Artigo de método

Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

5.7K vistas

⸱

DOI:

10.3791/61515

⸱

2 de setembro de 2020

1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

Neste artigo

Resumo

É apresentado um protocolo que permite a visualização de melanogaster de Drosophila intacto em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada.

Resumo

Ferramentas biomédicas de imagem permitem a investigação de mecanismos moleculares em escalas espaciais, de genes a organismos. Drosophila melanogaster, um organismo modelo bem caracterizado, beneficiou-se do uso de microscopia de luz e elétrons para entender a função genética ao nível das células e tecidos. A aplicação de plataformas de imagem que permitem a compreensão da função genética ao nível de todo o organismo intacto aumentaria ainda mais nosso conhecimento sobre mecanismos genéticos. Aqui é apresentado todo um método de imagem animal que delineia os passos necessários para visualizar a Drosophila em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada (μ-CT). As vantagens do μ-CT incluem instrumentação comercialmente disponível e tempo mínimo de hands-on para produzir informações 3D precisas na resolução de nível de micron sem a necessidade de dissecção ou métodos de compensação de tecidos. Emparelhado com softwares que aceleram a análise de imagem e a renderização 3D, a análise morfométrica detalhada de qualquer tecido ou sistema de órgãos pode ser realizada para entender melhor os mecanismos de desenvolvimento, fisiologia e anatomia para estudos descritivos e testes de hipóteses. Utilizando um fluxo de trabalho de imagem que incorpora o uso de microscopia eletrônica, microscopia leve e μ-CT, uma avaliação minuciosa da função genética pode ser realizada, promovendo assim a utilidade deste poderoso organismo modelo.

Introdução

Métodos de imagem que permitem a investigação detalhada das estruturas interiores de um objeto sem destruir sua arquitetura 3D global provaram ser amplamente benéficos para uma série de disciplinas diferentes, incluindo física, engenharia, ciência dos materiais, arqueologia, paleontologia, geologia e biologia1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Entre esses métodos de imagem não destrutivos, as plataformas baseadas em raios-X são especialmente úteis devido à capacidade de raios-X de alta energia penetrar em muitos tipos e materiais de amostra diferentes com dispersão mínima em comparação com ondas de luz visíveis. Tomografia computadorizada (TC), Tomografia Microcomputada (μ-CT), Tomografia Nanocomputada (Nano-CT) e Microtomografia Síncrotron surgiram, portanto, como as principais tecnologias para imagens baseadas em raios-X de amostras que variam de medidores a mícrons, com recursos de resolução de milímetros a subcron10,11,12,13,14.

Embora essas plataformas diferem em seu design, geometria de raios-X e componentes para equilibrar o tamanho e a resolução da amostra, todas elas dependem do mesmo princípio básico para captura de imagem: uma fonte de raios-X que viajam através do objeto e são capturados por um detector. Atenuação diferencial do feixe de raios-X à medida que passa por densidades variadas dentro do objeto gera contraste de imagem. Os dados 3D são obtidos girando a amostra ou o detector, coletando uma série de imagens de projeção 2D que são então reconstruídas usando algoritmos em tomogramas contendo informações 3D cuja resolução é isotropic em x,y,z15. Para muitos scanners de μ-CT que utilizam uma geometria de raios-X de feixe de cone para projetar raios-X no objeto que está sendo imageado, o algoritmo Feldkamp é usado para reconstruir o objeto com erros mínimos16.

A resolução de uma determinada plataforma é determinada principalmente por parâmetros do sistema, como o tamanho do feixe de raios-X (tamanho da mancha), geometria do scanner (distância do objeto à fonte de raios-X), tamanho dos pixels no detector e o algoritmo de reconstrução empregado. Fatores adicionais, como vibrações de scanner, flutuações de raios-X, movimento da amostra e tipo de material ou mancha química usada para visualizar o objeto também podem influenciar significativamente a resolução espacial sob condições de imagem do mundo real15.

Para aplicações biomédicas, a Tomografia E μ-CT têm desempenhado um papel fundamental no avanço da compreensão dos mecanismos de anatomia, fisiologia, desenvolvimento e doenças, servindo como ferramenta tanto para diagnósticos de pacientes humanos quanto como plataforma de imagem pré-clínica para organismos modelo17,18. Por exemplo, o Mouse International Phenotyping Consortium, cujo objetivo é identificar a função de cada gene no genoma do camundongo, utiliza μ-CT como parte de seu oleoduto fenotipado19. Seus resultados têm sido fundamentais para a compreensão dos genes envolvidos no desenvolvimento e nos processos de doenças, ao mesmo tempo em que servem como um atlas para anatomia e desenvolvimentode camundongos 20. Outros organismos modelo, como zebrafish e ratos, também adotaram totalmente o uso de μ-CT para a realização de fenotipagem animal inteira de um número de mutantes genéticos17,21,22,23.

A vantagem de combinar imagens animais inteiras com organismos modelo é que uma compreensão mecanicista da função genética para um determinado processo biológico pode ser totalmente explorada. Isso é possível devido aos genomas bem caracterizados e muitas ferramentas genéticas disponíveis em organismos modelo que permitem a manipulação precisa da função genética em pontos de tempo distintos do desenvolvimento, tecidos específicos, células individuais e até organelas subcelulares. Estes incluem sistemas de expressão binária, como o sistema UAS/GAL4 (e seus muitos derivados), CRISPR/Cas9 e RNAi24,25,26. Quando essas ferramentas genéticas são usadas em conjunto com um poderoso pipeline de imagem composto por microscopia eletrônica, microscopia leve (fluorescente e não fluorescente), e imagens animais inteiras como μ-CT, uma avaliação completa de moléculas, células, tecidos, órgãos e todo o organismo pode ser alcançada, permitindo uma compreensão muito mais profunda da função genética.

Este protocolo se concentra no uso de μ-CT no organismo modelo não-mamífero Drosophila melanogaster, cuja miríade de ferramentas genéticas ajudaram a elucidar numerosos mecanismos moleculares26,27. Foi adotado a partir de protocolos anteriores em insetos não-modelo1,28,29,30,31,32, e constrói-se de estudos anteriores μ-CT em Drosophila para estabelecer um protocolo padronizado para seu uso neste animal 33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. As etapas para a preparação, imagem e análise bem-sucedidas dos conjuntos de dados fly μ-CT usando scanners disponíveis comercialmente são delineadas. Com este protocolo, todos os estágios de desenvolvimento da mosca podem ser visualizados em alta resolução para estudos descritivos e testes de hipóteses, incluindo taxonomia, anatomia, desenvolvimento, fisiologia e doença27. Este protocolo também será útil para a imagem de praticamente qualquer inseto e até mesmo materiais não vivos que requerem coloração química para contraste de imagem para melhorar a visualização por μ-CT.

Protocolo

1. Seleção de amostras e preparação de cutículas

  1. Escolha o ponto de tempo de desenvolvimento adequado (embrião, larva, pupa ou adulto) para imagem.
    1. Para os estágios embrionários, as fêmeas da gaiola em pratos de ágar de suco de uva manchados com pasta de levedura e coletam ovos a cada 30-60 min. Deixe esses embriões se desenvolverem a 25 °C até que o estágio adequado seja alcançado.
    2. Para estágios larvais, colete primeiro e segundo instars de experimentos cronometrados de coleta de embriões. Escolha diretamente 3estrelas errantes do lado do frasco de comida em condições não lotadas.
    3. Para o tempo pupal, colete pré-pupas brancas (espirros invertidos) e anote o momento em que a cutícula começa a dourar. Os animais progredirão através de 15 estágios de desenvolvimento pupal em momentos definidos após o browning da cutícula e podem ser coletados emconformidade com 42.
    4. Coletar adultos como virgens após o fechamento e permitir envelhecer em um frasco de alimentos por um período necessário de tempo (por exemplo, 5 dias para o desenvolvimento completo do intestino).
  2. Transfira 5-50 animais para um tubo de microcentrifus de 1,5 mL contendo 1 mL de 0,5% Triton X-100 em 1x Salina Tamponada fosfato (0,5% PBST). Enquanto toca o tubo periodicamente no topo do banco, incuba por 5 minutos à temperatura ambiente (RT) para auxiliar na remoção do revestimento hidrofóbico e permitir que os animais fiquem totalmente submersos.
    1. Para estágios embrionários, larvais e pupais, prendam o desenvolvimento adicionais colocando o tubo em um bloco de calor definido para 100 °C para 20 s seguido de resfriamento em RT por 5 min.
      NOTA: Os animais também podem ser congelados em nitrogênio líquido37.

2. Fixação e coloração

  1. Remova 0,5% PBST e adicione 1 mL da Solução bouin. Tubo de torneira para garantir que os animais estejam totalmente submersos.
    ATENÇÃO: A Solução de Bouin contém formaldeído. Pode causar toxicidade aguda à pele e aos olhos se derramado e pode ser fatal se engolido. Use luvas, óculos de segurança e um jaleco ao manusear.
    NOTA: Técnicas adicionais de fixação também podem ser empregadas, como o uso de etanol. Os méritos de outros fixativos são descritos detalhadamente no ref.1,30.
    1. Para embriões e amostras adultas, incubar no banco por 16-20 h na RT.
    2. Para amostras de larvas e pupal, fixar animais por 2 h na RT. Descarte a solução de Bouin e lave com 1x PBS por 5 minutos três vezes. Transfira para um prato de dissecação multi-bem contendo 1x PBS e use um pequeno pino minutien preso a um suporte para fazer um orifício na cutícula anterior e posterior, tomando cuidado para não interromper nenhum tecido mole subjacente.
    3. Transfira amostras de larvas e pupal de volta para um tubo de microfuge e adicione 1 mL de solução fresca de Bouin. Incubar no banco por 24 h na RT.
  2. Remova a solução de Bouin e lave a amostra por 30 min com 1 mL de tampão de lavagem μ-CT (0,1 M Na2HPO4, 1,8% sacarose) ou 1x PBS três vezes.
  3. Adicione 1 mL da solução de coloração apropriada e incubar no banco por 2-7 dias.
    NOTA: A escolha da mancha dependerá de muitos fatores, mas geralmente é um equilíbrio entre penetração, tempo de incubação e resolução. Em geral, o ácido fosfotungstic (PTA) fornece contraste superior e resolução de tecido mole, mas requer interrupção mecânica da cutícula e tempos de incubação mais longos. Os méritos de diferentes tipos de manchas são descritos detalhadamente no ref.1.
    1. Para coloração de iodo, use 1 mL de 0,1 N I2KI (Solução Lugol). Incubar por 2 dias. Não é necessário mais interrupções da cutícula adulta.
    2. Para coloração de ácido fosfotungstic (PTA), utilize 1 mL de uma solução de 0,5% (w/v) diluída em água. Interrompa a cutícula adulta, seja removendo as partes bucais ou furando o tórax ou cutícula abdominal com um pequeno pino minutien preso a um suporte. Incubar por 5-7 dias, ou mais se a coloração do tecido parecer não homogênea.
  4. Lave com 1 mL de água ultrauso ou 1x PBS por 30 min. Repita o passo de lavagem. Armazene animais na RT em água ultrauso ou 1x PBS por até um mês.
  5. Se os animais forem escaneados enquanto hidratados, proceda diretamente à seção 4. Se for necessária uma preservação mais longa da amostra, proceda à seção 3 do protocolo.

3. Secagem de pontos críticos (Opcional)

  1. Realizar uma série de desidratação de etanol (EtOH) na amostra: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Adicione 1 mL da solução EtOH e incubar no banco por 1h para cada concentração na ordem indicada.
  2. Após o último mergulho 100% EtOH, substitua por etoh fresco 100% e deixe a amostra incubar no banco durante a noite.
  3. Realize a secagem de pontos críticos das amostras seguindo as instruções do fabricante.
    NOTA: As instalações de microscopia eletrônica geralmente possuem uma máquina de secagem de ponto crítico (ver Tabela de Materiais) que realizará a secagem da amostra após a desidratação do EtOH.

4. Montagem da amostra

  1. Para amostras secas de ponto crítico, amostras de cola quente em um pino de inseto ou outro suporte projetado para caber dentro do mandril do estágio rotativo ou colocá-lo em um tubo capilar de plástico ou vidro (~1,0-1,25 mm de diâmetro interno).
  2. Para amostras hidratadas, encha uma ponta de pipeta P10 com água e fixe a extremidade estreita por vedação térmica ou filme de parafina para evitar vazamentos.
    ATENÇÃO: Certifique-se de embrulhar as conexões com força para que a água não vaze no scanner e cause danos.
    1. Transfira um único espécime para a ponta da pipeta usando fórceps. Usando um objeto longo e esguio, como uma agulha de 20 G embotada ou outra ponta de pipeta, empurre cuidadosamente o espécime pela ponta até que ele apenas entre em contato com a parede da ponta da tubulação para mantê-lo no lugar.
    2. Cubra a abertura da ponta da pipeta com filme de parafina para evitar a evaporação da água durante longos exames.
    3. Monte a pipeta P10 usando um suporte projetado para caber dentro do mandril do estágio rotativo(Figura 1A-C).

5. Digitalização

  1. Realize todas as calibrações necessárias da máquina antes da imagem durante o dia.
    NOTA: Estes variam de acordo com o fabricante e é recomendável consultar um especialista em aplicação para determinar as etapas adequadas. Consulte a Tabela de Materiais para obter informações específicas sobre a configuração e o software utilizados neste protocolo. Geralmente, calibrações como um alinhamento do eixo de estágio para remover qualquer 'oscilação' associada ao mandril estar fora do eixo em relação ao estágio rotativo e realizar correções de campo plano para garantir intensidades uniformes de pixel de fundo na câmera fornecem condições ideais de imagem para a melhor resolução e conjuntos de dados que são comparáveis em várias varreduras.
  2. Abra a porta do scanner para ter acesso ao mandril do estágio rotativo clicando no ícone 'Open Door' no canto superior esquerdo do software. Fixar a amostra apertando a coleira ao redor da base do suporte da amostra.
    NOTA: Use pressão suave ao anexar a amostra ao mandril rotativo para manter o alinhamento do scanner.
  3. Defina parâmetros de digitalização no software que controla o scanner para uma resolução e contraste ideais.
    NOTA: Estes precisarão ser determinados empiricamente, pois a fonte de raios-X, a câmera/detector e a geometria de cada scanner variam de acordo com o fabricante. Informações adicionais para a seleção dos melhores parâmetros também podem ser encontradas aqui43,bem como do especialista em aplicação do fabricante.
    1. Abra o controle de energia de fonte de raios-X (Opções | Fonte de raio-X). Use as barras de controle deslizante para definir tensão de raios-X a 30-40 kV e corrente de 100-110 μA para produzir um feixe de raios-X com 3-4W de potência e um pequeno tamanho de ponto para maior resolução.
    2. Use a caixa de diálogo Modos de Aquisição (Opções | Modos de aquisição) para definir o tempo de exposição da câmera para 500-800 ms.
    3. Use a barra de controle deslizante localizada ao lado do ícone da lupa na parte inferior do software para definir o tamanho do pixel de imagem desejado (~700 nm a 4 μm), dependendo das configurações da câmera e da posição. Isso determina o número de imagens de projeção adquiridas durante a varredura, com mais projeções levando a uma resolução aprimorada, mas tempos de varredura mais longos (ver Resultados Representativos).
    4. Clique e arraste a barra de controle deslizante localizada ao lado da seta giratória na parte inferior do software para mover a amostra ao longo de seu caminho de rotação de 360°. Certifique-se de que a amostra permaneça dentro do campo de visão.
  4. Clique no ícone'Iniciar aquisição'(ícone de seta de círculo azul) na parte superior do software. Uma caixa de diálogo aparece que permite que parâmetros adicionais de digitalização sejam definidos e a pasta de arquivo e saída onde a digitalização será salva para ser nomeada.
    1. Defina o movimento aleatório para 10 e média de 4-6 quadros. A etapa de rotação é calculada automaticamente dependendo das configurações da câmera utilizadas.
  5. Comece a digitalizar clicando em 'OK' na caixa de diálogo Aquisição. Uma segunda caixa de diálogo da barra de progresso aparece que mostra o tempo de varredura. O scanner agora adquirirá uma série de imagens de projeção (Figura 1D) da amostra ao longo do caminho de rotação e não precisa ser monitorado.

6. Reconstrução

  1. Para gerar os tomogramas, realize a reconstrução da imagem usando as imagens de projeção.
    NOTA: Enquanto quase toda a reconstrução de imagens dos scanners de geometria do feixe de cone depende do algoritmo Feldkamp16,os parâmetros individuais variam dependendo da implementação do software e devem ser determinados empiricamente. As seguintes configurações, específicas para um software comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais)podem ser usadas como guia. Parâmetros como compensação de desalinhamento, redução de artefatos de anel e correção de endurecimento de feixe (0% para a maioria das amostras de mosca) são realizados de forma iterativa para escolher os melhores valores para a reconstrução final. Para usuários avançados que gostariam de mais controle sobre o processo de reconstrução, consulte a interface MATLAB aqui44.
  2. Realize um alinhamento inicial de imagem utilizando um algoritmo de correção de turno baseado em varreduras de referência45 (Ações | Alinhamento x/Y com uma varredura de referência).
  3. Ajuste fino cada parâmetro de reconstrução(Iniciar | Ajuste fino). Isso ativa uma caixa de diálogo 'Ajuste fino do parâmetro'.
    1. Ajuste bem o alinhamento clicando em 'Next' to 'Post-Alignment'. Defina o número de iterações para cinco e o parâmetro passo para 1.0. Clique no botão Iniciar para gerar uma série de visualizações. Selecione a imagem que está corretamente alinhada.
      NOTA: Uma imagem adequadamente alinhada não será embaçada ou exibirá artefatos de "cisalhamento" onde uma estrutura contínua (como a cutícula) aparece dividida.
    2. Ajuste bem a redução do artefato do anel clicando ao lado dele. Defina o número de iterações para cinco e o parâmetro passo para 1.0. Clique no botão Iniciar para gerar uma série de visualizações. Selecione a imagem que contém o menor número de anéis.
  4. Uma vez otimizados os parâmetros acima para dar a melhor imagem, certifique-se de que os valores selecionados estejam devidamente representados na guia Configurações(Configurações).
  5. Ajuste qualquer brilho final e valores de contraste usando o histograma, parâmetros de arquivo, como profundidade e tipo de bit, e utilize uma Região de Interesse (ROI) abrangendo apenas as estruturas de interesse (por exemplo, somente mosca ou cabeça inteira) para reduzir o tempo computacional(Saída).
  6. Comece a reconstrução (Comece | Comece). Se forem necessárias várias reconstruções, adicione a imagem atual ao gerenciador de lotes(Iniciar | Adicione ao lote) e repita as etapas 6.2-6.5 para as demais imagens.

7. Análise de imagem

  1. Visualize os tomogramas em duas e três dimensões e realize uma análise morfométrica adicional com freeware ou software comercial.
    NOTA: Os detalhes do software utilizado neste protocolo estão disponíveis na Tabela de Materiais. Outros pacotes de software capazes de avaliar conjuntos de dados μ-CT incluem opções de freeware como FIJI46,Seg3D (www.seg3D.org)47e ITK-SNAP48, além de software comercial (por exemplo, AMIRA). Outras aplicações que empregam algoritmos baseados em aprendizado de máquina para semi automatizar o processo de segmentação podem ajudar a acelerar os fluxos de trabalho e reduzir o viés humano (por exemplo, Biomedisa49).
  2. Importar o arquivo tomograma para o software (Arquivo | Importar arquivos de imagem). Os metadados associados ao arquivo devem ser carregados automaticamente na janela, mas também podem ser definidos manualmente para corresponder às propriedades da imagem.
  3. Para segmentar uma estrutura de interesse, clique na guia Segmento no lado esquerdo da tela. Criar uma nova Região de Interesse (ROI) (| Básica Novo), dê-lhe um nome e selecione uma cor apropriada.
  4. Defina o intervalo de limiar que engloba a estrutura de interesse (Range | Definir intervalo) usando a barra de controle deslizante.
  5. Selecione um modo de ferramenta de pintor de ROI 2D ou 3D apropriado(ROI Painter | Opção paintbrush).
  6. Pintar uma área definida pelo limiar; pressione e segure a tecla Ctrl enquanto segura a tecla do mouse esquerdo. Para remover uma área, pressione e segure a tecla Shift enquanto segura a chave do mouse esquerdo.
    NOTA: Para alterar o tamanho do pincel circular ou quadrado, basta rolar a roda do mouse enquanto segura as teclas Ctrl ou Shift.
  7. Continue a pintar a estrutura de interesse durante todo o seu volume Z.
  8. Converta o ROI em uma malha(exportação | Para um | de malha Normal).
  9. Destaque a sobreposição de malha clicando nela no painel Propriedades e Configurações de Dados no canto superior direito.
  10. Suavize a malha usando um número apropriado de iterações(Malha Lisa | Iterações).
    NOTA: Use o mesmo valor de iteração de suavização da malha para todas as imagens a serem comparadas.
  11. Certifique-se de que as medidas do ROI de malha (Superfície, Volume e Diâmetro do Feret) sejam exibidas no painel Informações no lado direito da tela para análise morfométrica básica. Análises adicionais podem ser realizadas utilizando o Módulo de Análise de Objetos.
  12. Renderize o objeto de malha e toda a imagem do tomograma e visualize em 3D. Use o Movie Maker embutido para gerar um vídeo do objeto (Mouse Direito Clique | Show Movie Maker) usando quadros individuais do espectador(Adicionar chave).
    NOTA: Vários aprimoramentos visuais também podem ser aplicados ao filme usando a guia de efeitos visuais no painel direito para destacar certas características, etc.
  13. Exporte o vídeo para visualização usando o botão Animação de Exportação no Criador de Filmes.

Resultados

A Figura 2 mostra imagens de um embrião, 3ª larva instar, pupae no estágio adulto pharate (P7), e uma mosca fêmea adulta manchada com iodo e imagem hidratada na água usando um scanner de bancada comercial. A excelente preservação e até mesmo a coloração de tecido delicado são aparentes, permitindo que todos os órgãos principais sejam prontamente identificados e utilizados para análise morfométrica e visualização 3D.

Normalmente, varreduras que adquirem menos imagens de projeção da amostra fornecem resolução menor do que as varreduras que adquirem mais imagens de projeção, com o tempo de troca sendo gasto na varredura. Embora os tempos de varredura variem de acordo com o instrumento e outros parâmetros de digitalização, as varreduras que adquirem algumas centenas de projeções (~3 μm tamanho do pixel de imagem) leva cerca de 30 minutos por espécime, enquanto as varreduras que consistem em milhares de imagens de projeção (700 nm-1,25 μm tamanho de pixel de imagem) podem levar de 8-16 h. Uma comparação do mesmo caso de cabeça de mosca adulto tomado tanto no modo de varredura 'lento' (milhares de projeções) quanto "rápido" (centenas de projeções) é mostrado na Figura 3. É importante ressaltar que as análises morfométricas não diferem entre varreduras 'lentas' e 'rápidas'(Figura 3C)40. Nosso pipeline de imagem, portanto, utiliza varreduras rápidas para gerar um tamanho amostral suficientemente grande para análise morfométrica, e varreduras lentas para visualizar quaisquer defeitos morfológicos ou anatômicos em maior resolução. Utilizando o software (Passo 7), qualquer tecido ou sistema de órgão de interesse pode ser segmentado e usado para análise morfométrica e visualizado em 3D usando o cineasta(Filme 1).

A Figura 4 mostra um exemplo do abdômen de mosca manchado com PTA e hidratado (água) ou seguindo a secagem de ponto crítico (CPD) em um microscópio de raios-X (Tabela de Materiais). O detalhe proporcionado por uma combinação do PTA e as capacidades desta plataforma é facilmente evidente nessas imagens, de tal forma que as células epitélios individuais dos feixes de midgut e esperma dentro dos testículos são facilmente resolvidas. Enquanto a imagem do CPD mostra uma resolução marginalmente aumentada em relação à amostra hidratada, uma melhor preservação da ultraestrutura de tecidos delicados (como as células de gordura próximas à cutícula) é alcançada com amostras hidratadas(Filme 2).

figure-results-1
Figura 1: Visão geral do design do scanner e montagem da amostra para μ-CT. (A) Um scanner comercial de bancada μ-CT. (B) Veja dentro do scanner. A fonte de raios-X (à direita) emite raios-X que passam pela amostra localizada em um estágio rotativo (seta amarela). Atenuação desses raios-X geram contraste de imagem à medida que passam pela amostra e pelo detector, que consiste em uma tela de cintilação que converte raios-X em fótons e uma câmera CCD padrão (esquerda). (C) Montagem de uma mosca de fruta adulta para imagem hidratada na água. Os pontos de conexão entre a ponta da pipeta e o suporte de latão são embrulhados em filme de parafina para evitar vazamentos e danos potenciais ao scanner. O mandril de palco também é destacado. Note que a ponta da pipeta foi posicionada ligeiramente fora do eixo, o que levou a um tempo de varredura mais longo e redução da resolução na reconstrução final. (D) Uma única imagem de projeção 2D de uma mosca fêmea adulta; centenas a milhares dessas projeções são adquiridas durante uma varredura ao longo do eixo de rotação e são usadas para reconstrução para gerar tomogramas contendo resolução isotrópica e informações 3D precisas. Barras de escala (C) = 2 mm. P, Posterior; V, Ventral. Este valor foi modificado de Schoborg et al.40. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Todos os estágios do ciclo de vida de Drosophila melanogaster, imagens por μ-CT. Amostras manchadas com iodo e imagens hidratadas em água. Mostrado é uma única fatia 2D. (A) Um embrião que completou os estágios iniciais da gastrulação (asterisco). (B) Uma terceira larva instar. (C) Um adulto de pharate P7 durante a metamorfose. (D) Uma fêmea adulta. Vários órgãos são destacados: BWM, músculos da parede corporal; Br, cérebro; Cd, cardíaco; Cr, colheita; DLMs, músculos longitudinais dorsais; DVM, músculos ventral dorsal; E-AD, disco antena dos olhos; Em, embrião; FB, corpos gordos; FBCs, células do corpo de gordura; H, coração; Hg, hindgut; La, lamina; L, perna; Mg, midgut; OL, lobo óptico cerebral; Ov, ovipositor; PC, cutícula pupal; SG, glândulas salivares; VNC, cabo de nervo ventral; W, asa; WD, disco de asa. Barras de escala (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, esquerda. Parâmetros de varredura: Distância da Fonte à Amostra (mm): (A, D) 36,5, (B) 48,8, (C) 40,3. Fonte para Distância da Câmera (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Tamanho do Pixel da câmera (μm): (A-D) 11.6. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Os parâmetros de varredura e a resolução da imagem não alteram as análises morfométricas. Uma cabeça adulta digitalizou usando as configurações do scanner'A, A' ( A, A') (centenas de projeções) e(B, B)configurações de scanner 'lentas' (milhares de projeções). O cérebro está delineado em amarelo. (C) Medições de volume cerebral a partir de varreduras lentas e rápidas. Estruturas destacadas: AL; lóbulo antenal; CB, cérebro central; FB, corpo em forma de ventilador; FCs, células de gordura; La, lamina; Lo, lobula; LoP, placa de lobula; Eu, medulla; Re, retina. n = 5, teste t de Welch. ns = não significativo. Barras de escala = 100 μm. Parâmetros de varredura: Distância da fonte à amostra (mm): (A) 44,4, (B) 36,5. Fonte à Distância da Câmera (mm): (A) 348 (B) 350. Tamanho do Pixel da câmera (μm): (A-B) 11.6. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A) 2,95, (B) 1.2. Este valor foi modificado de Schoborg et al.40. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Abdômen de melanogaster de Drosophila, retratado por Microscopia de Raio-X. Os abdômens foram manchados com 0,5% de PTA e hidratado (água) ou seguindo a secagem de ponto crítico (DPC). (A) Ponto Crítico Abdômen seco, mostrado a partir da perspectiva YZ e (A') perspectiva XZ. (B) Abdômen hidratado, mostrado a partir da perspectiva YZ e (B') perspectiva XZ. Vários órgãos são destacados: FC, células de gordura; Hg, hindgut; Mg, Midgut; SP, Bomba de Esperma; Te, Testes. Barras de Escala (A) = 250 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, esquerda. Parâmetros de varredura: Distância da fonte para amostra (mm): (A) 6,7, (B) 7. Fonte à Distância da Câmera (mm): (A) 28 (B) 29,5. Objetivo: (A-B) 4X. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A-B) 0,65. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 1: Uma terceira larva instar, renderizada em 3D usando o Cineasta em Dragonfly. Os órgãos destacados incluem o cérebro (amarelo), os discos imagináveis de antena dos olhos (vermelho), o corpo gordo (azul) e os músculos da parede corporal (verde). Clique aqui para baixar este filme.

Filme 2: Comparação de amostras imagens em água ou seguir a secagem de ponto crítico. Abdômens manchados com 0,5% de PTA são mostrados. Ambos os abdômens foram escaneados com configurações idênticas do tamanho do pixel de imagem (0,65 μm). Uma série de fatias 2D são mostradas em um formato 'Z-stack' (YZ) começando na superfície dorsal e terminando na superfície ventral do abdômen. Órgãos destacados: FC, células de gordura; Mg, Midgut; SP, Bomba de Esperma; Te, Testes. Parâmetros de varredura: Distância da fonte para amostra (mm): (A) 6,7, (B) 7. Fonte à Distância da Câmera (mm): (A) 28 (B) 29,5. Objetivo: (A-B) 4X. Tamanho do Pixel da imagem (μm): (A-B) 0,65. Clique aqui para baixar este filme.

Discussão

A visualização intacta de melanogaster de Drosophila intacta em todas as fases de desenvolvimento tem permanecido um desafio, principalmente devido à incompatibilidade da microscopia leve com a cutícula espessa e pigmentada encontrada neste animal. Enquanto outros métodos inteiros de imagem animal, como ressonância magnética (RM), Tomografia de Coerência Óptica (OUT) e ultramicroscopia aliada à limpeza tecidual, juntamente com a limpeza de tecidos, têm sido utilizados com sucesso em moscas50,51,52,53,54, μ-CT apresenta uma série de vantagens que o tornam ideal para toda a imagem animal deste organismo13,15,30 . Raios-X penetram facilmente na cutícula pigmentada e seu pequeno comprimento de onda permite imagens submicinas. A rotulagem requer investimento mínimo em produtos químicos amplamente disponíveis e sem habilidades de banco especializadas13. μ-CT scanners também estão disponíveis comercialmente, e os custos são comparáveis às plataformas de microscopia leve, ao mesmo tempo em que são mais atraentes para uma ampla gama de disciplinas (Geologia, Paleontologia, Engenharia, etc.) que também podem se beneficiar de sua disponibilidade em uma instituição. As fontes de raios-X síncrotrons também podem ser usadas para imagens de μ-CT de alta resolução de insetos fixos e vivos31,55,56, mas são menos acessíveis do que os scanners comerciais de bancada.

Este protocolo fornece uma maneira eficiente de obter imagens μ-CT de adultos voadores, pupas, larvas e embriões celularizados. Observe que para muitas das etapas descritas acima, métodos alternativos também podem ser aplicados para preparar amostras para imagens. Outros estudos têm proporcionado uma comparação detalhada das diferentes etapas de fixação, rotulagem e secagem para uso em insetos e os interessados em adotar essa técnica são incentivados a avaliar os méritos de cada abordagem1,4,13,29,30,57. Embora este protocolo seja relativamente simples, algumas sugestões úteis são apresentadas.

Em primeiro lugar, deve-se tomar cuidado ao interromper a cutícula de espécimes intactos, de tal forma que os tecidos moles subjacentes não são significativamente interrompidos. É importante deixar que as fases larval e pupal precoces sejam fixação por 2 horas na solução de Bouin antes de cutucar. Isso endurecerá o tecido e limitará a quantidade de hemoglifo que vai escorrer dos orifícios de cutícula, o que pode alterar a arquitetura dos órgãos. Segmentos corporais individuais (cabeça, tórax e abdômen) do adulto podem ser separados se a estrutura de interesse estiver localizada lá. Recomenda-se usar um bisturi para cortar limpamente esses segmentos em vez de separá-los com fórceps, o que poderia interromper a arquitetura 3D do intestino ou do sistema nervoso central, por exemplo. Quanto ao tempo, os adultos geralmente precisam de apenas 16 horas. para fixação completa, enquanto os estágios larval e pupal precisam de 24 h. Além disso, se a coloração de iodo ou PTA parecer desigual, a amostra pode ser colocada de volta em solução para incubar por mais tempo até que até mesmo a coloração seja alcançada. Por fim, as amostras hidratadas não devem ser colocadas a 4 °C, pois isso parece induzir a formação de bolhas de ar dentro da cavidade corporal após o aquecimento à temperatura ambiente.

Em segundo lugar, a montagem da amostra variará de acordo com o instrumento, o tipo de estágio e se a amostra precisa permanecer hidratada ou foi um ponto crítico seco. Se hidratado, certifique-se de que a amostra não vaze e possivelmente destrua o scanner. Ao montar a amostra dentro de uma ponta de pipeta, certifique-se de empurrar suavemente com um objeto embotado até que os espécimes encontrem leve resistência e não possam se mover. Empurrar muito forte pode levar à deformação da cutícula e defeitos estruturais subjacentes. Além disso, certifique-se de que a amostra está alinhada no suporte o mais próximo possível do eixo de rotação. Qualquer oscilação aumentará os tempos de varredura devido ao campo de visão maior e reduzirá a resolução do tomograma final após a reconstrução.

Em terceiro lugar, as configurações do scanner para aquisição de imagens de projeção também variam de acordo com o instrumento. Para maximizar as capacidades de resolução do scanner, o tamanho da mancha do feixe de raios-X deve ser o menor possível (5-10 μm). Isso pode ser alcançado equilibrando as configurações de tensão de raios-X e correntes de tal forma que a potência total seja de 3-4 W. Com essas configurações e o tempo de exposição adequado na câmera, pode-se alcançar a atenuação adequada do feixe de raios-X pela amostra e o contraste de imagem ideal. O uso de filtros de alumínio ou cobre entre o objeto e a fonte de raios-X pode ser usado para ajustar as configurações ideais de energia de raios-X para o melhor contraste de imagem ou atenuar o feixe suficientemente para fontes mais altas de energia a serem usadas. Quanto à resolução da imagem, isso dependerá de muitas variáveis diferentes, incluindo tipo de mancha, número de imagens de projeção, tamanho do pixel da imagem, posição da câmera, movimento da amostra, vibrações do scanner e parâmetros de reconstrução. Um fantasma padrão de barra (QRM GmbH) contendo marcadores de tamanho conhecidos pode ajudar a avaliar a resolução espacial para um determinado scanner e configuração da câmera.

Também vale a pena avaliar os méritos da imagem de amostras de ponto crítico seco ou hidratado. Sombke et al. realizaram uma avaliação comparativa dos dois métodos e encontraram a secagem de pontos críticos como superior às aplicações μ-CT envolvendo artrópodes30. No entanto, os benefícios das amostras hidratadas são que os animais são submetidos a menos exposição química e mecânica que poderia levar a artefatos quantitativos e morfológicos. Isso também tende a preservar tecidos delicados melhor do que o CPD. No entanto, as amostras hidratadas têm uma vida útil muito menor e devem ser imagens no máximo um mês após a fixação, uma vez que a degradação do tecido e a qualidade da imagem reduzida se tornam óbvias nesse ponto. Além disso, a resolução das amostras hidratadas será ligeiramente menor que uma amostra seca de ponto crítico, pois os raios-X também devem penetrar tanto através de uma ponta de pipeta plástica quanto do líquido circundante (água ou tampão). Ponto Crítico As amostras secas podem ser preservadas por períodos muito mais longos de tempo, especialmente quando mantidas em Drierite. Eles também podem ser colocados diretamente no caminho do raio-X, simplesmente colando as asas ou pernas a um pino de inseto e colocando-o no mandril de palco, simplificando o processo de montagem. No entanto, a extensa desidratação do etanol dessas amostras pode levar ao encolhimento tecidual e à perda de arquitetura de tecido delicado, razão pela qual é importante realizar uma série de concentrações crescentes de EtOH para minimizar esses efeitos. No entanto, deve-se notar que todas as formas de tratamento químico, incluindo a fixação de paraformaldeído e até mesmo a coloração de iodo podem causar encolhimento tecidual58,59. Embora nenhum dos métodos forneça medições do "tamanho real do órgão" em uma mosca viva, as medidas morfométricas ainda são válidas quando comparamos animais mutantes e selvagens, desde que as etapas de fixação, coloração e secagem sejam realizadas de forma idêntica para ambos os conjuntos de amostras — de preferência em paralelo.

Em conclusão, μ-CT fornece uma ferramenta de imagem animal útil para Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Muitos outros estudos mostraram o poder dessa tecnologia para entender vários aspectos da taxonomia de insetos, ecologia, fisiologia, desenvolvimento e anatomia que podem ajudar a informar estudos futuros em moscas1,28,30,31,32,55,56,57 . Combinada com as ferramentas de microscopia genética e leve já amplamente utilizadas neste organismo, μ-CT pode se posicionar dentro de um pipeline experimental que permite uma compreensão mais profunda entre genótipo e fenótipo.

Divulgações

O autor declara não ter interesses concorrentes ou financeiros.

Agradecimentos

Nada disso teria sido possível sem o apoio de Nasser Rusan. Gostaria de agradecer a H. Doug Morris, Danielle Donahue e Brenda Klaunberg do NIH Mouse Imaging Facility e Ben Ache da Micro Fotônica pelo treinamento e discussão útil. Agradeço também a Mansoureh Norouzi Rad de Zeiss por escanear amostras de abdômen no Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith e Rachel Ng também ajudaram na varredura. Mike Marsh, da Object Research Systems, forneceu suporte técnico dragonfly. Também sou grato pelo apoio do National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) e start up funds da Universidade de Wyoming. Agradeço também aos revisores anônimos por suas sugestões e comentários úteis.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
100% EtanolPara secagem de pontos críticos
Solução de BouinSigma-AldrichHT10132Para fixação de animais
Secador de Ponto CríticoSeca amostras usando o método de ponto crítico; várias opções disponíveis (Balzers CPD 020 ou Leica EMCPD300)
Dragonfly SoftwareObject Research SystemsPara visualização e segmentação de conjuntos de dados de micro-CT; Bloco
de calorpara tubos de microfuge
Estação de trabalhoDeve conter RAM suficiente e placa gráfica de qualidade para renderização 3D
Solução de iodo (I2KI)Fisher ScientificSI86-1Para coloração
Scanner de tomografia microcomputadorizadaBrukerSkyscan 1172Geometria de raios-X de feixe cônico; o detector é uma câmera Hamamatsu de 10 MP com 11,54 e micro; m tamanho de pixel.
Software de scanner de tomografia computadorizadaBrukerPara controlar o próprio scanner (por exemplo, realizar correções de campo plano, potência do tubo de raios-X, tempos de experiência da câmera, aquisição, etc.)
Minutien PinsFine Science Tools26002-15Para cutucar o furo na cutícula
NRecon Image Reconstruction SoftwareBrukerUsado para reconstruir imagens de seção transversal a partir de imagens de projeção 2D tiradas com geometria de raios-X de feixe cônico
P10 pontas de pipetaGenesee Scientific24-120Montagem de amostras
Tampolado com fosfato SalinoResarch Products InternationalP32060-4000.0Diluir a 1X com água antes de usar Hidrato
ácido fosfotúngsticoSigma-Aldrich79690-25gPara coloração
Suporte de alfinetesFerramentas de Belas Ciências26018-17Para Pins Minutien
Triton X-100Research Products International111036Para remover o revestimento ceroso de moscas adultas (como 0,5% PBST)
Microscópio de Raios-XZeissXradia 520 Geometria deraios-X de feixe cônico Versa com lentes objetivas de placa de zona de Fresnel para Resoluton at a Distance (RaaD™)
https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html de análise de imagem de

Referências

  1. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11(2009).
  2. Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
  3. Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
  4. Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
  5. Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
  6. Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686(2014).
  7. Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144(2014).
  8. Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
  9. Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
  10. Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
  11. Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
  12. Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
  13. Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21(2020).
  14. Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
  15. Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , Springer. 2(2019).
  16. Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612(1984).
  17. Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
  18. Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
  19. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), International Mouse Knockout Consortium 9-13 (2007).
  20. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  21. Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
  22. Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531(2018).
  23. Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898(2019).
  24. Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
  25. Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
  26. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  27. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  28. Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768(2016).
  29. Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380(2016).
  30. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
  31. Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, Pt 1 51-71 (2007).
  32. Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
  33. Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
  34. Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
  35. Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
  36. Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
  37. Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
  38. Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
  39. Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, Pt 4 374-377 (2008).
  40. Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
  41. Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087(2019).
  42. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  43. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
  44. Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
  45. Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. CIBC Seg3D: Volumetric Image Segmentation and Visualization. Scientific Computing and Imaging Institute (SCI). , Available from: http://www.seg3d.org (2016).
  48. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  49. Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
  50. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817(2008).
  51. Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557(2009).
  52. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213(2016).
  53. Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1(2010).
  54. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).
  55. Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6(2007).
  56. Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
  57. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  58. Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
  59. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

An lise Morfom trica 3DVarredura de Raios XSecagem ao Ponto Cr ticoColora o com Solu o de BouinMicroscopia Eletr nicaMicroscopia pticaReconstru o de Imagem

Artigos relacionados