Detecção a olho nu de mutações pontuais raras no DNA

Resumo

Este protocolo permite a identificação a olho nu de DNA com mutação pontual em um excesso de 200 vezes de moléculas de DNA do tipo selvagem, explorando nanopartículas de ouro e micropartículas paramagnéticas.

Resumo

O protocolo descreve um teste colorimétrico a olho nu para a detecção de mutações pontuais somáticas em excesso de DNA do tipo selvagem. A aplicação futura prevista do método é a identificação de mutações raras no DNA livre de células circulantes de biópsias líquidas, com relevância no diagnóstico de câncer e estratificação de pacientes oncológicos para terapia personalizada. Como prova de conceito, o teste foi projetado para detectar a mutação BRAF^V600E no gene BRAF, o que é importante para identificar o subgrupo de pacientes com melanoma que podem se beneficiar de terapias direcionadas com inibidores de BRAF. No entanto, este teste colorimétrico pode ser facilmente generalizado para outras mutações somáticas de relevância clínica devido ao uso de sondas de detecção universais, proporcionando assim um forte potencial no diagnóstico oncológico.

O teste detecta 0,5% de BRAF^V600E em excesso de DNA BRAF^WT , que corresponde à sensibilidade de alguns ensaios instrumentais comerciais. Essa sensibilidade é clinicamente relevante para fins diagnósticos, permitindo a identificação precoce de pacientes sensíveis a medicamentos. Em contraste com os ensaios comerciais baseados em PCR em tempo real, este teste requer instrumentação e processamento mínimos, pois pode ser realizado em DNA amplificado com uma PCR padrão (ou técnicas isotérmicas) e fornece uma leitura a olho nu com uma reação de um tubo de algumas etapas em apenas uma hora. Atualmente, o teste tem sido usado apenas em amostras de DNA sintético. No entanto, estes últimos foram projetados para imitar uma amostra real amplificada a partir de DNA livre de células circulantes, para favorecer a tradução do teste para o diagnóstico clínico.

Introdução

O objetivo do método é detectar mutações pontuais sub-representadas em uma amostra de DNA com uma metodologia minimamente instrumentada e uma leitura a olho nu. O objetivo final é ter um ensaio de prova de princípio, adequado para futuras aplicações em testes rápidos para a detecção de mutações somáticas no DNA livre de células circulantes (ccf-DNA) (por exemplo, a partir de amostras de biópsia de sangue) para o diagnóstico precoce e monitoramento do câncer¹. As mutações somáticas relacionadas ao câncer representam um importante biomarcador de câncer² e estão presentes em uma fração menor (mas muito variável)³ do ccf-DNA, tornando sua identificação^{desafiadora 4}. Escolhemos, como alvo modelo, a mutação oncogênica BRAF^V600E que causa a ativação constitutiva da quinase BRAF. Essa mutação está presente em 80% de todos os cânceres com mutação BRAF⁵ e geralmente é representada em apenas <1% do DNA tumoral circulante⁶. A identificação de pacientes portadores dessa mutação é importante, pois é preditiva da resposta terapêutica aos inibidores de BRAF. Portanto, vários métodos 7,8,9,10 para avaliar o status da mutação BRAF foram desenvolvidos, com sensibilidades variando de 0,01% a 2%.

A principal vantagem deste método em relação aos métodos de última geração é que sua detecção é livre de instrumentos (olho nu), ao contrário da detecção instrumental de moléculas fluorescentes por PCR em tempo real. Outra vantagem é sua eficiência em discriminar uma única molécula de DNA mutada em um excesso de 200 moléculas de DNA do tipo selvagem. Esse fator de discriminação de 0,5% é superior¹¹ ou corresponde¹² ao de alguns kits laboratoriais ou comercialmente disponíveis, com base em uma detecção instrumental e, portanto, é relevante para aplicações diagnósticas clínicas. Por outro lado, como um teste de protótipo de laboratório, o método depende do controle manual de etapas sensíveis à temperatura. No entanto, o número de etapas e a duração total do ensaio são limitados, tornando concebível sua futura implementação em sistemas microfluídicos automatizados.

Este método de prova de conceito foi desenvolvido usando moléculas sintéticas de DNA. Para sua tradução eficiente para as clínicas, deve ser validado usando amostras do mundo real amplificadas a partir de biópsias de sangue dos pacientes. Observamos que o futuro campo de aplicação do método não se destina a ser a análise direta de matrizes biológicas complexas não processadas, como fluidos corporais. A partir deste último, o DNA precisa ser extraído com metodologias padrão e, em seguida, amplificado e purificado. Consequentemente, a matéria-prima para a análise será sempre ADN purificado e amplificado, que é razoavelmente comparável, em termos de possíveis substâncias interferentes, a uma amostra de ADN sintético, como a utilizada para o desenvolvimento deste método.

Protocolo

1. Síntese de sondas de nanopartículas de ouro

1. Sintetize nanopartículas de ouro tampadas com citrato de 40 nm, usando o método de crescimento de semeadura padrão de duas etapas, conforme detalhado abaixo.
   1. Sintetizar nanopartículas de ouro recobertas com citrato de 15 nm (sementes AuNPs) usando o método clássico de Turkevich-Frens^13,14.
      1. Lave todos os copos com água régia (HCl:HNO₃ na proporção de 3:1 v/v).
      2. Aqueça 250 mL de 0,25 mM HAuCl₄ para ferver, mexendo uniformemente.
         CUIDADO: HAuCl₄ é corrosivo e tóxico.
      3. Adicione imediatamente 25 mL de 38,8 mM de_Na-3∙citrato.
      4. Continue fervendo e mexendo por 30 min, enquanto a solução fica com uma cor rubi vermelha.
      5. Retire a solução do fogo e deixe esfriar até a temperatura ambiente, mexendo sempre.
      6. Filtrar com filtros de seringa de membrana de PTFE de 0,22 μm.
      7. Conservar a 4 °C num frasco de vidro.
         NOTA: O experimento pode ser pausado aqui.
   2. Sintetize nanopartículas de ouro cobertas com citrato de 40 nm (AuNPs de 40 nm) por meio da semeadura do crescimento¹⁵.
      1. Prepare a solução A: 390 μL de sulfato de hidroxilamina 0,1 M recém-preparado com 13 mL de sementes de AuNP em um volume total de 120 mL em H₂O.
         NOTA: A quantidade de sementes AuNPs necessárias para obter o tamanho desejado pode variar; deve ser titulado para cada novo estoque de sementes AuNPs.
         CUIDADO: O sulfato de hidroxilamina é corrosivo, tóxico, mutagênico e perigoso para o meio ambiente. Para manuseio: Lave bem após o manuseio. Remova as roupas contaminadas e lave antes de reutilizá-las. Use com ventilação adequada. Minimize a geração e o acúmulo de poeira. Evite o contato com os olhos, pele e roupas. Mantenha o recipiente bem fechado. Evite respirar poeira. Não use com espátula de metal ou outros itens de metal. Para armazenamento: Armazene em um recipiente bem fechado. Armazene em local fresco, seco e bem ventilado, longe de substâncias incompatíveis. Mantenha longe de metais.
      2. Prepare a solução B: 12,25 mL de H₂O + 0,25 mL de HAuCl 0,1 M₄.
      3. Carregue a solução B em uma seringa e coloque a seringa em uma bomba de seringa.
      4. Defina os parâmetros da bomba da seringa: diâmetro da seringa em mm; vazão: 90 mL/h; volume total: 10,80 mL (dos quais, 0,8 mL são o excesso necessário para o equilíbrio do sistema, ou seja, enchimento do tubo).
      5. Ligue a bomba de seringa. Depois que os 0,8 mL iniciais da solução B tiverem enchido o tubo e caído em um recipiente de resíduos, posicione o tubo em cima do frasco de reação contendo a solução A (mantida sob agitação moderada e uniforme) e deixe a solução B entrar gota a gota.
      6. Tampe adicionando 2,65 mL de 0,1 M Na₃∙citrato recém-preparado e mexa por 5 min.
      7. Concentrar as AuNPs de 40 nm obtidas centrifugando a 2.460 x g por 18 min a 10 °C.
      8. Remova o sobrenadante aspirando suavemente. Ressuspender suavemente no volume residual.
      9. Conservar a 4 °C.
         NOTA: O experimento pode ser pausado aqui.
2. Funcionalize nanopartículas de ouro tampadas com citrato de 40 nm por química padrão de tiol¹⁶.
   1. Digerir a ligação dissulfeto incubando oligonucleotídeos de sonda tiolada (5 ′ T (30) - (O-CH_{2-CH 2}) _3-SH 3 ′) com 10 mM Tris (2-carboxyethil) fosfina (TCEP) à temperatura ambiente por 3 h sob agitação leve (400 rpm).
   2. Incubar um grande excesso dos oligonucleotídeos digeridos durante a noite com AuNPs 10 nM, à temperatura ambiente sob agitação suave (400 rpm).
   3. Leve a mistura AuNPs-DNA a 0,3 M NaCl em tampão fosfato 10 mM, pH 7,4, 0,01% SDS, adicionando sal gradualmente durante um período de 10 h, sob agitação suave (400 rpm).
   4. Incubar durante a noite à temperatura ambiente sob agitação suave (400 rpm).
   5. Lave os AuNPs conjugados com DNA 3 vezes com NaCl 0,25 M em tampão fosfato 10 mM mais SDS 0,01%, para remover o excesso de oligonucleotídeos não ligados.
   6. Conservar as sondas universais obtidas a 4 °C até à utilização.
      NOTA: O experimento pode ser pausado aqui.
   7. Determine a densidade das sondas de DNA nas AuNPs usando um ensaio comercial baseado em fluorescência
   8. Meça a concentração de AuNPs por espectroscopia UV-vis. Para derivar a concentração de AuNPs a partir dos dados de absorbância, a Lei de Lambert & Beer (A = εbc) e os coeficientes de extinção publicados para AuNPs¹⁶ de 40 nm podem ser usados.
   9. Caracterize as sondas AuNPs por espalhamento dinâmico de luz (DLS) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
      NOTA: O experimento pode ser pausado aqui.

2. Discriminação colorimétrica da mutação rara BRAF^V600E

1. Preparar amostras-alvo para análise: misturas de DNA sintético de BRAF^V600E e DNA BRAF^WT em diferentes proporções (BRAF^V600E: BRAF^WT 1:10, 1:100, 1:200, BRAF^V600E 100%, BRAF^wt 100%).
2. Equilibre as micropartículas paramagnéticas lavando-as duas vezes com tampão de hibridização (HB) (1x PBS pH 7,4, 5% p / v PEG 600) e ressuspenda-as em um volume de HB igual ao volume inicial. Para lavar, colocar uma alíquota de micropartículas paramagnéticas num tubo de 1,5 ml (máximo de 50 μL/tubo), adicionar 500 μL de HB e misturar três vezes pipetando suavemente, aplicar o íman, separar o sobrenadante transparente, adicionar imediatamente 500 μL de HB e repetir o procedimento para uma segunda etapa de lavagem. Após remover o sobrenadante, adicione imediatamente o HB para evitar a secagem do cordão, conforme recomendado pelo fabricante.
3. Para cada amostra a ser testada, prepare um tubo contendo 2,5 μL de micropartículas paramagnéticas lavadas em HB.
4. Funcionalizar micropartículas paramagnéticas incubando 2,5 μL de micropartículas paramagnéticas com 10 μL de uma solução de 10 μM de uma primeira sonda discriminante biotinilada (DP1), abrigando a mutação BRAF^V600E , por 5 min em temperatura ambiente.
5. Separe magneticamente as micropartículas das sondas não ligadas interferentes e ressuspenda-as em 12,5 μL de HB. Para isso, aplique o ímã na lateral do tubo e espere até que a solução fique transparente. Retirar a solução pipetando cuidadosamente, adicionar imediatamente HB e pipetar suavemente até que os grânulos estejam homogeneamente ressuspensos.
6. Adicionar à suspensão 10 μl de uma mistura de 10 μM das amostras-alvo de ADN descritas no passo 2.1.
7. Incubar por 30 min em temperatura ambiente.
8. Durante a incubação, agite as amostras a cada 3 min para evitar a sedimentação das micropartículas paramagnéticas.
9. Adicionar à suspensão 10 μL de uma solução de 2 μM de uma segunda sonda discriminante (DP2), concebida para ter uma porção complementar ao alvo e uma cauda poli-A.
10. Incubar por 15 min em temperatura ambiente.
11. Durante a incubação, agite as amostras a cada 3 minutos para evitar a sedimentação das micropartículas paramagnéticas.
12. Separe magneticamente o excesso de DP2 após a incubação.
13. Adicione imediatamente 300 fmol de AuNPs conjugados com sondas de detecção e incube em temperatura ambiente por 5 min.
14. Separe magneticamente o sobrenadante contendo AuNPs em excesso e execute a^1ª etapa de lavagem adicionando 100 μL de HB à temperatura ambiente.
15. Separe magneticamente o sobrenadante e execute uma^2ª etapa de lavagem adicionando 100 μL de HB.
16. Incubar a 52 °C durante 5 min.
17. Sobrenadante separado magneticamente a 52 °C.
18. Ressuspenda imediatamente em 12,5 μL de HB para a leitura do resultado colorimétrico.
19. Fotografar os resultados e armazenar as amostras a 4 °C.

Resultados

Este método foi usado para a detecção da mutação BRAF^V600E em excesso de DNA sintético^{em peso} de BRAF. A Figura 1 mostra os detalhes da estratégia de detecção. O ensaio dá um resultado colorimétrico SIM/NÃO^17,18 onde vermelho corresponde a um resultado positivo (SIM) e amarelo a um negativo (NÃO).

Resumidamente, as micropartículas paramagnéticas estreptavidinadas foram revestidas com ...

Discussão

O aspecto central do método é a capacidade de discriminar um DNA alvo no contexto de um excesso de DNA não-alvo interferente, onde o DNA alvo e não-alvo diferem apenas para um único nucleotídeo. Assim, o desenho das sondas e as condições de hibridização são fundamentais para alcançar uma discriminação sensível. O ensaio foi projetado para usar sondas colorimétricas universais para serem adaptadas à detecção de quaisquer mutações pontuais de interesse. No entanto, é possível que alguma pe...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Centrífuga de bancada - Allegra X 30	Beckman Coulter	A99473
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich / Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	D0632-25G
Micropartículas paramagnéticas de estreptavidina Dynabeads M-280	Invitrogen	11205D
Sulfato de hidroxilamina	Sigma-Aldrich / Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	379913-25G
Bomba de Seringa KDS 100 Legacy	kdScientific	789100
NanoDrop OneC espectrofotômetro	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, EUA)
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	806552-500ML
Pierce™ TCEP-HCl, sem pesagem e comércio; Formato	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, EUA)	A35349
Polietilenoglicol 600	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	202401
PTFE 0,22 µ m, Fluoropore	Millipore	FGLP04700
Quant-iT™ OliGreen™ Kit de ensaio ssDNA	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA)	O11492
Citrato de sódio di-hidratado	Sigma-Aldrich / Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	W302600
Oligonucleotídeos sintéticos	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Ácido tetracloroáurico (III)	Sigma-Aldrich / Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	520918
Sondas de DNA poliT tiolado	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)	JEOL JEM 1011 microscópio
Zetasizer Nano S - Sistema de Espalhamento de Luz Dinâmico	Malvern Panalytical