Este manuscrito descreve um protocolo para a vitrificação de volume mínimo de oócitos imaturos de gatos com mídias de laboratório sobre suportes comerciais. Abrange cada passo desde o isolamento oócito desde gônias ex vivo até vitrificação e aquecimento.
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Artigo de método
Vitrificação de Volume Mínimo de Oócitos Felinos Imaturos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nos programas de conservação de animais silvestres, o gamete banking é crucial para salvaguardar os recursos genéticos de indivíduos valiosos e espécies raras e promover a preservação da biodiversidade. Em felids, a maioria das espécies está ameaçada de extinção, e raças domésticas são usadas como modelo para aumentar a eficiência dos protocolos para o banco de germoplasma. Entre as técnicas de criopreservação oócito, a vitrificação é cada vez mais popular na reprodução assistida humana e veterinária. A vitrificação crioto, que foi inicialmente desenvolvida para oócitos e embriões humanos, demonstrou ser adequada para oócitos de gatos. Este método oferece diversas vantagens, como a viabilidade em condições de campo e a velocidade do procedimento, que pode ser útil quando várias amostras precisam ser processadas. No entanto, a eficiência depende fortemente das habilidades do operador, sendo necessária a padronização intra e interseção de laboratório, bem como o treinamento de pessoal. Este protocolo descreve a vitrificação de volume mínimo de oócitos felinos imaturos em um suporte comercial em um protocolo passo a passo amigável ao campo, da coleta de oócitos ao aquecimento. Seguindo o protocolo, preservação da integridade do oócito e viabilidade no aquecimento (até 90%) pode-se esperar, embora ainda haja espaço para melhorias no amadurecimento pós-aquecimento e resultados de desenvolvimento embrionário.
Introdução
A criopreservação tornou-se um passo fundamental das técnicas de reprodução assistida (ARTs). Em humanos, permite a preservação da fertilidade ou adiamento da paternidade por razões médicas ou pessoais. Em animais, é necessário superar a distância e o tempo em acasalamentos planejados, especialmente em animais de fazenda e animais de estimação, ou preservar material genético de indivíduos valiosos em programas de conservação, particularmente em espécies selvagens ameaçadas de extinção. A criopreservação gamete é a melhor escolha quando os indivíduos a serem criados ainda não foram escolhidos ou a fim de evitar questões éticas associadas ao congelamento de embriões, es....
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Protocolo
Os procedimentos por este meio descritos não passaram por aprovação ética, uma vez que os ovários dos gatos foram coletados em clínicas veterinárias como subprodutos da ovariectomia de rotina ou ovariohisterectomia solicitada pelo proprietário.
1. Coleção Oócito
- Antes de iniciar os experimentos, prepare soluções para coleta de ovário e oócito. Prepare a solução de coleta de ovário com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) com uma mistura de antibióticos e antimicóticos (100 UI/mL de sódio penicilina G, 0,1 mg/mL de sulfato de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotônio B). Preparar solução de coleta de oócito (ou seja, PBS/PVA) ....
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Resultados
Seguindo a vitrificação e o aquecimento do oócito do gato de acordo com o presente protocolo (Figura 1 e Figura Suplementar 1), a grande maioria dos gametas sobrevivem. Após a vitrificação, entre outras técnicas, a viabilidade pode ser avaliada no microscópio óptico como integridade morfológica22 ou com o uso de manchas vitais. Um deles é o diacetato/dióceta de fluoresceína/iodeto de propídio (FDA/PI), que permite a identificação de células viáveis (f.......
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Discussão
A criopreservação de oócito é uma técnica crucial de conservação do germoplasma, especialmente em taxas onde muitas espécies estão ameaçadas de extinção, como a família Felidae. Neste manuscrito, foi apresentado um protocolo simples e amigável para a vitrificação de oócitos imaturos de gatos. Os meios de comunicação laboratoriais, suportes mínimos de vitrificação de volume e pessoal treinado são os fatores-chave para o sucesso deste método, o que permite a obtenção de oócitos viáveis de forma consistente e repetida, como.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 e pela Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Também queremos agradecer à Dra.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anfotericina B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Pipetas e pontas automáticas | / | / | Necessário para pipetar 20, 100, 240 e 300 µ L |
| Bisturis cirúrgicos | / | / | Tamanho 10 geralmente está ok |
| Bico de Bunsen | / | / | / |
| Grampos | / | /Alguns | pequenos (grampo de mosquito) para isolamento do ovário, alguns maiores (grampo Klemmer) para trabalhar em nitrogênio líquido |
| Cryotop | Kitazato (distribuidor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distribuidores e número de catálogo podem mudar em diferentes países |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Etilenoglicol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Soro fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Pipetas Glass Pasteur | / | / | Comprimento recomendado 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | De acordo com os recipientes do tanque de armazenamento |
| Estágio de aquecimento | / | / | Todos os estágios de aquecimento estão ok, desde que possam manter 38º C |
| Nitrogênio líquido | / | / | /Meio |
| 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicilina G sódica | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Álcool polivinílico (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Placa | de reproduçãoKitazato (distribuidor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Os distribuidores e o número de catálogo podem mudar em diferentes países |
| Estereomicroscópio | / | / | Desde que o operador possa selecionar os oócitos, outros estereomicroscópios estão ok |
| Tanque de armazenamento | / | / | Qualquer tanque cheio regularmente está ok |
| Sulfato de estreptomicina | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Caixa resistente a isopor/nitrogênio | / | Todas as caixas que podem conter nitrogênio líquido estão ok, desde que o operador esteja confortável. A caixa Kitazato é chamada de "Cooling Rack" | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | Todos os temporizadores que podem ser ajustados em tempos até 9 minutos estão ok |
Referências
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.
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Reimpressões e permissões
