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Artigo de método

Vitrificação de Volume Mínimo de Oócitos Felinos Imaturos

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DOI:

10.3791/61523

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24 de junho de 2020

 , 
1Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare 'Carlo Cantoni', Università degli Studi di Milano

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo para a vitrificação de volume mínimo de oócitos imaturos de gatos com mídias de laboratório sobre suportes comerciais. Abrange cada passo desde o isolamento oócito desde gônias ex vivo até vitrificação e aquecimento.

Resumo

Nos programas de conservação de animais silvestres, o gamete banking é crucial para salvaguardar os recursos genéticos de indivíduos valiosos e espécies raras e promover a preservação da biodiversidade. Em felids, a maioria das espécies está ameaçada de extinção, e raças domésticas são usadas como modelo para aumentar a eficiência dos protocolos para o banco de germoplasma. Entre as técnicas de criopreservação oócito, a vitrificação é cada vez mais popular na reprodução assistida humana e veterinária. A vitrificação crioto, que foi inicialmente desenvolvida para oócitos e embriões humanos, demonstrou ser adequada para oócitos de gatos. Este método oferece diversas vantagens, como a viabilidade em condições de campo e a velocidade do procedimento, que pode ser útil quando várias amostras precisam ser processadas. No entanto, a eficiência depende fortemente das habilidades do operador, sendo necessária a padronização intra e interseção de laboratório, bem como o treinamento de pessoal. Este protocolo descreve a vitrificação de volume mínimo de oócitos felinos imaturos em um suporte comercial em um protocolo passo a passo amigável ao campo, da coleta de oócitos ao aquecimento. Seguindo o protocolo, preservação da integridade do oócito e viabilidade no aquecimento (até 90%) pode-se esperar, embora ainda haja espaço para melhorias no amadurecimento pós-aquecimento e resultados de desenvolvimento embrionário.

Introdução

A criopreservação tornou-se um passo fundamental das técnicas de reprodução assistida (ARTs). Em humanos, permite a preservação da fertilidade ou adiamento da paternidade por razões médicas ou pessoais. Em animais, é necessário superar a distância e o tempo em acasalamentos planejados, especialmente em animais de fazenda e animais de estimação, ou preservar material genético de indivíduos valiosos em programas de conservação, particularmente em espécies selvagens ameaçadas de extinção. A criopreservação gamete é a melhor escolha quando os indivíduos a serem criados ainda não foram escolhidos ou a fim de evitar questões éticas associadas ao congelamento de embriões, especialmente na medicina humana1. Espermatozoides são relativamente fáceis de preservar e dar resultados satisfatórios após o descongelamento, mas os oócitos, devido às suas características estruturais, podem ser mais complexos de armazenar. De fato, a baixa relação superfície/volume, bem como a presença da zona pellucida em torno do ooplasma, limita o movimento dos crioprotetores e da água através da célula2. Além disso, em animais domésticos, incluindo felídeos, eles são caracterizados por um citoplasma rico em lipídios, que é pensado para torná-los mais sensíveis à criopreservação3.

A maioria dos felídeos estão ameaçados, e o gato doméstico é usado como modelo para desenvolver protocolos de preservação de germoplasma graças à disponibilidade de gôndas da ovariectomia de rotina. Em animais selvagens, as gônadas podem ser obtidas após cirurgias eletivas ou (mais frequentemente) pós-mortem, e gametas imaturos (vesícula germinal) podem ser recuperados. A estimulação hormonal destinada à obtenção de oócitos maduros (metafase II) não é tão comum quanto nos ARTs humanos devido às questões éticas e à resposta específica da espécie e individual aos tratamentos4.

Portanto, o desenvolvimento de estratégias de criopreservação tem focado em gametas imaturos, que geralmente podem ser recuperados após a morte inesperada ou súbita de indivíduos raros. Do ponto de vista biológico, há algumas diferenças na criopreservação de gametas imaturos ou maduros, cada um tendo suas vantagens. Em primeiro lugar, o DNA é mais protegido em oócitos imaturos, cuja vesícula germinal contém cromossomos cercados por uma membrana nuclear, enquanto o fuso meiotic de oócitos metafase II poderia ser mais vulnerável aos crioinjuutos5. Em segundo lugar, os danos causados pelo citoesqueleto induzido a frio podem afetar a rotação do fuso, extrusão do corpo polar, migração pronuclear e citocinese, que podem ter diferentes impactos de acordo com a fase de desenvolvimento do oócito, influenciando a progressão da meiose ou eventos pós-fertilização. Finalmente, e talvez o mais importante, enquanto os oócitos maduros estão prontos para serem fertilizados, os gametas imaturos contam com o apoio das células cumulus circundantes para passar pela maturação nuclear e citoplasmática6, e esta é a razão pela qual todos os complexos cumulus-oócitos (COCs) são criopreservados. No entanto, a perda de células cumulus e/ou a perda de conexão funcional entre o gamete e as células somáticas circundantes são provavelmente o efeito mais prejudicial da criopreservação de COCs imaturos.

Entre as técnicas de criopreservação, a vitrificação é uma que pode ser aplicada mais facilmente em condições de campo. Em comparação com o congelamento lento (ou taxa controlada), a vitrificação é mais rápida e não requer equipamentos específicos, como um freezer programável. Para satisfazer os três princípios fundamentais da vitrificação (ou seja, alta viscosidade, ligada à alta concentração crioprotetora, pequenos volumes e diminuição da temperatura ultrarrápida), vários meios de comunicação e suportes têm sido desenvolvidos e usados especialmente em gatos para oócitos imaturos e maduros. Começando com canudossimples 7, os dispositivos foram então desenvolvidos para atingir a meta de "volume mínimo". Cryoloop8, canudos abertos puxados (OPS)9,calhas plásticas (palha modificada)10 e criotubos11 foram utilizados, até que um dispositivo mais eficiente (ou seja, Cryotop) foi empregado11, melhorando a sobrevivência e a retomada da meiase. Cryotop (Figura Suplementar 1) é um suporte comercialmente disponível que se tornou o sistema aberto eletivo para vitrificação. Desenvolvido para a vitrificação de oócitos e embriões humanos, consiste em uma pequena tira de filme presa a um suporte plástico duro, protegido por uma tampa de tubo de plástico durante o armazenamento12. Graças à sua usabilidade e à redução extrema do volume de vitrificação (apenas 0,1 μL), o que também leva a taxas de resfriamento e aquecimento extremamente rápidas, esse suporte de vitrificação tem sido cada vez mais aplicado em várias espécies, incluindo o gato doméstico, no qual tem sido usado com uma variedade de mídia13,14,,15,,16,,17.

O objetivo deste manuscrito é descrever um protocolo de coleta-vitrificação-aquecimento, com pequenas modificações daquela originalmente desenvolvida para oócitos humanos, que emprega mídias de laboratório e suportes comerciais para vitrificação de volume mínimo e pode ser facilmente aplicada em condições de campo para a criopreservação de COCs felinos imaturos.

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Protocolo

Os procedimentos por este meio descritos não passaram por aprovação ética, uma vez que os ovários dos gatos foram coletados em clínicas veterinárias como subprodutos da ovariectomia de rotina ou ovariohisterectomia solicitada pelo proprietário.

1. Coleção Oócito

  1. Antes de iniciar os experimentos, prepare soluções para coleta de ovário e oócito. Prepare a solução de coleta de ovário com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) com uma mistura de antibióticos e antimicóticos (100 UI/mL de sódio penicilina G, 0,1 mg/mL de sulfato de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotônio B). Preparar solução de coleta de oócito (ou seja, PBS/PVA) com PBS com 100 UI/mL de sódio penicilina G, 0,1 mg/mL de sulfato de estreptomicina e 0,1% (w/v) álcool polivinyl (PVA).
  2. Armazene soluções para coleta de ovário e oócito a 4 °C até o uso.
  3. No dia do spaying das rainhas, poucas horas antes de processar as amostras, pegue parte das soluções de coleta de ovário e oócito e deixe-as aquecer à temperatura ambiente (RT; 25 ± 2 °C).
  4. Quando as amostras chegam ao laboratório, isole os ovários do tecido conjuntivo circundante e do oviduto e lave-os em meio de coleta de ovário fresco em uma placa de Petri.
  5. Encha uma placa de Petri de 35 mm para cada rainha com cerca de 3 mL de RT PBS/PVA, e mais uma placa para coletar os oócitos.
  6. Coloque um par de ovários em uma placa de Petri e pique o córtex com um bisturi cirúrgico. Certifique-se de que todos os folículos foram quebrados com a ajuda de um estereomicroscópio (ampliação 8x).
  7. Colete COCs com uma pipeta e mova-os em PBS/PVA fresco na placa de Petri alocada. Selecione cocs de boas qualidades, com um citoplasma vergestêm e escuro e cercado por várias camadas compactas de células cumulus (grau I18).

2. Vitrificação

  1. Prepare os meios de equilíbrio e vitrificação.
    1. Prepare a solução de equilíbrio (ES) com 7,5% (v/v) glicol de etileno (EG) e 7,5% (v/v) dimetilsulphoxida (DMSO) em Médio 199, com 20% de soro bovino fetal (FBS).
    2. Prepare a solução de vitrificação (VS) com 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO e 0,5 M de sacarose no Medium 199, com 20% de FBS (modificado a partir de 19).
    3. Deixe o ES e o VS aquecer em RT antes de usar.
      NOTA: Os crioprotetores (por exemplo, EG, DMSO) são conhecidos por serem citotóxicos. Uma estratégia para combater sua toxicidade é reduzir a temperatura em que as células são expostas a elas20, e os oócitos são geralmente expostos a crioprotetores em RT. Assim, todo o procedimento, desde a coleta de oócito até a vitrificação, é realizado na RT neste protocolo para evitar flutuações de temperatura.
  2. Prepare o prato de vitrificação (ou seja, um prato especial composto por seis poços cônicos divididos em duas linhas, conhecidos como "placa repro"). Prepare uma linha (três poços) para cada suporte de vitrificação.
    1. Adicione 20 μL de ES na parte inferior do primeiro poço.
    2. Adicione 300 μL de VS na parte inferior do segundo (ou seja, 1VS) e terceiro (ou seja, 2VS).
  3. CoCs de equilíbrio em ES.
    1. Com uma pipeta de furo pequeno (por exemplo, uma pipeta Pasteur puxada em um bico bunsen para torná-lo mais fino – diâmetro deve ser de pelo menos 200 μm), transferir um (ou mais) COC(s) na parte inferior do primeiro poço.
      NOTA: Escolha o tamanho da pipeta de acordo com o número de camadas de células cumulus ao redor dos oócitos, de modo às dimensões dos COCs, visando reduzir o máximo possível o volume de mídia que é transferido com COCs em cada etapa. Com o protocolo atual, os operadores treinados podem vitrify com sucesso até oito COCs felinos por cada suporte de vitrificação.
    2. Adicione lentamente 20 μL de ES na borda da queda. Espere por 3 minutos.
    3. Adicione lentamente outros 20 μL de ES na borda da queda. Espere por 3 minutos.
    4. Adicione lentamente 240 μL de ES na borda da queda. Espere por 9 minutos.
    5. Enquanto espera, prepare uma caixa com nitrogênio líquido (LN2),rotule um suporte de vitrificação com o código de identificação de experimento/gato e deixe-o aberto. Coloque ambos perto do estereóscópio, para que possam ser facilmente alcançáveis durante o trabalho.
      Cuidado! Use equipamentos de proteção individual ao manusear LN2.
    6. Alternativamente, se vários COCs tiverem que ser vitrificados, inicie a primeira etapa de equilíbrio (ver passo 2.3.1 - 2.3.2) para outro grupo de COCs (que será carregado em um novo suporte de vitrificação).
  4. CoCs vitrify em VS em menos de 90 segundos.
    1. Usando a mesma pipeta de furo pequeno, preencha-a com 1VS, pegue os COCs da parte inferior do primeiro poço (ES) e mova-os para a superfície do segundo poço (1VS).
    2. Lave a pipeta com 1VS.
    3. Pegue os COCs e mova-os em outra área (na parte inferior) do poço; misturar o meio ao seu redor com a pipeta.
    4. Encha a pipeta com 1VS em outra área do poço, pegue os COCs, mova-os e misture o meio ao seu redor com a pipeta.
    5. Repita o passo 2.4.4.
    6. Lave a pipeta com 2VS.
    7. Pegue os COCs e mova-os para o fundo do terceiro poço (2VS); misturar o meio ao seu redor com a pipeta.
    8. Encha a pipeta com 2VS em outra área do poço, pegue os COCs, mova-os e misture o meio ao seu redor com a pipeta.
    9. Repita o passo 2.4.8.
    10. Encha a pipeta com 2VS em outra área do poço, pegue os COCs e carregue-os na faixa do suporte de vitrificação, o mais perto possível da ponta. Aspirar o excesso médio para reduzir o volume de VS tanto quanto possível.
    11. Mergulhe imediatamente o suporte de vitrificação na LN2,movendo-a. Feche-o com a ajuda de alguns grampos, certificando-se de que ele sempre permanece imerso na LN2.
      NOTA: Manter o tempo certo é crucial devido à toxicidade celular crioprotetora. Devido à sua alta concentração nos meios de vitrificação, a exposição celular precisa ser controlada, também pela execução impecável da técnica21. Se as amostras forem abundantes, considere dividi-las para processá-las mais rapidamente e minimizar a quantidade de tempo desde a coleta de oócito até a vitrificação.
  5. Armazene os suportes de vitrificação carregados em um cálice e mantenha-os em um tanque LN2 de armazenamento até o aquecimento.
    NOTA: Todas as etapas anteriores do protocolo também podem ser aplicadas em condições de campo se a LN2 estiver disponível. Um navio seco será necessário para transportar as amostras para o laboratório com segurança e, em seguida, prosseguir lá com as seguintes fases.

3. Aquecimento

  1. Prepare a mídia de aquecimento.
    1. Prepare a solução de descongelamento (TS) com 1 M de sacarose no Medium 199, com 20% de FBS.
    2. Prepare a solução de diluição (DS) com sacarose de 0,5 M no Médio 199, com 20% de FBS.
    3. Prepare a solução de lavagem (WS) com o Medium 199 com 20% de FBS.
    4. Antes de usar, aqueça TS a 38 °C e DS e WS na RT.
  2. Se necessário, prepare o meio de cultura para o uso subsequente de COCs aquecidos (por exemplo, maturação in vitro, IVM).
  3. Coloque o estágio de aquecimento perto do estereóscópio e ligue-o (38 °C). Coloque a tampa de uma placa de Petri para aquecer.
  4. Quando tudo estiver pronto, transfira os suportes de vitrificação que devem ser aquecidos do tanque de armazenamento para uma caixa com LN2, e coloque a caixa perto do estereóscópio.
  5. Prepare a "placa Repro". Prepare uma linha para cada suporte de vitrificação que tem que ser aquecido.
    1. Adicione 300 μL de DS na parte inferior do primeiro poço.
    2. Adicione 300 μL de WS na parte inferior do segundo (ou seja, 1WS) e terceiro (ou seja, 2WS).
  6. Faça uma gota de TS (100 μL) na tampa da placa de Petri.
  7. Com grampos, abra um suporte de vitrificação na LN2.
  8. Coloque a gota TS sob o estereótipo e com um movimento rápido pegue o suporte de vitrificação da LN2 e mergulhe sua tira na gota, movendo-a até que todos os COCs se desprendem. Remova o suporte da queda assim que estiver vazio, mas deixe os COCs em TS por 1 minuto no total (da imersão até a etapa seguinte).
  9. Pegue uma pipeta semelhante à usada para vitrificação e preencha-a com DS. Pegue os COCs da gota (TS) e mova-os para o fundo do primeiro poço (DS). Espere por 3 minutos.
  10. Lave a pipeta com 1WS. Pegue os COCs e mova-os para o fundo do segundo poço (1WS). Espere por 5 minutos.
  11. Lave a pipeta com 2WS. Pegue os COCs e mova-os na superfície do terceiro poço (2WS). Espere que eles toquem no fundo do poço.
  12. Repita o passo 3.11 usando outra área do poço.
  13. Lave a pipeta com meio de cultura e mova os oócitos para o prato de cultura para o seguinte uso (por exemplo, IVM).

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Resultados

Seguindo a vitrificação e o aquecimento do oócito do gato de acordo com o presente protocolo (Figura 1 e Figura Suplementar 1), a grande maioria dos gametas sobrevivem. Após a vitrificação, entre outras técnicas, a viabilidade pode ser avaliada no microscópio óptico como integridade morfológica22 ou com o uso de manchas vitais. Um deles é o diacetato/dióceta de fluoresceína/iodeto de propídio (FDA/PI), que permite a identificação de células viáveis (f...

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Discussão

A criopreservação de oócito é uma técnica crucial de conservação do germoplasma, especialmente em taxas onde muitas espécies estão ameaçadas de extinção, como a família Felidae. Neste manuscrito, foi apresentado um protocolo simples e amigável para a vitrificação de oócitos imaturos de gatos. Os meios de comunicação laboratoriais, suportes mínimos de vitrificação de volume e pessoal treinado são os fatores-chave para o sucesso deste método, o que permite a obtenção de oócitos viáveis de forma consistente e repetida, como...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado pela EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 e pela Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Também queremos agradecer à Dra.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anfotericina BSigma-AldrichA2942/
Pipetas e pontas automáticas//Necessário para pipetar 20, 100, 240 e 300 µ L
Bisturis cirúrgicos//Tamanho 10 geralmente está ok
Bico de Bunsen///
Grampos//Algunspequenos (grampo de mosquito) para isolamento do ovário, alguns maiores (grampo Klemmer) para trabalhar em nitrogênio líquido
CryotopKitazato (distribuidor: MBT - Medical Biological Technologies)01.CRDistribuidores e número de catálogo podem mudar em diferentes países
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650/
Etilenoglicol (EG)Sigma-AldrichE9129/
Soro fetal bovino (FBS)Sigma-AldrichF9665/
Pipetas Glass Pasteur//Comprimento recomendado 230 mm (100+130)
Gobelets//De acordo com os recipientes do tanque de armazenamento
Estágio de aquecimento//Todos os estágios de aquecimento estão ok, desde que possam manter 38º C
Nitrogênio líquido///Meio
199Sigma-AldrichM4530/
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Sigma-AldrichD8662/
Penicilina G sódicaSigma-AldrichP3032/
Álcool polivinílico (PVA)Sigma-AldrichP8136/
Placade reproduçãoKitazato (distribuidor: MBT - Medical Biological Technologies)01.K-2Os distribuidores e o número de catálogo podem mudar em diferentes países
Estereomicroscópio//Desde que o operador possa selecionar os oócitos, outros estereomicroscópios estão ok
Tanque de armazenamento//Qualquer tanque cheio regularmente está ok
Sulfato de estreptomicinaSigma-AldrichS9137/
Caixa resistente a isopor/nitrogênio/Todas as caixas que podem conter nitrogênio líquido estão ok, desde que o operador esteja confortável. A caixa Kitazato é chamada de "Cooling Rack"
SucroseSigma-AldrichS1888/
Timers//Todos os temporizadores que podem ser ajustados em tempos até 9 minutos estão ok
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Referências

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