Os exossomos são liberados após a aplicação in vitro de ondas de choque. Aqui, descrevemos como aplicar ondas de choque em células endoteliais cultivadas e, posteriormente, isolar exossomos para investigação posterior.
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Artigo de método
Os exossomos são liberados após a aplicação in vitro de ondas de choque. Aqui, descrevemos como aplicar ondas de choque em células endoteliais cultivadas e, posteriormente, isolar exossomos para investigação posterior.
A terapia por ondas de choque é aplicada rotineiramente em indicações ortopédicas, incluindo tendinopatias, como epicondilite lateral (cotovelo de tenista) e tendinite de Aquiles (esporão do calcanhar), bem como feridas e ossos que não cicatrizam. Apesar das diferentes patologias, a combinação de um efeito angiogênico e antiinflamatório da terapia por ondas de choque leva à regeneração dos tecidos moles e dos ossos. Em mais de 30 anos de aplicação clínica, não foram observados efeitos colaterais. Além disso, a pesquisa básica revelou efeitos regenerativos no miocárdio isquêmico.
Em um trabalho anterior, pudemos mostrar que o estímulo mecânico de células cultivadas é traduzido por meio de uma liberação de exossomos em uma resposta biológica. No entanto, o mecanismo exato ainda precisa ser elucidado. O acoplamento mecânico é crucial ao aplicar a terapia por ondas de choque, pois mesmo pequenas bolhas de ar podem absorver as ondas de choque. O método do banho-maria descrito anteriormente é um método válido para garantir a aplicação adequada e reprodutível de ondas de choque in vitro.
Conseguimos desenvolver um protocolo viável e replicável para isolar exossomos de células cultivadas após aplicação de ondas de choque. Assim, demonstramos a possibilidade de estudar os mecanismos subjacentes da mecanotransdução, bem como o potencial regenerativo e angiogênico dos exossomos liberados por ondas de choque.
As ondas de choque (SW) são ondas de pressão sonora que aparecem na natureza quando uma grande quantidade de energia é liberada em um curto período de tempo (por exemplo, trovões com raios). Na rotina clínica, as ondas de choque são utilizadas na litotripsia para desintegrar cálculos renais sem efeitos colaterais relevantes há mais de 30 anos 1,2. Por incidente, um espessamento do osso ilíaco foi observado em raios-X após a desintegração da pedra nos rins. Essa observação forneceu a base para pesquisas em distúrbios de cicatrização óssea e levou ao tratamento de não consolidaç....
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As células endoteliais da veia umbilical humana foram obtidas de cesarianas no Departamento de Ginecologia. Portanto, foi obtido o consentimento informado por escrito dos pacientes. A permissão foi dada pelo comitê de ética da Universidade Médica de Innsbruck (no. UN4435).
NOTA: Trabalhe sob uma capela de fluxo laminar estéril para evitar contaminação.
1. 24 h antes do experimento
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Usando o protocolo descrito, submetemos células endoteliais humanas (HUVECs), bem como células endoteliais da artéria coronária humana (CAECs; PromoCell) à terapia por ondas de choque (por exemplo, Orthowave 180c). As vesículas liberadas foram quantificadas por meio de análise de rastreamento nano (NTA). Dessa forma, pudemos observar um aumento na liberação de microvesículas após a terapia SW (Figura 1A,B). A imagem das vesículas liberadas por HUVECs por microscopia eletrôni.......
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Em vários trabalhos de pesquisa básica, o efeito regenerativo da terapia por ondas de choque pôde ser demonstrado e é aplicado rotineiramente em indicações ortopédicas 3,4,5. Em diversos modelos animais, o efeito regenerativo sobre o miocárdio isquêmico pôde ser demonstrado e levar ao início do estudo CAST-HF 9,10. Este estudo controlado.......
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A JH e a MG são acionistas da Heart Regeneration Technologies GmbH, uma spin-off da Universidade Médica de Innsbruck com o objetivo de promover a terapia por ondas de choque cardíaco (www.heart-regeneration.com). Todos os outros autores não têm nada a divulgar.
Este estudo foi apoiado por uma bolsa de pesquisa AUVA irrestrita para JH e CGT.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Frascos de cultura de células | Celular& | nbsp; 658170 | 75 cm2 |
| Tubos de coleta – Tubo Falcon | Corning | 352070 | |
| Meio de Crescimento de Células Endoteliais-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Crescimento de Células Endoteliais Basal Medium | Lonza | CC-3121 | |
| Soro fetal bovino | Sigma | F0804 | |
| Parafilme | Pechiney | PM996 | |
| Fosfato tamponado com solução salina | gibco | 14190-904 | |
| Aplicador de ondas de choque | MTS | Orthowave 180c |
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