1-4 semanas após injeções de BrdU aumentou significativamente a densidade de células BrdU/NeuN na camada granular de DG em camundongos²¹. Esses autores sugerem que existe um período crítico entre uma e três semanas após a exposição ao EE, uma vez que foi observado um aumento substancial no número de novos neurônios²¹. Estudos da neurogênese hipocampal adulta (NHA) em humanos têm sido controversos, uma vez que não há evidências diretas. No entanto, um relato recente descreveu os estágios de desenvolvimento da AHN no cérebro humano adulto, identificando milhares de neurônios imaturos no GD e, assim, demonstrando a importância da AHN durante o envelhecimento em humanos²². Com base nas evidências mencionadas anteriormente, o estudo do AHN em modelos animais é mais importante do que nunca (para um exame mais aprofundado do AHN, ver Leal-Galicia et al., revisão de 2019¹⁵).

Como mencionado anteriormente, o hipocampo tem sido associado a uma função fundamental nas capacidades de aprendizagem e memória. A formação das memórias passa por três processos distintos: codificação (aquisição da memória), consolidação (armazenamento da memória) e recuperação (reconhecimento da memória)²³. A memória de reconhecimento em humanos é testada por meio da tarefa de comparações pareadas visuais²⁴. Os fundamentos dos modelos humanos e animais de memória e amnésia são os testes comportamentais que avaliam a capacidade de reconhecer um estímulo previamente^{apresentado25,26,} como a tarefa de comparações visuais pareadas em humanos. Portanto, um dos testes comportamentais mais utilizados para avaliar a habilidade de um roedor em reconhecer um estímulo previamente apresentado, ou seja, a capacidade de aprendizagem e memória é a tarefa de reconhecimento de objetos novos espontâneos (NORT)^23,27. O protocolo NORT consiste em dois objetos novos idênticos em uma arena familiar por 10 min no ensaio de aquisição. Após um tempo específico entre 0,^{28 e 48 horas29} (tempo variável de acordo com cada protocolo), o animal é devolvido à mesma arena contendo um dos mesmos objetos familiares e um objeto novo. O animal explora espontaneamente o objeto novo se o objeto familiar foi memorizado²⁶. A razão de preferência é comumente usada na avaliação do desempenho exploratório. É determinado dividindo o tempo total de exploração do objeto do tempo de exploração do objeto novo ou familiar. O NORT tem algumas vantagens sobre outros testes de memória de reconhecimento. Mais importante ainda, não requer motivação externa, recompensa ou punição. Não gera condições estressantes. Finalmente, nenhum treinamento é necessário para evocar o comportamento de explorar os objetos (para um exame mais aprofundado da NORT, ver ^ref.23).

Portanto, o registro simultâneo de múltiplas modalidades de dados e sua integração no estudo da aprendizagem e da memória, como efeito da neurogênese hipocampal do adulto, é altamente atraente e fornece uma solução atraente para os pesquisadores da área. O presente trabalho irá expor todos os processos envolvidos na avaliação simultânea de vídeo-rastreamento comportamental (nova tarefa de reconhecimento de objetos) e gravação eletroencefalográfica sem fio. Aqui revisamos o processo de fabricação de eletrodos, cirurgia de implante de eletrodos peridurais (parafuso craniano), protocolo de enriquecimento ambiental (para indução da neurogênese hipocampal), seguindo protocolo NORT, configuração BTS, acoplamento EEG – BTS para monitoramento simultâneo em tempo real, e EEG e análise de dados comportamentais executados em ambiente computacional MATLAB.

Todos os procedimentos seguem o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publications N°. 8023, revisado em 1978) implementado pelas Instituições Nacionais de Saúde e leis locais mexicanas para reduzir o número de animais usados para o bem-estar animal e proibição do sofrimento animal. O Comitê de Ética da Universidad Iberoamericana aprovou os protocolos experimentais para o uso de animais neste estudo.

1. Configuração geral

1. Instale o Software de Rastreamento Comportamental em um computador de acordo com as instruções de fabricação.
2. Monte a câmera diretamente acima do dispositivo, para que ela fique virada para baixo. A câmera deve estar conectada ao computador.
3. Instale o software do driver exigido pela câmera (seguindo as instruções de fabricação).
4. Se a câmera incluir lentes de zoom, ajuste-as para se encaixarem perfeitamente na tela da câmera.
5. Desative o modo de foco automático (AF) da câmera seguindo o software de fabricação.
6. Verifique se a câmera está funcionando corretamente em tempo real e teste o modo de captura de vídeo até que ele esteja pronto para uso.

2. Protocolo de enriquecimento ambiental (ver Figura 1)

NOTA: Ratos Wistar machos com três meses de idade foram utilizados para este experimento e mantidos sob condições naturais de luz escura.

1. Coloque a roupa de cama de serragem em uma arena quadrada de acrílico transparente (500 x 500 x 500 mm).
2. Coloque três tipos diferentes de brinquedos na arena para os roedores interagirem (por exemplo, rodas de atividade, deck duplo, escadas, etc.).
3. Adicione quatro tubos de PVC opacos cinza curvos de 2 polegadas e quatro curvados.
4. Fornecer dispensadores de comida e água com acesso ad libitum aos animais.
5. Coloque três roedores por gaiola dentro da sala do biotério em condições regulares.
6. Deixar os animais nesta arena pelo tempo necessário de acordo com o protocolo correspondente. Neste experimento, os animais devem permanecer dentro da arena por 20 dias.
   OBS: Após a cirurgia de implante do eletrodo, os animais não retornam ao tratamento de enriquecimento ambiental. Em vez disso, eles foram colocados em gaiolas individuais até que o novo teste de reconhecimento de objetos seja concluído.

3. Processo de fabricação de eletrodos

1. Corte um pedaço de fio de cobre a aproximadamente 2 cm e use uma lixa para esfregar aproximadamente 0,5 cm de cada extremidade.
2. Enrole uma extremidade do fio de cobre na cabeça de um parafuso de tamanho pequeno (eletrodos) e certifique-se de que ele esteja firmemente fixado, pois este é um passo crucial. O contato correto entre ambos os materiais deve ser garantido para evitar artefatos nos sinais do EEG.
3. Insira a outra extremidade na ponta do terminal do conector e certifique-se de que ela esteja corretamente fixada, reforçando com pinças finas. Essa dica deve ser conectada com um cabo amplificador.
4. Meça a condutividade adequada da ponta ao parafuso usando um multímetro. Este processo garante que a conexão do eletrodo seja instalada corretamente.

4. Cirurgia de implante de eletrodos peridural (parafuso craniano)

OBS: Após 20 dias do tratamento de enriquecimento ambiental, os animais serão submetidos à cirurgia seguindo o procedimento descrito abaixo:

1. Injetar um coquetel de cetamina/xilazina (90/10 mg/kg, i.p.) no animal.
   NOTA: Para evitar a obstrução das vias aéreas, espere até que o rato pare de se mover, em seguida, retire-o da gaiola de alojamento e coloque o animal em uma superfície plana. Injetar um anti-inflamatório não esteroidal (meloxicam 1 mg/kg, s.c.) e um antibiótico (enrofloxacina 2,5 mg/kg, p.o.) como analgesia preventiva.
2. Uma vez que o rato está totalmente anestesiado, raspe a área da cabeça do rato.
   NOTA: Certifique-se de que o animal está completamente anestesiado antes de continuar com a cirurgia. Aperte cuidadosamente uma das pernas ou a cauda. Se o animal reagir ao estímulo, aguarde mais alguns minutos e belisque-o novamente. Se o animal não reagir ao beliscão, vá para a próxima etapa. Se o equipamento necessário estiver disponível, o uso de anestesia gasosa (como o isoflurano) é altamente recomendado, pois é mais facilmente titulado para segurança.
3. Coloque o animal sobre o aparelho estereotáxico fixando as duas orelhas primeiro com as barras auriculares (cuidado para não machucar a orelha interna do animal). Finalmente, coloque os dentes da frente sobre a barra de mordida e prenda a barra do nariz.
   OBS: Forneça ao animal uma almofada de aquecimento para toda a cirurgia, pois a anestesia utilizada neste procedimento costuma causar hipotermia e problemas respiratórios.
4. Limpe a parte superior da área da cabeça usando três rodadas alternadas de clorexidina ou esfoliante à base de iodo, seguido de enxágue com soro fisiológico ou álcool.
5. Administrar lidocaína por via subcutânea (20 mg/mL) sob a pele da área da cabeça (0,5 mL).
6. Instilar uma gota de solução oftálmica ou soro fisiológico para os olhos de cada animal a cada 5-10 min para ajudá-los a não secar.
7. Com o uso de bisturi, faça uma incisão de aproximadamente 2 cm de anterior para posterior para expor adequadamente a região superior do crânio.
8. Retraia a pele usando grampos de buldogue e raspe o tecido que recobre o crânio.
9. Identificar e registrar as coordenadas de bregma obtidas.
10. Partindo de Bregma, utilizando os estereotáxicos Paxinos e Watson Atlas³⁰, localizamos e marcamos a posição de cada um dos sete pontos (coordenadas) onde os eletrodos serão fixados.
    OBS: Neste experimento, parafusos F3, F4 (+2,0 mm de Bregma, 2,25 mm laterais da linha média); Parafusos C3, C4 (−3,0mm de Bregma, 2,75mm lateral da linha média); e parafusos P3, P4 (−7,0 mm de Bregma, 2,75 mm lateral da linha média). Um sétimo parafuso foi localizado posteriormente ao osso nasal (NZ), como referência de terra (ver Figura 2).
11. Usando uma ferramenta de perfuração de velocidade variável, faça um furo com uma ponta tamanho 2 (comprimento 44,5 mm) em cada uma das marcas, tenha cuidado para não penetrar totalmente no crânio.
12. Insira o eletrodo no orifício e rosqueie-o no crânio cuidadosamente.
13. Repita os passos 4.10 e 4.11 até que todos os sete parafusos estejam fixados adequadamente.
14. Fixe todos os 7 parafusos com uma primeira camada de cimento dental. Insira cada eletrodo em um conector. Cubra totalmente os fios com uma segunda camada de cimento dental (evitará que o animal puxe parafusos) e a parte inferior do conector. Se necessário, cubra com uma terceira camada de cimento dental, deixando o conector de EEG limpo para uma conexão adequada, de modo que o dispositivo de EEG possa ser conectado adequadamente (ver Figura 3).
    OBS: Após a colocação de cada par de parafusos bilaterais, estes poderão ser fixados com cimento dental (passo opcional).
15. Deixe o rato em cuidados pós-operatórios durante a noite. Observe o animal e forneça ao animal uma almofada de aquecimento por 1-2 h após a cirurgia, já que a anestesia usada neste procedimento geralmente causa hipotermia e problemas respiratórios.
16. Administrar 50mL/kg/24h (dose de manutenção) de soro fisiológico por via subcutânea para evitar desidratação. Injetar um anti-inflamatório não esteroidal (meloxicam 2 mg/kg, s.c.) e um antibiótico (enrofloxacina 5 mg/kg, p.o.) após a cirurgia e pelas próximas 24 h.
17. Após a cirurgia, manter os ratos em gaiolas únicas para recuperação total durante sete dias antes da realização dos testes comportamentais.
18. Manipule suavemente o animal periodicamente (pelo menos uma vez por dia) para ajudar a reduzir o estresse em manipulações futuras. Ao segurar o rato com uma mão, a pressão dos dedos é suavemente aplicada na parte de trás do animal, deslizando os dedos através do pelo. Verifique o ferimento na cabeça, estado de saúde, comportamento em geral e peso corporal por um período de uma semana após a cirurgia.
    OBS: Caso seja constatada alguma anormalidade ou sinal de doença/estresse no animal, avise o médico veterinário responsável. Após esse período, realizar o teste de reconhecimento de objetos Novel e a técnica de registro de EEG.

5. Teste de reconhecimento de novos objetos (NORT)

OBS: Sete dias após a cirurgia, proceder aos testes comportamentais. Todos os procedimentos comportamentais, no experimento apresentado, foram realizados entre as 14h00min e 16h00min, o que corresponde ao ciclo de luz do rato.

1. Coloque um colete de tecido macio (ao qual o aparelho de EEG seria colocado durante o teste comportamental) no rato. Permitir a habituação por 2-3 dias antes de realizar o teste comportamental.
2. Coloque uma arena quadrada de acrílico preto (500 x 500 x 500 mm) em uma sala de gravação iluminada com pouca luz.
3. Fixe dois objetos novos idênticos no centro do chão da arena usando fita dupla face (para evitar seu deslocamento pelos animais). Os objetos devem estar equidistantes entre si e das paredes da arena.
4. Limpe bem cada objeto antes com 50% de etanol, bem como o piso da arena após cada ensaio (para evitar pistas olfativas).
   OBS: Transfira sempre os animais para as salas de alojamento (da sala do biotério para a sala experimental) pelo menos meia hora antes do início de cada sessão. Após o término da sessão de gravação, deixar os animais na sala experimental por mais uma hora. Isso é para evitar o estresse que poderia afetar o desempenho deste teste.
5. Conecte o aparelho de EEG antes de iniciar cada teste. Segure suavemente o animal e insira firmemente o cabo no conector na cabeça do animal com o kit de EEG preso ao dorso do animal (ver Figura 4). Apenas uma vaga é permitida.
   NOTA: A manipulação prévia suave do animal pode ajudar a reduzir o estresse nos animais durante o procedimento de conexão. Caso contrário, o risco de danos ao dispositivo ou aos animais aumenta. Pré-carregue totalmente a bateria do dispositivo usando uma porta USB.
6. Novas fases de testes de reconhecimento de objetos
   1. Habituação: Manipular o animal em intervalos de 5 min por dois dias consecutivos e, logo após, colocar o animal na arena (sem nenhum objeto) e deixá-lo explorar por 10 min livremente.
      NOTA: Antes de realizar qualquer sessão de teste de aquisição e memória, os ratos foram cuidadosamente manuseados e conectados ao aparelho de EEG correspondente, que foi devidamente fixado antes de iniciar o teste.
   2. Sessão de Aquisição: Coloque o animal na arena de frente para uma das paredes opostas aos objetos. Permita que os animais explorem livremente por 10 min. Vá para a etapa 6.13 para gravação de teste usando o Software de Rastreamento Comportamental.
      NOTA: Certifique-se de que o dispositivo de EEG segura corretamente o colete preso à parte de trás do rato (para garantir o rastreamento adequado do animal). Para reforço adicional, use fita adesiva.
   3. Teste de memória de curto prazo (SMT): substitua um dos objetos por qualquer outro completamente diferente em forma, cor e textura. Coloque o animal, 2 h após a sessão de aquisição, na arena de frente para uma das paredes opostas aos objetos. Deixe o animal explorar livremente por 10 min. Vá para a etapa 6.13 para gravação de teste usando o Software de Rastreamento Comportamental.
   4. Teste de memória de longo prazo (LMT): substitua o objeto usado por qualquer outro completamente diferente em forma, cor e textura do teste de memória de curto prazo. Coloque o animal 24 h após a sessão de aquisição, na arena de frente para uma das paredes opostas aos objetos. Permita que o animal explore livremente por 10 min Vá para a etapa 6.13 para gravação de teste usando o Software de Rastreamento Comportamental.

6. Configuração do software de rastreamento comportamental

1. Abra o Software de Rastreamento Comportamental.
2. Faça login na conta usando o usuário e a senha da instituição.
3. Abra o toque em "Novo experimento vazio" e escolha um nome para o protocolo (por exemplo, "NORT").
4. Selecione "Modo de rastreamento de vídeo".
   Observação : neste experimento, a câmera é configurada para transmitir o rastreamento de vídeo ao vivo. No entanto, há uma opção adicional para selecionar vídeos pré-gravados.
5. Vá para "Aparelho". Defina a área da arena, ajustando o retângulo laranja aos limites da arena projetada. Determine a região do objeto, ajustando os círculos laranjas na borda dos objetos dentro da arena projetada a partir da câmera na tela.
6. Configure a linha da régua de movimentação da escala para uma posição ao longo do comprimento conhecido da imagem (a arena). Digite o comprimento do objeto em milímetros na opção "O comprimento da linha da régua é" no painel Configurações. Neste caso, a arena mede 500 x 500 mm.
7. Vá para "Rastreamento e comportamento". Continue para "Zonas". Clique no menu "Adicionar item" e selecione "Nova zona". Selecione a área da arena e nomeie a nova zona (por exemplo, "Campo").
8. Repita a etapa anterior com a área dos objetos e nomeie a nova zona (por exemplo, "Objetos").
9. Vá em "Cor do animal" e selecione a opção "Os animais são mais claros que o fundo do aparelho".
   NOTA: Ratos brancos (Wistar) foram utilizados para este experimento. No entanto, o software tem opções adicionais para pesquisadores que usam ratos pretos e manchados. Ambas as raças de animais podem ser usadas no mesmo experimento.
10. Vá em "Rastreando a cabeça e a cauda do animal" e selecione "Sim, quero que a cabeça e a cauda do animal sejam rastreadas".
11. Ir para "Testes" | "Estágios" e, no menu "Adicionar item", selecione "Novo estágio". Nomeie o novo estágio, "Aquisição". Defina a duração do estágio (por exemplo, 600 s).
12. Repita a etapa anterior dos estágios "Teste de memória de curto prazo" e "Teste de memória de longo prazo".
    OBS: Neste protocolo, todas as etapas têm a mesma duração (10 min).
13. Vá em "Procedimentos". Defina os eventos a serem rastreados para cada estágio (aquisição, teste de memória de curto prazo e teste de memória de longo prazo).
14. Iniciar o teste (com cada animal). Vá em "Testes" (na barra de menu superior) e selecione "Adicionar um teste (+)". Atribua um número para o animal a ser testado (por exemplo, "1").
15. Selecione "Gravar" e nomeie os animais e a sessão (por exemplo, "M1 Acq").
16. Antes de colocar o animal na arena, clique uma vez no botão "Play". Uma mensagem "aguardando para iniciar" será exibida.
17. Após colocar o animal na arena, clique uma segunda vez no botão "Play". O teste começará e terminará automaticamente.
18. Repita os passos 6.13-6.16 para o teste de memória de curto prazo (2 h após a sessão de aquisição) e o teste de memória de longo prazo (24 h após a sessão de aquisição).

7. Configuração do dispositivo de eletrofisiologia sem fio

1. Conecte o modem a um host de PC e ligue-o. Desligue qualquer outro dispositivo de rede no PC. De preferência, silencie qualquer outra comunicação sem fio na sala de registro, como Bluetooth, telefones celulares, outros modems ou até mesmo aparelhos sem fio.
2. Conecte o amplificador às costas do rato, conforme mencionado no passo 5.5.
3. Ligue o dispositivo de EEG conectando a bateria.
   NOTA: 2 s depois de conectar o dispositivo, um led vermelho no amplificador de EEG piscará, indicando que a comunicação com o modem está ativa e, em seguida, o led verde será ligado. Se a comunicação for bem-sucedida, os LEDs no modem começarão a piscar continuamente. O amplificador agora está pronto para enviar informações para o modem.
4. Inicie o software de EEG e configure-o de acordo com as instruções do fabricante para integrar ao dispositivo de aquisição de EEG sem fio
5. Pressione o botão "Start Display". O software de EEG exibirá a aquisição real do sinal.
   Observação : use "Gerenciador de tarefas do Windows" para atribuir o modo de prioridade "em tempo real" para evitar informações ausentes durante a experimentação.

8. Registro do sinal de eletroencefalografia (EEG)

1. Depois de verificar se o software de EEG está adquirindo dados, inicie o software de Rastreamento Comportamental e defina um protocolo experimental para verificar se o animal está na zona de observação e se a configuração está funcionando corretamente.
2. Neste ponto, inicie a gravação do software de EEG pressionando o botão "Start Record". Depois de verificar se o sinal de aquisição está em execução, inicie a experimentação no BTS.
3. Após o término do experimento, retorne ao software de EEG e interrompa o processo de gravação. A gravação será salva usando um nome padrão que consiste na data da gravação usando o seguinte formato: "aaaa-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx". Por padrão, todas as gravações são salvas na pasta do software EEG (NeurophysData).
4. Verifique se ambos os arquivos de dados foram criados. Registre o registro do experimento ou altere o nome para evitar confusão.

9. Tarefa comportamental e sincronização do sinal de EEG

1. Abra o MATLAB e execute o comando: convert_plx2mat. Essa função abrirá uma caixa do navegador. As funções de conversão são fornecidas pelo fabricante e devem ser adicionadas ao caminho do MATLAB.
2. Selecione o *.plx para converter e pressione "Enter" na linha de comando do MATLAB para convertê-lo em parâmetros padrão.
3. Abra o arquivo de experimentação do BTS e vá em "Protocolo". Clique na opção "Resultados, relatórios e dados" selecione todos os eventos de ambos os objetos e clique em "Escolher o formato de tempo para o relatório", selecione a terceira opção: "Mostrar horários de eventos como tempo real em HH:MM:SS.sss - por exemplo 13:20:14.791."
4. Agora vá em "Arquivo" e clique em "Exportar" e "Exportar experimento como XML", marque "Data e hora do teste", por fim clique em "Criar XML".
5. Vá em "Exportar dados de teste" e clique em "Salvar dados". Um arquivo .csv com horários de eventos será criado.
6. Repita as etapas 9.1 a 9.5 para cada arquivo. No nosso caso, os três experimentos foram: ACQ, STM e LTM.
7. Depois que os arquivos de EEG e comportamento forem convertidos, colete-os em uma única pasta. A pasta deve ter seis arquivos, os três arquivos .mat e três .csv, respectivamente. No nosso caso, os arquivos foram chamados: PID_01_ACQ_N.mat, PID_02_STM_N.mat, PID_03_LTM_N.mat, PID_01_ACQ_M.csv, PID_02_STM_M.csv e PID_03_LTM_M.csv. ID refere-se ao número de identificação de um animal.
8. Abra a função "procesa_sujeto.m" usando o MATLAB e ajuste a segunda linha para o ID do animal.
9. Agora mova o MATLAB para essa pasta e execute: "procesa_sujeto" para criar figuras de banda relativa alfa e beta à potência associada ao reconhecimento de objetos nos estágios ACQ, STM e LTM.
   NOTA: "procesa_sujeto" é uma função que executa/executa várias análises de processamento de sinais. Essas análises estão resumidas a seguir nas etapas 9.10 a 9.15.
10. Filtre cada sinal de EEG com um filtro passa-banda Butterworth de 4ª ordem a [5-40] Hz, usando correção de fase.
11. Inspecione visualmente os sinais antes da análise a seguir, e os canais com artefatos derivados da colocação de eletrodos defeituosos ou desajuste por movimentos de animais foram excluídos da análise posterior.
12. Sinais de referência para média comum para aliviar artefatos de movimento.
13. Segmentar sinais de EEG para formar épocas de 4 s de comprimento sincronizado por carimbos de data/hora derivados de BTS. Os eventos-alvo foram a exploração do objeto marcada pela distância do animal à borda dos objetos. Esses eventos são marcados nos carimbos de data/hora do BTS e foram usados como identificadores para corrigir as posições das janelas. Assim, as épocas do EEG são delimitadas por 1 s antes do início da exploração até 3 s depois. Até o momento, não foi utilizada nenhuma validação sobre o comprimento de exploração, mas será considerada para pesquisas futuras.
14. Estimar a densidade de potência espectral nessas épocas usando o método do periodograma de Welch usando o comprimento da janela de 1 s, uma sobreposição de 90%, janela de Hanning antes da estimativa da transformada de Fourier, com esses parâmetros uma resolução de 1 Hz foi obtida.
15. Avalie-se a potência espectral em cada banda avaliando-se a área sob o periodograma, sendo que os valores apresentados correspondem à energia relativa, isto significa que a energia de cada banda de EEG foi dividida pela energia total da época. Esse procedimento também reduz estimativas errôneas devido a artefatos nos sinais do EEG.

Os métodos descritos acima foram aplicados para registrar EEG e atividade de ratos simultaneamente após o tratamento de enriquecimento ambiental. Ratos Wistar, machos com três meses de idade, foram submetidos a um protocolo de tratamento de enriquecimento ambiental de médio prazo por 20 dias e operados para fixação de seis eletrodos de parafuso craniano pareados nas regiões frontal, central e parietal referenciados a um sétimo eletrodo localizado na NZ. Os animais foram mantidos sob condições naturais de luz escura, com acesso ad libitum a ração e água. Este trabalho mostra a integração entre o sistema de EEG e o software de rastreamento comportamental para uma gravação simultânea ao vivo. Utilizamos apenas animais tratados sob protocolo de EE, pois não temos a pretensão de comparar a efetividade do tratamento, mas apenas exemplificar as vantagens do equipamento. Como evidência de que o protocolo de alojamento de enriquecimento ambiental de 20 dias utilizado estimula a neurogênese adulta, apresentamos dados de contagem de células BrdU positivos de animais sob EE e animais alojados em condições padrão a partir de dados não publicados de nosso laboratório. Foram utilizados ratos Wistar machos com três meses de idade. Eles foram injetados três vezes com BrdU com 12 h entre si. Os animais foram anestesiados (pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) e eutanasiados por perfusão transcárdica (ver Figura 5). Para garantir que o colete acoplado ao aparelho de EEG não limitasse os movimentos dos animais, realizamos o teste de campo aberto (TFO) em dois grupos, um grupo foi submetido à cirurgia durante o uso do equipamento (colete e amplificador de EEG) e o outro grupo de animais permaneceu intacto sem usar o equipamento. Não foram encontradas diferenças significativas na distância percorrida pelos animais em 10 min de teste (ver Figura 5). O protocolo NORT típico consiste na apresentação de dois objetos e na substituição de um deles por um novo objeto. O software de rastreamento comportamental monitorou o tempo de exploração.

O Software de Rastreamento Comportamental registrou um grupo de animais para avaliar seus principais parâmetros de desempenho. Portanto, foram utilizados três parâmetros para avaliar o desempenho exploratório. A razão de preferência foi calculada usando o tempo de cabeça dos animais na zona do objeto, que relata o tempo total que a cabeça dos animais passou em cada objeto. Além disso, calculamos uma razão de preferência para o tempo gasto movendo-se em direção aos objetos, que mostra a quantidade total de tempo gasto em cada animal que estava se movendo em direção a cada zona do objeto. Além disso, foi calculado o tempo gasto por visita a cada objeto. A Figura 6 mostra os resultados dos três parâmetros mencionados acima. Na tentativa de aquisição, não houve distinção entre os objetos nos três parâmetros avaliados: tempo de cabeça na zona do objeto para as três tentativas, tempo de movimento em direção aos objetos para as três tentativas e tempo por visita em cada objeto. Não houve diferenças no estudo STM. Enquanto isso, no ensaio LTM, uma razão preferencial de exploração significativamente maior para o novo objeto foi observada. Além disso, no estudo LTM, também foi possível observar uma preferência pelo objeto novo no tempo gasto por visita (painel C). O Vídeo 1 mostra um exemplo representativo de um rato registrado no experimento, enquanto o Vídeo 2 mostra um exemplo representativo de EEG e registro comportamental simultâneos.

Foi possível combinar os eventos de tempo rastreados com o rastreamento comportamental e o registro do software EEG usando o relógio do computador. A Figura 7 e a Figura 8 mostram as mudanças na potência relativa do EEG sobre as bandas alfa e beta. Estes estão relacionados ao controle motor, concentração e memória, sugerindo que a exploração está apenas relacionada a essas funções. Os resultados do animal 3 mostram que a potência alfa tende a diminuir no STM em relação ao ACQ e LTM, sugerindo uma dessincronização relacionada à exploração ou recuperação da memória. O número de reconhecimento de objetos (épocas processadas) foi baixo. A essa altura, não é possível determinar se um teste estatístico validaria se tal diferença é real, ou se um artefato foi capaz de produzir tais condições experimentais. No entanto, a segmentação, rotulagem e análise de épocas tornaram-se possíveis por uma linha do tempo de eventos de marcação simultânea em animais e resultados de EEG produzidos para futuros projetos de pesquisa. A combinação desses sistemas evita a identificação errônea de eventos por um processo de marcação manual, o que se tornou um problema significativo para fins de experimentação animal. A combinação da SBT com a atividade eletrofisiológica (PE) pode ser associada com precisão ao comportamento animal; No entanto, as condições experimentais requerem o uso de técnicas avançadas de processamento de sinais para eliminar artefatos de movimento e fazer melhorias na configuração experimental de forma eficaz.

Figura 1: Exemplos de ambiente enriquecido (EE) condições gaiola. O alojamento foi fornecido com brinquedos e tubos, nos quais os animais encontram novos e complexos, mas sem relevância biológica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Posição dos eletrodos peridurais no crânio de ratos. Os parafusos foram utilizados simultaneamente como âncora para o fone de ouvido e como eletrodos. F = frontal; C = frontoparietal; P = parietal; 3 = esquerda; 4 = direita; NZ = como referência de base. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens representativas de uma cirurgia de implante de eletrodos peridural (parafuso craniano). Imagem mostrando parafusos de eletrodos intracranianos implantados em ratos em diferentes fases da cirurgia. Certifique-se de que as técnicas assépticas sejam seguidas durante a realização deste procedimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens representativas de um rato juntamente com o arranjo experimental. O rato foi confeccionado para usar o colete acoplado ao aparelho de EEG com uma bateria embutida, dentro da arena utilizada para o protocolo NORT. A imagem mostra o fone de ouvido e o conector do cabo instalados no rato da cabeça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Evidência de capacidade de movimento e estimulação da neurogênese do adulto pelo protocolo de EE. (A) Imagens representativas da atividade animal por 10 min no Teste de Campo Aberto (TFO) e a distância média percorrida pelos animais que usaram o equipamento/cirurgia e animais sem o equipamento/sem cirurgia. (B-E) Seção DG representativa com células marcadas com BrdU (escuro intenso) para EE e grupos de alojamento padrão. Os painéis B e D mostram uma baixa ampliação do GD, e os painéis C e E mostram a área da caixa em maior ampliação. Os painéis B e C são tecidos do grupo de habitação EE, os painéis D e E são do grupo de habitação padrão. O inset ilustra o número médio de células marcadas em ambos os grupos. ML - camada molecular; GCL – camada de células granulares; SGZ – zona subgranular; setas - células BrdU+. Os gráficos mostram a média ± EPM. O teste T-student foi utilizado para comparar os grupos. * pág≤0,05. Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos no Teste de Campo Livre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Desempenho exploratório na avaliação da NORT. (A) Tempo de cabeça na zona objeto para as três tentativas. (B) Tempo se movendo em direção aos objetos para as três tentativas. (C) Tempo por visita em cada objeto. Os gráficos mostram a média ± EPM. A ANOVA de medidas repetidas two-way com o teste de comparações múltiplas de Sidak foi usada em todos os parâmetros. * p≤0,05, ** p≤0,01 entre os objetos no respectivo julgamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Alterações na potência da banda alfa do EEG associadas à exploração. Esta figura mostra mudanças na potência alfa relativa, de meio segundo para 2,5 após o animal iniciar a exploração dos objetos. Os seis gráficos corresponderam aos eletrodos Frontal, Central e Parietal (de cima para baixo) e lados esquerdo e direito. Boxplots mostram a distribuição de tais séries temporais para cada combinação de condição de um Objeto: "Familiar" e "Novel", e estágio: "ACQ", "STM" e "LTM". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Alterações na potência da banda beta do EEG associadas à exploração. Esta figura mostra mudanças na potência beta relativa, de meio segundo para 2,5 depois que o animal começa a exploração dos objetos. Os seis gráficos corresponderam aos eletrodos Frontal, Central e Parietal (de cima para baixo) e lados esquerdo e direito. Boxplots mostram a distribuição de tais séries temporais para cada combinação de condição de um Objeto: "Familiar" e "Novel", e estágio: "ACQ", "STM" e "LTM". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Vídeo representativo mostrando um rato gravado no experimento. O rato estava dentro da arena utilizada para o protocolo NORT. O rato usava o colete acoplado ao aparelho de EEG com uma bateria embutida. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Vídeo representativo mostrando EEG simultâneo e gravação comportamental. O sinal do EEG foi exibido no lado esquerdo enquanto o teste comportamental (NORT) foi exibido no lado direito do vídeo. Clique aqui para baixar este vídeo.

A Dra. Sylvia Ortega-Martinez trabalha como funcionária da Stoelting Co., uma empresa que forneceu e patrocinou a produção e o acesso aberto a este artigo.