Artigo de método

Um ensaio de migração de arranhões econômico e adaptável

DOI:

10.3791/61527

⸱

30 de junho de 2020

 , 
1Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um método econômico para o ensaio de migração de arranhões que fornece uma nova abordagem para determinar a migração celular sem o uso de métodos intensivos em equipamentos. Embora os fibroblastos tenham sido usados neste protocolo, ele pode ser adaptado e utilizado para estudar tipos e influências adicionais de células na migração celular.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A migração celular é um componente-chave em eventos fisiológicos e patológicos. A migração celular normal é necessária para funções essenciais, como o desenvolvimento e a montagem de uma resposta imune. Quando ocorre um defeito ou alteração com o processo de migração celular, ele pode ter desfechos prejudiciais (ou seja, metástase do câncer, cicatrização de feridas e formação de cicatrizes). Devido à importância da migração celular, é necessário ter acesso a um ensaio de migração celular acessível, adaptável e repetível. Utilizando o ensaio comum de migração de arranhões, desenvolvemos uma nova abordagem para analisar a migração celular que utiliza equipamentos de laboratório gerais. O método descrito utiliza marcadores visuais que permitem a recapturação de áreas específicas de interesse sem o uso de microscopia de lapso de tempo. Além disso, proporciona flexibilidade no design experimental, desde a alteração do substrato da matriz migratória até a adição de modificadores farmacológicos. Além disso, este protocolo descreve uma forma de explicar a área de migração celular, que não é considerada por vários métodos ao examinar a migração celular. Esta nova abordagem oferece um ensaio de migração de arranhões para um público maior e proporcionará maior oportunidade para os pesquisadores examinarem o impacto fisiológico e fisiofisiológico da migração celular.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A migração celular é crucial para muitos eventos fisiológicos e patológicos. É necessário durante o desenvolvimento, para a montagem de uma resposta imune, e para a cicatrização adequada da ferida1,2,3. Muitos desses eventos de migração celular podem ser desencadeados por sinais físicos ou químicos. Por exemplo, durante uma resposta imune, os leucócitos migrarão para um local de lesão em resposta a um quimioattractant2. Além disso, os leucócitos também liberarão citocinas para induzir a migração de células imunes adicionais, bem como outros tipos de cé....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultura geral de células

  1. Fibroblastos cardíacos de cultura no Meio de Águias Modificadas (DMEM) de Dulbecco contendo 1 g/L de glicose, Piruvato de sódio, L-glutamina, e suplementado com 14,2 mM NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% de soro bovino fetal inativado térmico (FBS), 2% L-glutamina e 0,02% reagente antimicrobiano (ver Tabela de Materiais) e mantido na incubadora CO2 a 37 °C.
  2. Fibroblastos cardíacos de cultura até 90-95% de confluência é alcançado na passagem 0 (P0). Neste ponto, os fibroblastos estão prontos para serem divididos em uma placa de 48 poços, que é usada para o ensaio de migração.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este procedimento documenta uma nova abordagem para estudar a migração celular que é ao mesmo tempo econômica e facilmente adaptável para a maioria dos laboratórios. Muitos estudos têm usado microscopia de lapso de tempo para avaliar a migração celular, mas o equipamento necessário para este método não está prontamente disponível para muitos laboratórios. Considerando que a utilização de linhas e traços para demarcação permite a capacidade de recapturar áreas específicas de interesse em diferentes pontos de tempo sem o u.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Essa nova abordagem do ensaio de migração de arranhões fornece um método mais acessível para os pesquisadores examinarem as mudanças na migração celular. Embora este ensaio siga o mesmo procedimento para administrar um arranhão semelhante a outros ensaios de risco, ele fornece um novo método para imagem e análise precisa da migração celular10. Em vez de usar métodos intensivos em equipamentos de microscopia de lapso de tempo e câmaras de imagem de células vivas, este método detalha o uso de equipa.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho é apoiado pelo Prêmio de Pesquisa Médica do Exército dos EUA #81XWH-16-1-0710, pela Faculdade de Farmácia da Universidade do Mississipi e pelo Departamento de Ciências Biomoleculares.

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Adobe Todos os AplicativosAdobeIsso inclui Adobe photoshop que é o software de imagem usado com este protocolo
Pontas de Pipeta Avant 200ul Encadernação não estérilMIDSCIAVR1As pontas são autoclavadas para esterilizar a
câmera AxioCam Erc 5sZeiss426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250Fisher ScientificBP101-25
Placas de Cultura de Células de Fundo Plano Costar 48 WellsFisher Scientific07-200-86
DMEM com L-Glutamina, 1g/L de glicose e piruvato de sódioFisher ScientificMT10014CM
Image JNIHEste é um software gratuito oferecido pelo governo dos EUA e é o software de análise usado com este protocolo
ParaformaldeídoFisher ScientificAC416785000
Soro fetal bovino de origem americana premiumInnovative ResearchIFBS-HU
PrimocinInvivoGENant-pm-2Este é o antimicrobiano usado com este procotol para cultura de fibroblastos cardíacos
Microscópio Zeiss PrimovertZeiss491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 softwareZeiss software vemcom compra de câmera

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
  2. Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
  3. Yahata, Y., et al.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

An lise de Migra o CelularFibroblastos Card acosPrepara o de Placa de Migra oMicroscopia InvertidaSoftware de An lise de ImagemQuantifica o com PhotoshopMedi o da rea de Migra oModificadores Farmacol gicosMeio com Baixo Teor de Soro

Artigos relacionados