Detecção a olho nu de mutações pontuais raras no DNA

Resumo

Este protocolo permite a identificação a olho nu de DNA com mutação pontual em um excesso de 200 vezes de moléculas de DNA do tipo selvagem, explorando nanopartículas de ouro e micropartículas paramagnéticas.

Resumo

O protocolo descreve um teste colorimétrico a olho nu para a detecção de mutações pontuais somáticas em excesso de DNA do tipo selvagem. A aplicação futura prevista do método é a identificação de mutações raras no DNA livre de células circulantes de biópsias líquidas, com relevância no diagnóstico de câncer e estratificação de pacientes oncológicos para terapia personalizada. Como prova de conceito, o teste foi projetado para detectar a mutação BRAF^V600E no gene BRAF, o que é importante para identificar o subgrupo de pacientes com melanoma que podem se beneficiar de terapias direcionadas com inibidores de BRAF. No entanto, este teste colorimétrico pode ser facilmente generalizado para outras mutações somáticas de relevância clínica devido ao uso de sondas de detecção universais, proporcionando assim um forte potencial no diagnóstico oncológico.

O teste detecta 0,5% de BRAF^V600E em excesso de DNA BRAF^WT , que corresponde à sensibilidade de alguns ensaios instrumentais comerciais. Essa sensibilidade é clinicamente relevante para fins diagnósticos, permitindo a identificação precoce de pacientes sensíveis a medicamentos. Em contraste com os ensaios comerciais baseados em PCR em tempo real, este teste requer instrumentação e processamento mínimos, pois pode ser realizado em DNA amplificado com uma PCR padrão (ou técnicas isotérmicas) e fornece uma leitura a olho nu com uma reação de um tubo de algumas etapas em apenas uma hora. Atualmente, o teste tem sido usado apenas em amostras de DNA sintético. No entanto, estes últimos foram projetados para imitar uma amostra real amplificada a partir de DNA livre de células circulantes, para favorecer a tradução do teste para o diagnóstico clínico.

Introdução

O objetivo do método é detectar mutações pontuais sub-representadas em uma amostra de DNA com uma metodologia minimamente instrumentada e uma leitura a olho nu. O objetivo final é ter um ensaio de prova de princípio, adequado para futuras aplicações em testes rápidos para a detecção de mutações somáticas no DNA livre de células circulantes (ccf-DNA) (por exemplo, a partir de amostras de biópsia de sangue) para o diagnóstico precoce e monitoramento do câncer¹. As mutações somáticas relacionadas ao câncer representam um importante biomarcador de câncer² e estão presentes em uma fração meno....

Protocolo

1. Síntese de sondas de nanopartículas de ouro

1. Sintetize nanopartículas de ouro tampadas com citrato de 40 nm, usando o método de crescimento de semeadura padrão de duas etapas, conforme detalhado abaixo.
   1. Sintetizar nanopartículas de ouro recobertas com citrato de 15 nm (sementes AuNPs) usando o método clássico de Turkevich-Frens^13,14.
      1. Lave todos os copos com água régia (HCl:HNO₃ na proporção de 3:1 v/v).
      2. Aqueça 250 mL de 0,25 mM HAuCl₄ para ferver, mexendo uniformemente.
         CUIDADO: HAuCl₄ é corrosi....

Resultados

Este método foi usado para a detecção da mutação BRAF^V600E em excesso de DNA sintético^{em peso} de BRAF. A Figura 1 mostra os detalhes da estratégia de detecção. O ensaio dá um resultado colorimétrico SIM/NÃO^17,18 onde vermelho corresponde a um resultado positivo (SIM) e amarelo a um negativo (NÃO).

Resumidamente, as micropartículas paramagnéticas estreptavidinadas foram revestidas com .......

Discussão

O aspecto central do método é a capacidade de discriminar um DNA alvo no contexto de um excesso de DNA não-alvo interferente, onde o DNA alvo e não-alvo diferem apenas para um único nucleotídeo. Assim, o desenho das sondas e as condições de hibridização são fundamentais para alcançar uma discriminação sensível. O ensaio foi projetado para usar sondas colorimétricas universais para serem adaptadas à detecção de quaisquer mutações pontuais de interesse. No entanto, é possível que alguma pe.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Centrífuga de bancada - Allegra X 30	Beckman Coulter	A99473
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich / Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	D0632-25G
Micropartículas paramagnéticas de estreptavidina Dynabeads M-280	Invitrogen	11205D
Sulfato de hidroxilamina	Sigma-Aldrich / Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	379913-25G
Bomba de Seringa KDS 100 Legacy	kdScientific	789100
NanoDrop OneC espectrofotômetro	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, EUA)
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	806552-500ML
Pierce™ TCEP-HCl, sem pesagem e comércio; Formato	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, EUA)	A35349
Polietilenoglicol 600	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	202401
PTFE 0,22 µ m, Fluoropore	Millipore	FGLP04700
Quant-iT™ OliGreen™ Kit de ensaio ssDNA	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA)	O11492
Citrato de sódio di-hidratado	Sigma-Aldrich / Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	W302600
Oligonucleotídeos sintéticos	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Ácido tetracloroáurico (III)	Sigma-Aldrich / Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha	520918
Sondas de DNA poliT tiolado	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)	JEOL JEM 1011 microscópio
Zetasizer Nano S - Sistema de Espalhamento de Luz Dinâmico	Malvern Panalytical